Új STING-inhibitorok felfedezése az egér STING agonista DMXAA szerkezete alapján
Nov 27, 2023
Absztrakt:
Az interferon-gén-stimulátor (STING) fehérje részt vesz a veleszületett immunitásban. A DMXAA (5,6-dimetilxanthenon-4-ecetsav) hatásos egér-STING (mSTING) agonistának bizonyult, de csekély hatása volt a humán STING-re (hSTING). Ebben a cikkben a különböző kristályszerkezetek összehasonlítására és a fehérje-ligandum kölcsönhatások elemzésére támaszkodunk, hogy felvegyük azt a hipotézist, hogy a DMXAA-változatok gyógyszertervezése képes a STING-agonistákat inhibitorokká alakítani. Két DMXAA analóg, a 3-as és a 4-es DMXAA analóg korábbi felfedezése alapján (mindkettő kötődhet az STING-hez) szerkezetileg optimalizáltuk őket, és új származékokat szintetizáltunk. A kötési vizsgálatok során azt találtuk, hogy a 11-es és 27-es vegyületek olyan STING-kötőanyagokat képviselnek, amelyek jobbak az eredeti szerkezeteknél, és megvitattuk a szerkezet-aktivitás összefüggéseket. Az összes célvegyület inaktív volt a STING agonista aktivitás szűrésére szolgáló celluláris vizsgálatokban. Örvendetes módon azonosítottuk a 11-es és 27-es STING-inhibitorokat, amelyek mikromoláris aktivitással rendelkeznek mind a hSTING, mind az mSTING útvonalon. Ezenkívül a 11 és 27 gátolta az interferon és a 20 3 0 -cGAMP által aktivált gyulladásos citokinek indukcióját, nyilvánvaló citotoxicitás nélkül. Ezek az eredmények megtörik azt a merev gondolkodást, hogy a DMXAA kifejezetten a STING agonisták strukturális alapot nyújt, és több lehetőséget nyit meg új STING agonisták vagy inhibitorok kifejlesztésére.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Kulcsszavak:
FULLÁNK; DMXAA; fajszelektivitás; STING agonista; STING gátló
1. Bemutatkozás
Az interferon-gén stimulátora (STING) a belső immunitás alapvető jelátviteli molekulája, elsősorban a citoplazmatikus DNS által kiváltott természetes immunválaszokat közvetíti [1]. Amikor a DNS-receptor ciklikus guanozin-adenozin-foszfát-szintáz (cGAS) intracelluláris kétszálú DNS-t észlel, a cGAS katalizálja a 2 0,30 -cGAMP (1. ábra), egy ciklikus dinukleotid (CDN) szintézisét. az endoplazmatikus retikulumon lévő STING-hez való közvetlen kötődés és aktiválás [2–4]. Aktiválásakor a STING aggregátumokat képez, amelyek a TANK-kötő kináz 1-hez (TBK1) lefelé toboroznak, és megkötik az interferon szabályozó faktor 3-at (IRF3), amely foszforilálja az IRF3-at, aktiválja az IRF3 dimereket a sejtmagban, indukálja az I-es típusú interferon (IFN) expresszióját. interferon immunválasz [1]. Számos tanulmány kimutatta, hogy az STING számos betegség patogenezisében vesz részt, és hogy az STING stimulálása hatékony immunválaszt indukál a patogén fertőzésekkel és rákkal szemben; a krónikus gyulladásos jelátvitel modulálásának kudarca azonban autoimmun és gyulladásos betegségekhez vezet [5–8]. A STING veleszületett immunitás szabályozásában betöltött alapvető szerepe miatt számos csapat kezdett STING agonisták vagy inhibitorok kifejlesztésébe.
