2. rész: A Verbascoside védi a hasnyálmirigy sejtjeit az ER-stressz ellen
Mar 05, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plusz , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 és Carla Perego 1,*
Pls Kattintson ide vissza az 1. részhez
3.4 Verbascoside modulálja a sejtek mitokondriális aktivitását és dinamikáját
Az MTT életképességi tesztek arra utalnak, hogy averbascosideközvetlenül a mitokondriumokon, amely biztosítja az inzulinszekréció kapcsolódását a tápláltsági állapothoz és a sejt túlélését ebben a sejttípusban. Az alak és a membránpotenciál a mitokondriális egészség markerei [42]. Először a mitokondriális membránpotenciált értékeltük úgy, hogy a sejteket MitoSpyw Orange CMTMRos-szal jelöltük meg, egy permeábilis festékkel, amelynek koncentrációja a belső mitokondriális membránpotenciáltól függ, míg a MitoSpyw Green FM-et használtuk az adatok mitokondriális tömegére való normalizálására (4A, B ábra). A mitokondriumok membránpotenciáljaverbascoside-kezelt sejtek száma megnövekedett a kontrollhoz képest mind a bazális, mind a stressz körülmények között. Érdekes módon,verbascosidemetabolitok különböző hatásokat fejtettek ki. A cafe sav nem javította a mitokondriális potenciált, míg a hidroxitirozol a mitokondriális funkció dózisfüggő károsodását okozta, a sejtek életképességére vonatkozó adatokkal összhangban ez a hatás nyilvánvalóbb volt H2O2 expozíció után (S3 ábra).
Mivel a funkció szorosan összefügg a morfológiával, megmértük a Feret átmérőjét, területét és a mitokondriumok körkörösségét. Az akut oxidatív stressz elősegíti a kiterjedt mitokondriális hasadást, ezáltal kisebb, körkörös mitokondriumokat eredményez [42]. H2O2 stressz körülmények között a verbaszkoziddal kezelt sejtek mitokondriumai megnyúltak, és nagyobb felületet mutattak, mint a kontrollsejtek (4C, D és S4 ábra). A mitokondriális cirkularitás alacsonyabb volt a verbaszkoziddal kezelt sejtekben, mint a kontrollokban, és a különbségek nyilvánvalóbbak a H2O2-val kezelt sejtekben (S3. ábra), ami ismét megerősíti a polifenol védő szerepét.
Ezen organellumok azon képessége, hogy módosítsák alakjukat a táplálkozási állapotokra vagy stresszes körülményekre adott válaszként, a fúziós és hasadási események irányítása alatt állnak, és mitokondriális mozgékonyságot igényel [39]. A mitokondriumok mozgásának nyomon követése alapján kiszámítottuk a megtett kumulatív távolságot, és az elemzés azt mutatta, hogy a verbaszkoziddal kezelt sejtekben a mitokondriumok dinamikája szignifikáns növekedést mutatott a kontrollhoz képest, már alap körülmények között (4E. ábra, F ábra és S1–S4 videók). A hatás kifejezettebb volt a H2O2 kezelés után, sőt, a verbaszkozid előkezelés szinte teljesen visszafordította az oxidatív stressz hatását a mitokondriális dinamikára.
Összességében ezek az adatok erősen alátámasztják a verbaszkozid kulcsfontosságú szerepét a mitokondriumok dinamikájának biztosításában, ami elengedhetetlen ahhoz, hogy elősegítse ennek az organellumnak a stresszes körülményekhez való gyors alkalmazkodását.
3.5 Verbascoside hatása a Langerhans-féle ember túlélésére és működésére
Figyelembe véve a fordítási potenciáltverbascosideAz emberi egészségben való alkalmazását igazoltuk a Langerhans emberi izolált szigeteire gyakorolt hatását, amely egy relevánsabb modell a sejteken végzett fiziopatológiai és farmakológiai vizsgálatokhoz. Az izolált szigetecskéket 16 µM verbaszkoziddal kezeltük 5 napon keresztül, és értékeltük a mitokondriális membránpotenciált. Amint az 5A. ábrán látható, míg a H2O2-expozíciót követően az emberi kontroll szigeteken az organellum-potenciál veszélyeztetett volt, a mitokondriumok belső membránpotenciálja a verbaszkoziddal előkezelt szigetecskékben nem csökkent szignifikánsan, ami alátámasztja a verbaszkozid ROS-indukálta védő szerepére vonatkozó hipotézist. sejt diszfunkció. Az ER-stressz markerek expressziójának analízise a P-eIF2 frakció jelentős csökkenését mutatta a két különálló szigetpreparátumban, amelyeket 16 µM verbaszkozidban tartottak fenn, ami megerősíti ennek az útvonalnak a leszabályozását humán mintákban is (5D ábra). A polifenol kezelés jótékony hatásait megerősítette a verbaszkoziddal kezelt szigeteken megfigyelt megnövekedett inzulintartalom a kontrollokhoz képest (5B. ábra). Kísérleteinkben az adatok szórása nem tette lehetővé a glükóz-stimulált inzulin szekréció (GSIS) szignifikáns különbségének kimutatását a verbaszkoziddal kezelt szigetecskékben, bár a pozitív tendencia nyilvánvalónak tűnik mind a bazális, mind a stressz körülmények között (5C. ábra).
