Az echinacoside védő hatása a diabéteszes nefropátiára

Kapcsolattartó: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Az echinacoside védőhatásai a vesefunkcióra, a vese szövetére és a mesangiális sejtkárosodásra diabéteszes nefropátiában szenvedő patkányoknál

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Elvont:

Célkitűzés Feltárni a védőhatástechinacoside(ECH) a veseműködési zavarról, a kórszövettanról és a mesangiális sejtkárosodásrólcukorbetegnephropathia(DN) patkányok és mechanizmusa. Módszerek Hatvan SD patkányt véletlenszerűen osztottak kontrollcsoportra, modellcsoportra, ECH -re (echinacoside) csoport(nagy, közepes és alacsony dózisú ECH (echinacoside),100,50, 20 mg·kg'·d') és lozartán káliumcsoport (lozartán kálium,16 mg·kg'·d'), 10 patkány minden csoportban. Az ECH (echinacoside) csoportot és a lozartán káliumcsoportot magas zsírtartalmú és magas cukortartalmú étrenddel tápláltuk, és intraperitoneálisan sztreptocint (40 mg·kg"') fecskendeztünk be a DN patkánymodellek létrehozásához. 2 hetes kezelés után testtömeget, 24 órás vízbevitelt és patkányok vizeletmennyiségét rögzítették. Meghatároztuk az éhgyomri vércukorszint, a szérum kreatinin, a karbamid-nitrogén, a vizelet mikroproteinje, a hialuronsav (HA), a szöveti metalloproteináz inhibitor-1 (TIMP-1) és a laminin (LN) tartalmát. HE festést és TUNEL festést végeztünk a vese szövetében bekövetkező kóros változások megfigyelésére. RT-PCR-t végeztünk a B-sejtes limfóma (Bcl-2), a Bcl2-hez kapcsolódó X fehérje (Bax), a Kaszpáz-3 mRNS expressziójának kimutatására. A Wester Blot-ot az érrendszeri sejtek adhéziós molekula-1 (VCAM-1), a transzformáló növekedési faktor (TGF-β), a α-simaizom aktin (α-SMA) expressziós szintjének meghatározására végeztük. Eredmények A kontrollcsoporthoz képest a modellcsoport testsúlya jelentősen csökkent(P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">echinacoside) csoport, nagy dózisú ECH (echinacoside) csoport és a lozartán káliumcsoport(P)<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">echinacoside)képes megvédeni a vese szövetkárosodását és javítani a DN patkányok veseműködését azáltal, hogy gátolja a TGF-β és a VCAM-1 fehérje expresszióját, valamint gátolja a vese intersticiális fibrózisát és a vesesejtes apoptózist.

Kulcsszavak:Cistanches herba;Echinacoside;cukorbetegnephropathia; vese intersticiális fibrózis; apoptózis; Francba

cistanche echinacoside kezeli a diabéteszes nefropátiát

Bevezetés

Cukorbeteg nephropathia(Diabéteszes nephropathia, DN) gyakoricukorbetegmikrovaszkuláris szövődmény, amely nemcsak vesekárosodást okozhat, hanem más szerveket is érinthet. A vese-tubulointersticiális fibrózis klinikai patológiás jellemzője azcukorbetegnephropathia. Korábbi tanulmányok [P2-5 úgy vélik, hogy a betegség elsősorban a hiperglikémia miatt következik becukorbetegbetegek, amelyek vese hemodinamikai változásokat és rendellenes anyagcserét okoznak. A klinikai tünetek elsősorban a proteinuria és a csökkent glomeruláris szűrési sebesség. JelenlegcukorbetegnephropathiaA betegek még mindig nem rendelkeznek hatékony klinikai kezelési módszerekkel, és az új, hatékony gyógyszerek megtalálása a kulcsa acukorbetegnephropathia.