1. ábra. Reprezentatív STING modulátorok
Az első generációs STING agonisták kutatása a CDN-analógok szerkezeti módosítására összpontosított, hogy megkerüljék az endogén CDN-ek bizonyos korlátait, például a rossz membránpermeabilitást és a foszfatázok általi hidrolízisre való érzékenységet [9,10]. A kis molekulájú STING agonista 5, 6-dimetilxanthenon-4-ecetsav (DMXAA), amely egérmodellekben terápiás ígéretet mutatott a szilárd daganatok ellen, ellensúlyozhatja a CDN-származékok hátrányait [11]. A gyógyszer azonban kudarcot vallott a humán klinikai vizsgálatokban [12]. Megerősítették továbbá, hogy a DMXAA szelektíven kötődik az egér STING-hez (mSTING), nem pedig a humán STING-hez (hSTING) [13,14], ami gátolja a DMXAA terápiás potenciálját emberekben. A 10-karboximetil-9-akridinon (CMA) egy másik reprezentatív egérspecifikus STING agonista, amelyet az 1970-es évek elején hatékony I. típusú IFN-induktorként használtak antivirális terápiában [15]. Ezért a fajszelektivitás létfontosságú tényező a kis molekulájú STING agonisták kifejlesztésében. A kutatók, köztük a diABZI, SR717, MSA02 és mások fáradhatatlan erőfeszítései révén jelentős újszerű csontváz-hSTING agonisták kerültek látókörbe [16–19].
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
Egyre több bizonyíték bizonyítja, hogy a STING hiperaktiváció autoinflammatorikus és autoimmun betegségekkel jár. Korlátozni kell az STING jelátviteli útvonal túlzott aktiválódását, ami rávilágít a STING inhibitorok potenciális értékére. A STING-agonistákkal ellentétben azonban a STING-gátlók kifejlesztése még gyerekcipőben jár, és klinikai vizsgálatokba még egyetlen gyógyszerjelölt sem indult. Az ismert STING-gátlók között kétféle vegyület található: kompetitív antagonisták (SN-011 és Merck-18) és kovalens inhibitorok (H151) [20–22]. A korábban azonosított kovalens STING-inhibitorok kölcsönhatásba lépnek a Cys88/91-gyel vagy a Cys91-gyel, amelyek az STING N-terminális transzmembrán doménjében találhatók a CDN-kötő zseben kívül [22]. A közelmúltban két csapat egymás után két olyan STING antagonista szerkezeti típusáról számolt be, amelyek a 20 3 0 -cGAMP-kötő zsebet foglalják el, hogy gátolják a 20 3 0 -cGAMP aktiválását, ami kétélű hatásra utal a CDN-kötő zsebben [20 ,21].
Itt egy új perspektívát kínálunk. Azt javasoljuk, hogy az alsó zseb, ahol a DMXAA és a CMA található, megkönnyíti a STING-inhibitorok kifejlesztését mély adatbányászatunk és az azonosított STING fehérjék ko-kristályszerkezeti információinak összehasonlítása alapján. Korábbi vizsgálatunk CMA- és DMXAA-analógok sorozatáról számolt be, és azonosította a 3-as és 4-es vegyületet, amelyek kötődnek a hSTING-hez, de gyenge celluláris potenciállal [23] (2. ábra).
2. ábra: A 3. és 4. vegyületek kémiai szerkezete biológiai aktivitásukra vonatkozó adatokkal. Az 1–4. vegyületek EC50-értékeit STING riportersejtek, a kötődési IC50 értékeket pedig STING kompetíciós kötőkészletekkel mértük.
Ebben a cikkben a STING-inhibitorok tervezésével kapcsolatban, hogy hatékonyabb kötőanyagokat fedezzenek fel, több érintkezéssel az alsó zsebben, szerkezeti optimalizálást végeztünk a 3-as és a 4-es esetében. Ezt követően SAR-vizsgálatot végeztünk a versengés-kötődési vizsgálatok alapján. A bioaktivitás értékelése során a 11-es és 27-es vegyületek széles spektrumú kötőanyagként működtek, és mikromoláris szintű STING-gátló aktivitást mutattak több bejelentett sejtben. Ami a dokkoló szerkezetet illeti, két 11. vegyület molekula inaktív "nyitott" konformációban tartja a hSTING-et, így kompetitív módon gátolja az endogén 20 3 0 -cGAMP kötődését, ami hasonló a Merck kristályszerkezetéhez-18 és a dokkoló szerkezethez. SN-011 [20,21].