4. Megbeszélés
Az oxidatív stressz és a gyulladás a T2D során fellépő sejtműködési zavarok alapja [43,44], mint olyan, a funkcionális élelmiszereket, a tápanyagokat és a fitokemikáliákat a 2-es típusú cukorbetegség megelőzésének eszközeként vizsgálták [45]. Ebben a munkában a verbaszkozidra összpontosítottunk, amelyről ismert, hogy gyulladásgátló és antioxidáns hatást fejt ki az idegsejtekben [18]. A nagy szerkezeti összetettség ellenére verbaszkozidot és izoverbakozidot találtak a Lippia citriodora kivonattal és egyes metabolitokkal etetett patkányok vérplazmájában [20]. Ezenkívül a verbaszkozid és verbaszkozid sejtfelhalmozódását kimutatták az SKBR3 mellrák sejtvonalban [23], és a Caco-2 sejtekkel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy mérsékelt mennyiségű verbaszkozid és izoverbaszkozid érintetlen és biológiailag hozzáférhető marad az in vitro emésztés után. folyamat. Ezenkívül a Caco-2 mindkét molekulát képes felvenni egy gyors és lineáris transzport révén 10-100 uM tartományban [22]. Nem számoltak be adatok a verbaszkozid humán biohasznosulásáról, de a fent említett vizsgálatok azt sugallják, hogy lehetséges lehet, hogy a nem metabolizálódó verbaszkozid átjut a bélgáton, kering a vérplazmában, és antioxidáns hatást fejt ki az endokrin sejtekre. hasnyálmirigy.
Megállapítottuk, hogy a verbaszkozid dózisfüggő (0,8-16 uM) védő szerepet játszik klonális és humán -sejteken, mind bazális, mind stressz körülmények között. Ez a hatás magának a verbaszkozidnak köszönhető, nem pedig metabolitjainak, a koffeinsavnak és a hidroxi-tirozolnak, amelyek 16 uM koncentrációban valójában citotoxikusnak tűnnek. A kísérleteinkben hatásosnak bizonyult koncentrációk összhangban vannak a verbaszkoziddal etetett állatoknál leírtakkal [20].
Bár nem tudjuk, hogy a verbaszkozid extracellulárisan hat-e egy membránreceptorhoz kötődve, vagy az endocitózis által internalizálódik-e, és intracellulárisan fejti ki hatását, adataink megerősítik, hogy a verbaszkozid antioxidáns és gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkezik, és megvédi a sejteket az ER-stresszhez kapcsolódó diszfunkciókkal szemben azáltal, hogy csökkenti a UPR és a mitokondriális dinamika elősegítése.
Valójában a ROS-tartalom jelentős csökkenését észleltük a verbaszkoziddal kezelt sejtekben, amit tovább erősít a lipidperoxidáció HNE és akrolein expresszióval mért csökkenése. A legtöbb növényi polifenoltól eltérően a verbaszkozid ROS-megkötő aktivitása elsősorban közvetett (a ROS-t eltávolító enzimek felszabályozásán keresztül), nem pedig direkt útvonalakat követ. Valójában fokozza egyes antioxidáns enzimek géntranszkripcióját az Nrf2 (NF-E2-rokon 2-es faktor) útvonal aktiválása és az AhR (aril szénhidrogén receptor) függő mechanizmusa révén [24,29]. Mint ilyen, a SOD1 fokozott expresszióját találtuk verbaszkoziddal kezelt sejtekben.
A ROS homeosztázis rendkívül fontos a sejtpatológiában. Az antioxidáns enzimek hiánya miatt a megnövekedett ROS termelést nem lehet semlegesíteni, és az ER stresszt elősegítő fehérje misfolding indukálódik. Az ER stressz az UPR aktiválása révén az inzulin transzkripció és transzláció csökkenéséhez vezet [44,46]. Ennek az útvonalnak a fő célja az ER funkció helyreállítása a génexpresszió átprogramozása révén, azonban túlstimulálva apoptózist vált ki. Adataink azt sugallják, hogy a verbaszkozid fontos tevékenysége az UPR mérséklése, lehetővé téve az ER diszfunkció javításához szükséges módosításokat anélkül, hogy apoptózist okozna. E lehetőség szerint a BIP, HSP70 és PERK fehérjék expressziója csökkent a verbaszkoziddal kezelt sejtekben, és a PERK útvonal aktivációja gyengült a tunicamycin által kiváltott ER stressz hatására. Hasonló hatásról számoltak be a tirozol esetében az insulinoma NIT-1 sejtvonalban [47].