echinacoside(ECH) a Cistanche Tubulosa egyik kivonata. Ennek hatása a vese élénkítése és a jang erősítése." A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az echinacoside antioxidáns, anti-apoptotikus, gyulladáscsökkentő és jobb véráramlással rendelkezik A mikrocirkuláció és más farmakológiai hatások szintén szabályozhatják a szervezet glükóz anyagcseréjét és javíthatják a glükóz toleranciát. Az elmúlt években tanulmányok kimutatták, hogy az echinacoside gátolhatja a transzformációs növekedési faktort (Transzformáló növekedési faktor, TGF-β) jelátviteli útvonalat és gátolhatjacukorbetegnephropathia. A patkány vesék intersticiális fibrózisa védi a patkány vese szövetét. A szakirodalomban azonban kevés jelentés található azcukorbetegnephropathiavalechinacoside, valamint annak egyedi védelmi mechanizmusacukorbetegnephropathiapatkányokban nem világos. Ezért ez a tanulmány tovább vizsgálta Aechinacosidevesefibrózis és vesesejtes apoptózis eseténcukorbetegnephropathiapatkányok és lehetséges mechanizmusa elméleti alapot kíván biztosítani aechinacoside.

A cistanche előnyei: vesebetegség kezelése és a vesefunkció javítása

1 Anyag és módszerek

1.1 Állatok:

60 SD patkány, hím, SPF minőségű, 8 hetes, testtömege 240 ~ 280 g, a Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd. biztosítja, állatengedély száma: SCXK (Peking) 2015-0001, az állat minősége minősített Tanúsítványszám: 11400700106210, a kórház állatközponti laboratóriumában emelve, a szobahőmérsékletet állandóan 25 ° C-on tartva, szimulálva a nappalt és az éjszakát, 12 óránként egyszer megváltoztatja a fényviszonyokat, és az állatok szabadon esznek és inni.

1.2 Gyógyszerek és reagensek:

Echinacoside, Kína Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Intézet, tételszám: 111670-201706; Lozartán-kálium, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., Nemzeti Orvostudományi Szabvány: H20030654; Streptozotocin, American Sigma Company, tételszám: 040103; Vizelet Fehérjetartalom-detektáló készlet, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., tételszám: 20170612; TUNEL detektáló készlet, Amicage Technology Co., Ltd., tételszám: 20180406; RNS extrakciós készlet, fordított transzkripciós készlet, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., tételszám: 20180705, 20180904; Szérum hialuronsav (HA), szöveti metalloproteináz inhibitor-1 (TIMP-1) és laminin (laminin, LN) detektáló készletek, Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., a tételszámok 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Készülék

7600 típusú automatikus biokémiai analizátor, Japán HITACHI cég; hordozható vércukorszintmérő, Peking Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd.; B X60 optikai mikroszkóp, Japán OLYMPUS cég; SN-695B radioimmunoassay analizátor, Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd. cég

1.4 Csoportosítás, modellreplikációs és adminisztrációs módszer

Egy hét elő etetés után 60 patkányt véletlenszerűen osztottak fel a kontrollcsoportra, a modellcsoportra, aechinacosidemagas, közepes és alacsony dózisú csoportok és a Lozartán káliumcsoport, minden csoportban 10 patkány. A modellcsoport,echinacosidea csoportot és a lozartán káliumcsoportot magas zsírtartalmú és magas cukortartalmú étrenddel kezelték, alacsony dózisú sztreptocinnal kombinálva, hogy indukáljanakcukorbetegnephropathiapatkányokban. A modell replikálása előtt a patkányok 12 órán át vízzel böjtöltek. A kontrollcsoport patkányait szokásos takarmánnyal táplálták, a többi csoportot pedig magas zsírtartalmú és magas cukortartalmú takarmányokkal táplálták. 4 hetes folyamatos etetés után a kontrollcsoportban lévő patkányoknak egyetlen intraperitoneális injekciót adtak, egyenlő térfogatú citrátpufferrel, a többi csoportnak pedig egyetlen intraperitoneális injekciót kaptunk sztreptocin bakteriocinból (40 mg·kg"), hogy megismételjék acukorbetegnephropathia. 72 órával azután, hogy a patkányokat sztreptozotocinnal injektálták, a vércukorszintet ≥16,7 mmol· L, és a vizeletfehérje 3 hét után 24 órával történő kiválasztási aránya magasabb volt, mint a kontrollcsoporté. A 24 órás kvantitatív vizeletfehérje több mint 50% volt a modell replikációja előtt, ami azt jelzi, hogy a modellt sikeresen megismételték. Négy héttel a sztreptocin injekció beadása után az alacsony, közepes és nagy dózisú csoportokechinacoside20 mg·kg', 50 mg·kg és 100 mg·kg"echinacoside(patkányokban 5 ml·kg szerint). kg"' testsúlyát 37°C-os normál sóoldatban oldjuk fel), a Lozartán-káliumcsoportba tartozó patkányokat intragasztrikusan 16 mg·kg-os Lozartán-káliummal, a modellcsoportot és a kontrollcsoportot pedig intragasztrikusan, azonos térfogatú normál sóoldattal, naponta egyszer adják be. A gavage-t 2 hétig folytatták.