2. Eredmények
2.1. A DMXAA származékok, mint STING-gátlók tervezési stratégiája
2.1.1. A STING-inhibitorok tervezési helyeinek azonosítása különböző kristályszerkezetek összehasonlításával
A STING ligandumkötő domén (LBD) apo-proteinje szimmetrikus dimerként kristályosodott ki a nem-ligandumban, amit a gélszűrés és az analitikai ultracentrifugálási analízis nem okozott [24–26]. A STING dimer pillangószerű konformációt vesz fel, és a ligandumkötő hely a két monomer határfelületén helyezkedik el. Először is, ez a cikk a hSTING és mSTING fehérjék infrastrukturális és aktiválási mechanizmusait vizsgálja, összehasonlítja a köztük lévő különbségeket, valamint néhány érdekes meglátást tár fel. Az apo szerkezetre nézve mindkét fehérje természetes konformációja azt mutatja, hogy az mSTING koncentráltabb, mint a hSTING (3. ábra). Shih et al. molekuláris dinamikai (MD) szimulációkat alkalmazott a hSTING és az mSTING közötti különbségek tanulmányozására, megmutatva, hogy a hSTING a nyitott inaktív konformációt részesíti előnyben, az mSTING pedig a zárt-aktív konformációt, még ligandumkötés nélkül is [27].
20,30 -cGAMP-hoz kötve a hSTING konformációs átmenete nyitottból (apo-protein, oldalirányú távolság ~57 Å) zártba (cGAMP-kötött fehérje, oldalirányú távolság ~40 Å), míg az ellenkezője. igaz az mSTING-re (29 Å - 40 Å). Az apo-hSTING szerkezete drámaian eltér az apo-mSTING szerkezetétől, de a 20,{11}}cGAMP-pal komplexált STING szerkezete átfedi egymást. A DMXAA, a CMA és a cGAMP különböző szerkezeti vázzal rendelkező STING agonisták, de az mSTING fehérjékhez való kötődéssel kapcsolatos aktiválási konformációik is lényegében azonosak (3. ábra). A fent leírt forgatókönyvek arról tanúskodnak, hogy a hSTING és az mSTING stimulációs mechanizmusai feltűnően eltérnek egymástól; a STING által aktivált konformációk azonban viszonylag állandóak, függetlenek a fajszelektivitástól és az agonista gerinc típusától (miközben a konformációs változásokat előidéző STING agonistákra korlátozódnak). A különböző kristálykomplexek kötőtasak térfogata általában konvergens (~300 Å3, S1 táblázat), ami további bizonyítéka a STING fehérje aktiváló konformációjának stabilitásának.
3. ábra Apo- és vegyülethez kötött STING kristályszerkezetek összehasonlítása. Az mSTING fehérje a búza (a távolságot piros vonallal tesztelték), PDB kód: 4KC0 (apo), 4LOJ (kötött-cGAMP), 4LOL (kötött-DMXAA) és 4JC5 (kötött-CMA)
Másodszor, az aktiválás konformációs stabilitására vonatkozó fenti megállapítások alapján a cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 és MSA02 ko-kristály szerkezeteit egymásra helyeztük, amelyek zárt konformációs STING agonisták, hogy feltárjuk a különböző strukturális agonisták helyzetét a sejtekben. STING fehérjekötő helyek. A fehérjezseb két régióra osztható: az alsó zsebre és a felső zsebre, a STING agonisták fehérjezsebben való eloszlását követően (4a ábra). Azon kívül, hogy az mSTING agonisták DMXAA és CMA teljesen az alsó zsebben vannak, a többi agonista aktiválhatja a hSTING útvonalat, és a felső régióban feküdhet. Ezután feltérképeztük az öt STING agonista kölcsönhatásait a STING fehérjéhez kötött aminosavmaradékokkal (a ligandumtól számított 5 Å-en belül; S1 ábra), megmutatva, hogy az elsődleges aminosavak közé tartozik az R238, Y167, R232, S162, T263 és T267. (az mSTING megfelelő maradékok sorszáma mínusz egy). A maradékok szekvenciális illesztése a zsebekhez azt mutatta, hogy a T267, T263 és S162 az alsó zsebben található; a felső zsebben R238, R232 és Y167 található (4b. ábra). Amint arról beszámoltunk, az R238, Y167 és R232 nélkülözhetetlen az agonista STING-hez való kötődéséhez, különösen az R238-hoz (az mSTING fehérje az R237-nek felel meg), amelynek mutációja a stabilizáció (ligandumkötés) teljes elvesztését eredményezné [28–30]. Che és mtsai. azt is feltárta, hogy az R238 kulcsmaradék uralja a DMXAA kötődését, és a pontmutációk (S162A/E260I) MD szimulációkkal fokozhatják az R238 és a DMXAA kölcsönhatását [31].