Különösen érdekes a verbascoside azon képessége, hogy modulálja az UPR PERK ágának aktiválását. A -sejtekben ez az út szükséges a bazális szekréciós homeosztázis fenntartásához és a -sejtek túléléséhez, és cukorbetegségben súlyosan deregulált [41,48]. Még érdekesebb, hogy a PERK gyakori változatai hozzájárulnak a prediabétesz kockázatához, és a PERK-t kódoló EIF2AK3 gén recesszív mutációi alapozzák meg a Wolcott–Rallison-szindrómára való érzékenységet, amelyet állandó újszülöttkori inzulinfüggő cukorbetegség jellemez [49,50].
Verbaszkozid jelenlétében az IKB -NFKB gyulladásos út downregulációját is kimutattuk rendszerünkben. Az NFKB képviseli a fő gyulladásos útvonalat a sejtekben, és tartós aktivációja események sorozatát indítja el, amely a sejthalálhoz vezet. Stresszes sejtekben az NFKB expresszió csökkenése megvédi a hasnyálmirigy sejteket a diabetogén ágensektől [27,51], tovább támasztva a verbaszkozid alkalmazását a cukorbetegség megelőzésében. Érdekes módon a PERK jelátvitel aktiválja az NFR2 (a redox homeosztázisban szerepet játszó) és az NFKB transzkripciós faktorokat, ezzel magyarázva a verbaszkozid antioxidáns és gyulladásgátló hatását [40,52].
Adataink azt is feltárják, hogy a verbaszkozid fontos szerepet játszik a mitokondriális aktivitásban és dinamikában.
A mitokondriális működési minőség jelzője a dinamika, egy olyan folyamat, amelyet a fúziós és hasadási események összehangolt ciklusai jellemeznek, amelyek szabályozzák a mitokondriálisok számát, eloszlását, morfológiáját és membránpotenciálját [39]. Ezzel a lehetőséggel összhangban a verbaszkozid javítja a tc3 mitokondriális membránpotenciálját mind bazális, mind stressz körülmények között. A hatás ismét a verbaszkozidnak köszönhető, nem pedig metabolitjainak, mivel a koffeinsav nem javítja a mitokondriális működést, a hidroxitirozol pedig jelentősen csökkenti az organellum potenciálját. A mitokondriális mozgások nyomon követésével megnövekedett mitokondriális dinamika és morfológiájuk változása volt megfigyelhető, ami arra utal, hogy a verbaszkozid elősegíti a mitomorfózis programot. A sejtes mitokondriális hálózat átformálódása hatással van a légzési lánc szuperkomplexeinek összeállítására, így nemcsak a sejtek anyagcseréje, hanem redox állapota is megváltozik, és a sejtek jobban ellensúlyozhatják az oxidatív stresszt és a gyulladást [5,37,39].
Bár a molekuláris mechanizmus még nem ismert, feltételezhetjük, hogy a verbaszkozid a többi polifenolhoz hasonlóan védi a mitokondriális DNS-t azáltal, hogy csökkenti a ROS-koncentrációt [53], és megakadályozza a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusainak megnyílását [54], biztosítva a fiziológiás mitokondriális aktivitást. Egy másik érdekes lehetőség az, hogy a mitokondriumok dinamikájának és aktivitásának módosulását ismét a verbaszkozidnak az UPR-re gyakorolt hatása közvetíti. Valójában a mitokondriális területen végzett legújabb kutatások azt mutatják, hogy az ER-mitokondriumok kölcsönhatási helyei kulcsszerepet játszanak a mitokondriális dinamika és aktivitás szabályozásában az oxidatív stresszre adott válaszként, és a PERK is részt vesz a jelenségben [55]. A legtöbb polifenolokkal végzett in vitro vizsgálatot gyakran daganatos eredetű sejtvonalakon végezték, amelyek anyagcseréjük és ROS-termelésük tekintetében különböznek az eredeti sejtektől. Bizonyítékot nyújtunk arra vonatkozóan, hogy a verbaszkozid védő hatást fejt ki az emberi izolált Langerhans-szigetekre is, amelyek a cukorbetegségben történő beavatkozás végső célpontjai. Érdekes módon a polifenol már alap körülmények között is mérsékli a PERK jelátviteli aktiválódást, így növeli az inzulintartalmat és megelőzi az oxidatív stressz által közvetített mitokondriális diszfunkciókat. Azt még tisztázni kell, hogy az inzulintartalomra gyakorolt polifenolhatás tükrözi-e a vegyület azon képességét, hogy megakadályozza a sejthalált, mérsékelje az ER stresszt vagy közvetlenül szabályozza az inzulin génexpresszióját, amint azt más polifenolos vegyületek esetében is kimutatták [56]. Ezek az adatok különösen fontosak, figyelembe véve a verbaszkozid lehetséges kiegészítő terápiaként történő alkalmazását a cukorbetegség kezelésében.