1.5 Mintagyűjtés

Az utolsó beadás után a patkányok étel és víz nélkül böjtöltek. Feljegyezték a patkányok 24 órás ivóvizét, és összegyűjtötték a 24 órás vizeletet. A második nap kora reggelén a patkányokat megmérték. Vizeletgyűjtés után 2% pentobarbitál-nátriumoldat 2mL·kg~ intraperitoneális injekciója érzéstelenítésre, patkány hasi aortavér elválasztására, centrifugálásra (3 500 r·min²', 15 perc), vegye be a szérumot, és tegye a hűtőszekrénybe - Ideiglenesen tárolja 20 °C-on; válasszuk szét a patkány vese szövetét, és osszuk két részre, az egyik részt 4% -os paraformaldehidben rögzítjük, a másik részét 10% homogenizátumként állítjuk elő, és -80 °C-os hűtőszekrénybe helyezzük későbbi felhasználás céljából.

1.6 A glükóz- és lipidanyagcsere meghatározása patkányokban

Minden patkánycsoport szérumát vettük, az éhgyomri vércukorszintet vércukorszintmérővel mértük, a triglicerid, a koleszterin és az alacsony sűrűségű lipoproteinszinteket pedig egy automatikus biokémiai analizátorral detektáltuk.

1,7 24 órás vizeletfehérje, vesefunkció és vesefibrózissal kapcsolatos mutatók

Minden csoportban összegyűjtöttük a patkányok 24 órás vizeletét, és a 24 órás vizelet mikroprotein-tartalmát radioimmunoassay-val határoztuk meg. A műveletet az utasításoknak megfelelően hajtották végre. Minden patkánycsoport szérumát összegyűjtöttük, és az automatikus biokémiai analizátort használtuk a vér kreatininszintjének és a karbamid-nitrogén szintjének kimutatására, amelyek a vesefunkcióhoz kapcsolódnak, a TIMP-1 szérum szintjét ELISA-val detektáltuk, és a HA és LN szintjét radioimmunoassay-val detektáltuk. A műveletet az utasításoknak megfelelően hajtották végre.

1.8 HE festés a veseszövet patológiás változásainak megfigyelésére és TNUEL festés a vese szöveti sejtek apoptózisának megfigyelésére

Az egyes csoportok rögzített veseszöveteit vettük, rutinszerűen beágyaztuk a paraffinba és szakaszoltuk. Az egyik részt he-festésre használják a vesetubulusok, a glomerulusok és a vese interstitium morfológiai változásainak megfigyelésére fénymikroszkóp alatt; a másik részt a TUNEL festésre használják, a készlet utasításai szerint működnek, és mikroszkóp alatt megfigyelik a vese szöveti sejtek számát és pozitivitását A sejtek számát a pozitív sejtek számának és a vese szöveti sejtek számának arányaként számítják ki, ami az apoptózis sebessége.