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Az mSTING fehérje zsebének elfoglalására a DMXAA vagy a CMA egyedi kötési módot fogadott el, amelyben két kis molekulájú agonista kötődik egyetlen mSTING homodimerhez. A DMXAA-k szilárdan rögzítve vannak az alsó zsebben a ketocsoport és a T266 oldallánc közötti hidrogénkötésekkel (a hSTING 267-nek felel meg), míg a karboxilátcsoport kölcsönhatásba lép az R237 és T262 oldalláncokkal (5a. ábra). A DMXAA és az R237 (az egyetlen kulcsfontosságú aminosav a felső zsebben) kölcsönhatása döntő fontosságú az mSTING aktivitásához. Egy gyakran figyelmen kívül hagyott részlet, hogy a DMXAA csak a szimmetrikus monomer fehérjék R237-ére képes hatni, például a DMXAA-ra (A molekula), amely befolyásolja az R237B-t (5a. ábra). Mivel a DMXAA alul helyezkedik el, az A molekula és az R237B közötti távolság 3,06 Å, míg az R237A távolsága nagyobb, mint 5 Å (5b. ábra). Az mSTING fehérje kompaktabb zsebéből származó előnyök révén a DMXAA könnyedén kölcsönhatásba lép a szimmetrikus mSTING monomer R237-ével, de nincs mód arra, hogy a DMXAA kapcsolódjon a konformációsan nyitott apo-hSTING fehérjében lévő R238-hoz (3. ábra). Ezért a DMXAA zsebhelyzete rontja a hSTING útvonal stimulálását. A közelmúltban a Merck, a DMXAA 2:1 kötési arányától ihletett, olyan STING antagonistákat fedezett fel, amelyek képesek elfoglalni a kötőzsebeket [21]. A Merck 18 és a hSTING fehérje kristálykomplexe azt mutatja, hogy a vegyület főként a fehérje zsebe alatt helyezkedik el, és kölcsönhatásba lép az S162-vel, T263-mal és T267-tel, amelyek mindegyike megegyezik a DMXAA tulajdonságaival (5c. ábra). Ebből hipotézisek születtek: a felső zseb kiváló üreg a STING agonisták tervezésére; az alsó zseb alkalmasabb fészek az inhibitorok számára, és a DMXAA vagy CMA szerkezete úgy van optimalizálva, hogy STING antagonistává váljon.
4. ábra. Az STING kötőhelyek felosztása és megoszlása kulcsfontosságú aminosavakkal. (a) Két régió elhelyezkedése az STING monomerben. Az alsó zseb bíbor színű, a felső zseb zöld. Az átfedő kristálykomplexek PDB kódjai a következők: 4LOH (cGAMP, zöld), 6UKV (MSA-02, sárga), 6XNP (SR717, narancssárga), 4LOL (DMXAA, magenta) és 4JC5 (CMA, lila). (b) A kulcsfontosságú aminosavak eloszlása a felső és alsó régiókban. Az alsó zsebben lévő maradékok bíbor színnel, a zöldek pedig a felső régióban láthatók.
5. ábra: DMXAA és Merck kristálykomplexei 18. (a) Intermolekuláris érintkezések a DMXAA és az mSTING komplexében. A kötött DMXAA szürke színben látható, az egyes STING alegységek a szimmetrikus dimerben zöld és lila színben láthatók. Az A és B felső index fehérje monomer vagy egyedi ligandum azonosságot jelez. (b) Távolságok az R237A és R237B kulcsmaradékok, valamint a DMXAA (A molekula) között. Az R237A a DMXAA karboxilcsoportjához viszonyítva 6,02 Å, az R237B a DMXAA karboxilcsoportjához 3,06 Å. (c) A hSTING fehérjéhez (PDB 6MXE) kötődő Merck 18 kristályszerkezete és intermolekuláris kapcsolatainak részletei. A kötött ligandum szürke színben látható, az egyes STING alegységek a szimmetrikus dimerben zöld és lila színben láthatók. Az A és B felső index fehérje monomer vagy egyedi ligandum azonosságot jelez
6. ábra: Kutatási alapok és optimalizált hotspotjaink DMXAA és CMA származékokhoz. (a) Az mSTING-hez kötött DMXAA (PDB: 4LOL, sötétkék színű) szerkezetének szuperpozíciója a hSTING S162A/G230I/Q266I-hez kötött DMXAA szerkezetével (PDB: 4QXR, narancssárga). (b) A mutált hSTING-hez kötött DMXAA részletei (PDB: 4QXR). A szaggatott vonalak a lehetséges módosítási helyeket jelölik. A zölddel jelölt aminocsoportok mutált aminosavak (S162A/Q266I).