5. Következtetések
Az itt közölt klonális és humán sejtekkel végzett in vitro vizsgálatok azt mutatják, hogy a verbaszkozid védő hatást fejt ki az ER-stresszhez kapcsolódó diszfunkciókkal szemben, enyhíti az UPR PERK ágának aktiválódását és javítja a mitokondriumok dinamikáját. Mivel az ER homeosztázis megzavarása a sejtek károsodását és a cukorbetegséget váltja ki, ezek az adatok okot adnak a verbaszkozid lehetséges tápanyagként való alkalmazására a betegségek megelőzésében és kezelésében. A verbaszkozid hatékony klinikai alkalmazásához azonban számos kérdést meg kell oldani. A rengeteg laboratóriumi vizsgálat ellenére a verbaszkozid in vivo egészségügyi hatásait megerősítő megbízható klinikai vizsgálatok korlátozottak. Ezenkívül stabilitásának és biológiai hozzáférhetőségének növelése kötelező ennek a vegyületnek az emberi egészségben való jövőbeni alkalmazásához. Ebből a szempontból a verbaszkozid egy érdekes molekula, mert vázának különböző reaktív helyei vannak, amelyeket kombinációs kémia módosíthat. Arra számítunk, hogy az ezekből a vizsgálatokból származó információk utakat nyitnak az oxidatív stressz és a kóros állapotok gyulladásának terápiás modulálására természetes vegyületek felhasználásával.
Kiegészítő anyagok: A következők online érhetők el a http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1 címen. S1 ábra: A koffeinsav és a hidroxitirozol hatása a sejtek életképességére. S2 ábra: A verbaszkozid hatása a tunicamycin által kiváltott ER stresszre. S3 ábra: A koffeinsav és a hidroxitirozol hatása a mitokondriális membránpotenciálra. S4 ábra: A mitokondriumok kvantitatív képelemzése koffeinsavval és hidroxitiroszollal kezelt sejtekben. Videó S1, S2 Videók: A mitokondrium dinamikáját alapkörülmények között, verbaszkozid hiányában (S1) vagy jelenlétében (S2) rögzítettük. Videó S3, S4: Mitokondriumdinamika oxidatív stressz körülmények között, verbaszkozid hiányában (S3) vagy jelenlétében (S4).
A szerző közreműködése: Conceptualization, AG, PM és CP; adatkezelés, AG és PM; formális elemzés, AG és PM; finanszírozás megszerzése, CP; nyomozás, MC; módszertan, AM és SG; források, FB, RR és ADG; felügyelet, CP; érvényesítés, AM, SG és MC; vizualizáció, AG és AM; írás – eredeti tervezet, AG; írás – áttekintés és szerkesztés, PM, AM, FB, RR, ADG, MC és CP Minden szerző elolvasta és beleegyezett a kézirat közzétett változatába.
Finanszírozás: Ez a kutatás nem kapott külső támogatást.
Köszönetnyilvánítás: Szeretnénk köszönetet mondani Carlo Corinónak és Mario Dell'Aglinak a reagensekért és a hasznos beszélgetésért.
Összeférhetetlenség: A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.
Hivatkozások
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: A cukorbetegség prevalenciájának globális becslései 2017-re és előrejelzések 2045-re. Diabetes Res. Clin. Gyakorlat. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabetes a válaszúton: A betegségek osztályozásának jelentősége a patofiziológiában és a kezelésben. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. A szisztémás inzulinfunkció sejtbiológiája. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Koleszterin anyagcsere, hasnyálmirigy-sejtek működése és cukorbetegség. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Basis Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Algéria, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. A hasnyálmirigy-sejtek differenciációjának és működésének alakítása: A mechanotranszdukció hatása. Cells 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes mellitus és a sejt: Az elmúlt tíz év. Cell 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ÉN; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Csökkentett inzulin exocitózis az emberi hasnyálmirigy-sejtekben a 2-es típusú cukorbetegséghez kapcsolódó génvariánsokkal. Diabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Az inzulinszekréció dinamikája elhízásban és cukorbetegségben. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, GI A 2-es típusú cukorbetegség integratív biológiája. Természet 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