1.9 RT-PCR módszer az apoptózissal kapcsolatos gének veseszövetekben való expressziójának kimutatására

Vegyük a patkány vese szövet homogenizátumát, extraháljuk a teljes RNS-t Trizol módszerrel, határozzuk meg a koncentrációt ultraibolya spektrofotométerrel, és szintetizáljuk a cDNS-t fordított transzkripciós készlettel.

1.10 Western Blot módszer a VCAM-1, TGF-β és α-SMA fehérje veseszövet expressziójának meghatározására.

Vegyünk kb. 50 mg patkány vese szövet homogenizátumot, oldjuk fel proteáz inhibitorokat tartalmazó sejt-lizátummal, és extraháljuk az összes fehérjét sejt-lizátummal, a BCA módszer alkalmazásával a fehérje mennyiségi meghatározására. Az összes fehérjeminta 50 μmol· Az L" -et poliakrilamid gél elektroforézissel nitrocellulóz membránba vittük, és 5% sovány tejjel lezártuk, és hozzáadtuk az elsődleges antitestet (1∶1000) és β-aktinfehérjét. Antitest (1:300), inkubáljuk egy éjszakán át 4°C-on. Végül adjuk hozzá a másodlagos antitestet, és inkubáljuk 2 órán át 37°C-on, elektrokemilumineszcenciával ellenőrizve. A Photoshop képelemző szoftverével elemezheti a fehérjesávok szürke értékét.

1.11 Statisztikai feldolgozási módszerek

A kapott adatok elemzésére SPSS 17.0 szoftvert használtunk, és a normál eloszlást kielégítő mérési adatokat átlagos ± szórásként ((x±s) fejeztük ki, és a variancia egyfaktoros elemzését használjuk a csoportok közötti különbségek összehasonlítására. A csoportok közötti páros összehasonlítás SNK-t használ- Q teszttel, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 Eredmények

2.1 Az echinacoside hatását a diabéteszes nefropátiában szenvedő patkányok testtömegére, ivóvízére és vizeletkibocsátására az 1. táblázat mutatja be.

1. táblázat Az ECH hatása a testtömegre, a vízbevitelre és a vizelet térfogatára DN patkányoknál (x ± s,n=10)

A kontrollcsoporthoz képest a modellcsoport patkányainak testsúlya jelentősen csökkent, a 24 órás ivóvíz és vizelettermelés pedig jelentősen megnőtt. A különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">echinacosideA Lozartán-káliumcsoportban lévő patkányok testtömege jelentősen nőtt, a 24 órás ivás és vizeletkibocsátás jelentősen csökkent, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<>

2.2 Az echinacozid glükóz- és lipidanyagcserére gyakorolt hatását diabéteszes nefropátiás patkányoknál a 2. táblázat mutatja be.

2. táblázat Az ECH hatása a glükóz- és lipidanyagcserére DN patkányokban

Jegyzet:A kontrollcsoporttal összehasonlítva,"<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

A kontrollcsoporthoz képest a modellcsoport patkányainak éhgyomri vércukorszintje jelentősen megemelkedett, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). A modellcsoporthoz képest a patkányok éhgyomri vércukorszintje a középső és a nagy dózisú csoportokbanechinacosideés a lozartán káliumcsoport jelentősen csökkent, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Az echinacoside hatását a 24 órás vizeletfehérjére és a diabéteszes nephropathiás patkányok vesefunkciójára a 3. táblázat mutatja be.