Azt találtuk, hogy a DMXAA képtelensége a hosting útvonal aktiválására a DMXAA alsó zsebben való elhelyezkedésével függ össze (a 2.1.1. szakasz szerint), ami egyben a STING-inhibitorok tervezési ötletét is megadta: a DMXAA származékok érintkezésének növelését. az alsó régióval szerkezeti módosításokon keresztül, hogy az STING nem aktivált konformációban maradjon. Az S162 és Q266 megfelelően a kötőhely alján helyezkednek el, így a DMXAA-k jól elhelyezhetők mindkettővel közvetlen érintkezésben, megkönnyítve az alsó zsebben található aminosavak ligandumokra gyakorolt hatásának feltárását. A szerkezet-aktivitás összefüggések (SAR) elemzése feltárta, hogy az 5,6-dimetil-rész és a C7--helyzetű metoxicsoport döntő jelentőségű a 3-as és 4-es biológiai aktivitása szempontjából. Amint a 6b. ábra mutatja, az 5. ,6-dimetilcsoport hidrofób kölcsönhatásokat hozott létre több aminosavval az alsó zsebben; a DMXAA C7 pozíciójának a Q266 aminosavhoz való közelsége miatt a megfelelő metoxi-módosítás lehetővé tette a 3-as és 4-es kötődését a tárhelyhez. Ezért szerkezeti kidolgozásaink az 5,6-dimetil és a C7 metoxi reteszelését feltételezték, az új származékok tervezése pedig a C1/C2 pozícióban lévő poláris csoport módosítására (ami hatással van az S162-re) és a karbonsavcsoport megváltoztatására összpontosított. a szerkezeti sokszínűség kiterjesztése). Megterveztünk és szintetizáltunk egy sor származékot a 3. és 4. vegyület állványként való felhasználásával, ezzel igazolva a javasolt inhibitor sejtésünket.
2.2. Kémia
Az összes intermedier és célvegyület előállítását az 1. reakcióvázlat vázolja fel. 1-metoxi-2, 3-dimetil-4-nitrobenzol (5) és 2-bróm-benzoesav ( 7) kereskedelmi forgalomban voltak. Kezdetben a 1-metoxi-2,3-dimetil-4-nitrobenzolt 4-metoxi- 2,3-dimetil-anilinné alakították (6) vasporral történő redukcióval. Ezután a 6. és 7. vegyületet Ullmann-reakciónak vetettük alá kálium-karbonáttal, réz és réz(I)-oxid N,N-dimetil-formamidban katalizálva a megfelelő 8. intermedier előállításához. 2-metoxi-3,4-dimetil-akridin-9(10H)-on (9). A 9 ezt követő helyettesítését bróm-etil-acetáttal végeztük, és 1 ekvivalens HBr elvesztése etil-2-(2-metoxi-3, 4-dimetil-9-) eredményezett. oxoakridin-10(9H)-il)-acetát (10). Végül a 10. vegyületben lévő etil-acetátot nátrium-hidroxiddal karbonsavvá hidrolizáltuk, így 2-(2-metoxi-3,4- dimetil-9-oxoakridin-10 (9H)-il)-ecetsav (11).
1. séma a. EtOH, Fe, NH4CI; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. Eaton-reagens; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CCl3CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.
További célvegyületek későbbi szintéziséhez először a 2-amino-5-metoxi-3,4-dimetil-benzoesav (14) vegyületet kell szintetizálnunk. A (6) képletű vegyületet klorál-hidráttal és hidroxil-aminnal reagáltatva acetamidot és hidroxi-amino-csoportot, az (E)-2-(hidroxilamin)-N-(4-metoxi-2,3-dimetil-fenil) intermediert )acetamid (12). A 12. vegyület hidroxi-amino-jának ezt követő Beckmann-átrendeződési reakcióját kénsavval hajtottuk végre, így a 13. laktámszármazékot kaptuk. Végül a 13. intermediert hidrogén-peroxiddal és nátrium-hidroxiddal hidrolizáltuk etanolos oldatban, így a 14. vegyületet kaptuk. A reakció kiindulási anyagaként a 14. vegyületet használva tovább szintetizálta a 8-metoxi-9,10-dimetil-6Hpirrolo[3,2,1-de]akridin-1,6( 2H)-dion-származékok, amelyek R1 és R2 helyén szubsztituensek vannak. Kezdetben a 14-et és a 15-19-et Ullmann-reakciónak vetettük alá kálium-karbonáttal, réz és réz(I)-oxid katalizálásával N,N-dimetil-formamidban, hogy megfelelő 20-24 intermediereket kapjunk. A 20-24 intramolekuláris kondenzációs reakcióit Eaton-reagenssel hajtották végre, hogy 8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,{{46} }de]akridin-1,6(2H)-dion-származékok (25–29). Hasonlóképpen, a reakció kiindulási anyagaként a 14-et használva tovább szintetizáltunk 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9,{{ 59}}dihidroakridin-4- karbonsav-származékok R helyén szubsztituensekkel. Kezdetben a 14-et és a 7-et vagy a 30-at Ullmann-reakciónak vetettük alá kálium-karbonáttal, rézzel és réz(I)-oxiddal katalizálva N,N-dimetil-formamidban. a megfelelő 31. és 32. intermedier. A 31. és 32. vegyület intramolekuláris kondenzációs reakcióit Eaton-reagenssel hajtottuk végre, hogy 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9 keletkezzen. ,10-dihidroakridin-4-karbonsav-származékok (33,34). Így 16 akridonanalógot terveztünk, szintetizáltunk és szűrtünk, amelyek szerkezetét az 1. táblázat foglalja össze.
1. táblázat: A jelen tanulmány új analógjainak felépítése.
2.3. Az új vegyületek kötőereje az STING-hez és SAR-okhoz
Az új vegyületek STING-hez és SAR-okhoz való kötődésének hatékonysága A szerkezeti módosítás hatékonyságának közvetlen megerősítése érdekében először az összes szintetizált vegyületet cGAMP-kiszorítási tesztekkel szűrtük. A fajok szelektivitása mellett az STING-nek öt olyan változata létezik, amelyek emberben polimorf: R232 (WT, a populáció 58%-a), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) és Q ( 2%) [32]. Ezért a kereskedelmi kompetitív assay kiteket használtuk homogén időfelbontású fluoreszcencia (HTRF) technológiával, hogy teszteljük az új vegyületek biokémiai hatékonyságát mSTING-en és különböző hSTING izoformákon (WT, H232 és AQ), és összehasonlítottuk a kontrollal. Ahogy az várható volt, az 1–4. kontrollvegyületek mindegyike kötődött az mSTING-hez; A hSTING szűrés alapján a 3. és 4. vegyület IC50 értéke mikromoláris szinten volt.
2. táblázat: Különböző hSTING izoformákkal rendelkező vegyületek és mSTING kompetíciós kötési vizsgálatok eredményei.
Először a 3. vegyület alapján egy halogénatomot vagy metoxicsoportot vittünk be a C1/C2 helyre (1. táblázat). A 27. vegyület, mint a 3. vegyület optimális származéka (C1 pozíció F-vel helyettesítve), jobb összaktivitású, mint a 3. vegyület (egy számjegyű mikromoláris aktivitás minden biokémiai vizsgálatban, 2. táblázat). Az R1-módosított 25-ös vegyület széles spektrumú kötőhatással rendelkezik, de nem olyan aktív, mint az F-szubsztituált vagy szubsztituálatlan változat. A 3-as vegyülettel összehasonlítva a C2-helyet bevitt vegyületcsoport (26, 28 és 29) mindegyike különböző mértékű kötési affinitáscsökkenést mutatott, különösen a 29. vegyület esetében. Másodszor, a 4-es vegyület gerincének megtartása és helyettesítése A halogénatomot a C1/C2 hely ellenében a 35-38. számú vegyületeket kaptuk (1. táblázat). Ezek a vegyületek mind a négy kiszorítási vizsgálatban inaktívak voltak 100 µM-ig terjedő koncentrációban, ami azt mutatja, hogy a C1/C2 helyen halogénatommal történő helyettesítés nem tolerálható. Ezután a 4 vegyület acetátcsoportját karboxilcsoporttá alakítottuk (33), és a C2 helyhez metoxicsoportot (34) vezettünk be. Sajnos ez a változtatás kudarcot vallott, mivel mindkét vegyület inaktív maradt. Tanulva kudarcunkból, tovább vizsgáltuk a 4-es vegyület származékainak SAR-értékeit úgy, hogy az acetátcsoportot N-helyzetbe toltuk, és a C1/C2-helyzeteket változatlanul hagytuk. A 11. vegyület STING-változatok széles skálájához kötődik, mindegyik IC50-értéke 20 µM alatti; A 9-es vegyület (nincs karboxilcsoport az N-helyen) és a 10-es vegyület (N-acetát-etil) a 11-es vegyület szintetikus prekurzorai, amelyek nem tudnak kötődni az STING-hez, és összehasonlítható a 27-es vegyületével. a karbonsavcsoport fontossága.