A kontrollcsoporttal összehasonlítva a modellcsoport vizelet mikroalbumin-, karbamid-nitrogén- és kreatininszintje jelentősen megnőtt, és a különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">echinacosidecsoportok A patkányok vizelet mikroalbumin-, karbamid-nitrogén- és kreatininszintje a lozartán káliumcsoportban jelentősen csökkent, és a különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (P<>

3. táblázat Az echinacozid hatása a 24 órás vizeletfehérjére és a diabéteszes nephropathiában szenvedő patkányok vesefunkciójára (x±s, n = 10)

2.4 Az echinacoside vesefibrózisra gyakorolt hatását diabéteszes nefropátiás patkányoknál a 4. táblázat mutatja be.

A kontrollcsoporthoz képest a ha, TIMP-1 és LN szérumszintek szignifikánsan emelkedtek a modellcsoportban, és a különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

4. táblázat Az ECH hatása a vesefibrózisra DN patkányoknál

2.5 HE festés a veseszövet patológiás változásainak megfigyelésére diabéteszes nefropátia patkányoknál (lásd az 1. ábrát).

A kontrollcsoportban lévő patkányok HE-festése azt mutatta, hogy a vese szöveti sejtjeinek szerkezete ép, és nem észleltek nyilvánvaló kóros változásokat. A modellcsoportban lévő patkányok HE festése és az alacsony dózisúechinacosidea csoport kimutatta: a glomerulus megduzzadt és megnagyobbodott, a vese tubuláris epiteliális sejtjei megduzzadtak vagy leestek, a vese interstitiumát gyulladásos sejtbeszivárgás kísérte, és néhány mesangiális hiperplázia és intersticiális proliferáció is látható volt. Minőségi fibrózis.Echinacosideközepes és nagy dózisú csoportok és Lozartán káliumcsoportok. A festés azt mutatta, hogy a veseszövet patológiás változásai jelentősen csökkentek, kis mennyiségű gyulladásos sejtbeszivárgás kíséretében, és a mesangiális hiperplázia és az intersticiális fibrózis mértéke is könnyebb volt, mint a modellcsoporté.

1. ábra A patkányok veseszöveteinek patológiai változásai az egyes csoportokban

2.6 Az echinacoside hatását a veseszövet apoptózisára diabéteszes nephropathiás patkányoknál a 2. ábra mutatja.

A TUNEL festés azt mutatta, hogy a kontrollcsoporthoz képest a modellcsoportban a patkányok apoptózisaránya jelentősen megnőtt, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<0,05); a="" modellcsoporttal="" összehasonlítva="" a="" közepes="" és="" a="" nagy="">echinacosideés Corsa A káliumcsoportban a patkányok apoptotikus aránya jelentősen csökkent, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<>

2. ábra A vese szöveti sejtjeinek apoptózisa DN patkányokban

2.7 Az echinacoside hatását az apoptózissal összefüggő gének expressziójára a diabéteszes nefropátiás patkányok vese szöveteiben a 6. táblázat mutatja.

Az RT-PCR eredmények azt mutatták, hogy a kontrollcsoporthoz képest a Bax és a Kaszpáz-3 mRNS expressziója a modellcsoportban jelentősen felfelé szabályozott volt, és a Bcl-2 mRNS expressziója jelentősen lefelé szabályozott volt, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">echinacosidecsoportok és a Lozartán káliumcsoport, valamint a Bcl-2 mRNS expressziója szignifikánsan felfelé szabályozott volt, és a különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (P<>

6. táblázat Az ECH hatása az apoptózissal kapcsolatos gén expressziójára a DN patkányok vese szövetében

2.8 Azechinacosidea VCAM-1, TGF-β és α-SMA fehérjék expressziójárólcukorbetegnephropathiapatkányokat a 3. és a 7. táblázat mutat be. A kontrollcsoporthoz képest a VCAM-1, TGF-β és α-SMA fehérje expressziója a modellcsoportban szignifikánsan felfelé szabályozott volt, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<0,05); a="" vcam-1,="" tgf-β="" és="" α-sma="" fehérjék="" expressziói="" patkányokban="" a="" dóziscsoportban="" és="" a="" lozartán="" káliumcsoportban="" szignifikánsan="" lefelé="" szabályozottak="" voltak,="" és="" a="" különbségek="" statisztikailag="" szignifikánsak="" voltak=""><>

KATTINTSON IDE A II. RÉSZHEZ.