2.4. Sejtbiológiai értékelés
2.4.1. Új analógok in vitro szűrése STING agonista aktivitással
Az összes vegyületet szisztematikusan szűrtük STING agonista aktivitásra a 293T hSTING-WT, 293T-mSTING és THP1-KO-STING riporter sejtvonalak segítségével (az Invivo Gen). A 293T-hSTING-R232 sejteket és a 293T-mSTING sejteket felhasználva kimutattuk az IRF-út aktiválását az I-es típusú IFN-indukció közvetett mértékeként a szekréciós embrionális alkalikus foszfatáz (SEAP) aktivitásának monitorozásával, hozzájárulva a fajok fajszelektivitásának vizsgálatához. vegyületek. A THP1-KO-STING sejteket THP1-kettős sejtekből állítottuk elő a STING gén stabil kiiktatásával, és THP1-KO-STING sejteket használtunk annak ellenőrzésére, hogy a vegyület rendelkezik-e funkcióval. STING-függő citokin indukció. Összehasonlítottuk az összes megcélzott származék STING agonista aktivitását az egér (DMXAA) és humán STING (20,30 -cGAMP) referencia agonistáival. Meglepő módon egyik szintetizált vegyület sem tudta aktiválni sem a hSTING, sem az mSTING útvonalat (maximális koncentráció 200 µM-nál), ami súlyosan ellentmond a kötődési vizsgálatok eredményeinek. Ezért a szűrt STING-kötő ágenseink potenciális kötődési mintázattal rendelkezhetnek, mint új STING antagonisták.
2.4.2. STING-kötőanyagok in vitro szűrése STING-inhibitor aktivitással
Először is előkísérleteket végeztünk: az 1 µM kovalens H151 inhibitorral mint pozitív referenciaértékkel feltártuk annak gátló szintjét különböző koncentrációjú 20 3 0 -cGAMP-vel együtt tenyésztett mSTING és hSTING riporter sejtvonalakban, hogy meghatározzuk az optimális körülményeket. az inhibitor szűrésére (a protokoll részleteit lásd a 4.2.3. szakaszban). Másodszor, kezdetben az új vegyületek gátló hatását vizsgáltuk a kísérlet előtti módszerekkel 100 µM koncentrációban. Azt találtuk, hogy a széles spektrumú 11-es és 27-es STING-kötő vegyületek kiváló gátlást mutattak mind az egér, mind a humán STING riportersejtekben, a 3. és 4. vegyület, valamint a többi vegyület nem volt olyan hatékony. Harmadszor, koncentráció-gradienseket állítunk be a 11. és 27. vegyülethez, hogy teszteljük mindkét IC50-értéket, és összehasonlítsuk őket a H151-gyel. A 11. és 27. számú vegyületek mikromoláris koncentrációban voltak aktívak, és gátolták a 20 3 0 -cGAMP-indukált IFN-expressziót mind a hSTING, mind az mSTING útvonalon.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
IC50 értékekkel a 11. vegyület (hSTING 19,93 µM és mSTING 15,47 µM) felülmúlta a 27. vegyületet (hSTING 38,75 µM és mSTING 30,81 µM) (7a. ábra). Összehasonlításképpen, a H-151 IC50 értéke a 293T-hSTING és 293T-mSTING sejtekben 1,04 és 0,82 µM volt (7a. ábra), ami azt jelzi, hogy a H-151 kovalens inhibitor jobban gátló hatást fejt ki az STING-re. -függő jelátvitel sejtalapú vizsgálatokban. A 11-es és 27-es vegyületek gátló tulajdonságának további igazolására egy másik THP-1 humán monocita riporter sejtvonalat, a THP1-Dual-hSTING-R232-t alkalmaztuk, amely kettős riporter rendszert használ az IRF aktiválódásának jelentésére. típusú IFN-indukció közvetett mértékeként és az NF-κB-aktiváció, mint a proinflammatorikus citokin-indukció közvetett mértéke. A THP-1 riporter sejtvonal 20,30 -cGAMP-vel történő stimulálása után megfelelő koncentrációjú STING inhibitorokat adtunk az I IFN és a proinflammatorikus citokin indukciójának gátlására. Ahogy az várható volt, a 11, 27 és H151 vegyületek szignifikánsan gátolták a STING által kiváltott IRF és NF-κB útvonal aktivációkat (7b. ábra). Ezen túlmenően, hogy kizárjuk a vegyületek citotoxicitásának hatását a gátló aktivitásra, a CellTiter-Glo kit-et használtuk a sejtaktivitás vizsgálatára. Örömteli, hogy a 11. és 27. vegyület nem mutatott citotoxicitást 293T és THP-1 sejtekkel szemben a sejtéletképességi vizsgálat szerint, ha olyan koncentrációban (5-100 µM) adták hozzá, amely gátolja az STING-et, ellentétben a H151-gyel, amely már szignifikáns citotoxicitást mutatott 10 µM (7c. ábra). Ezek a vizsgálatok a 11-es és 27-es vegyületeket mérsékelt STING-inhibitorokként azonosították, amelyek megtörik a fajok érzékenységét, és nyilvánvaló citotoxicitás nélkül gátolják az IRF és az NF-κB kettős útvonalát.
2.5. A 11. vegyület aktivitásának szerkezeti alapjait dokkoló segítségével vizsgáltuk
A kompetitív STING antagonisták mechanizmusa az, hogy elfoglalják a kötőhelyet és megzavarják a STING fehérje aktivációs konformációját [20,21]. A hSTING-re specifikusan az antagonisták "nyitott" konformációban hagyják a hSTING dimert. A Glide dokkoló segítségével meghatároztuk a humán STING CTD (PDB ID kód 6MXE) és a legjobb hatóanyag 11 közötti kölcsönhatást. A dokkoló szerkezetben a két 11 vegyület részben párhuzamos egymással, és a hasadék alján helyezkedik el. a hSTING dimer (8a. ábra), amely a hSTING-et inaktív nyitott konformációba zárja (S2 ábra). A 11-es vegyület főként hidrofób kölcsönhatásokat hoz létre, a ligandum triciklusos szerkezete több érintkezést tesz lehetővé az alsó zsebben lévő határfelülettel. A DMXAA-hoz vagy a CMA-hoz hasonlóan a karboxilcsoport hidrogénkötést képez a T263 oldalláncával, míg a ketocsoport hidrogénkötést képez a T267 oldalláncával. A C2-helyzetben lévő metoxicsoport szoros kölcsönhatásba lép az S162-vel, ami ligandum-ligandum közelséget eredményez egymáshoz. A bisz-metil szubsztituensek nemcsak ligandum-ligandum kölcsönhatásokat generálnak, hanem kényelmesen elhelyezkednek a felső zseb bejáratánál is, ami megakadályozza a természetes STING agonisták kulcsmaradékokhoz való kötődését (8b. ábra).
7. ábra. A 11. és 27. széles spektrumú STING-kötők STING antagonisták. (a) A 11-es és 27-es vegyületek kémiai szerkezete és a STING-inhibitorok gátló hatása mind az m-, mind a h-STING-útvonalakkal szemben. A különböző koncentrációjú vegyületekkel előkezelt 293T sejteket (mSTING vagy hSTING) 20,30 -cGAMP stimulálta; az IRF útvonal aktivitásának gátlását közvetetten az optikai denzitás (OD) értékekkel mértük. A dózisfüggő gátlási görbét illesztettük a vegyületek IC5{27}} értékének kiszámításához. (b) A 11. és 27. számú vegyületek gátolhatják a hSTING kettős útvonalának aktiválását. A THP1-hSTING-R232 riporter sejtvonalakat 20,30 -cGAMP-val stimuláltuk, és a vegyületekkel kezeltük, gátolva az IFN-indukciót (az aktivitást a Lucia luciferáz relatív fényegységei (RLU) alapján értékelve). ) és a proinflammatorikus citokin indukció (a SEAP aktivitásának nyomon követése OD-értékekkel mérve). (c) Az új analógok alacsony citotoxicitást mutatnak a kovalens inhibitorhoz képest. A 293T (vagy THP-1 sejteket) a megadott koncentrációjú inhibitorokkal inkubáltuk a jelzett ideig. A sejtek életképességét CellTiter-Glo kitekkel mértük. A bemutatott adatok három független kísérlet átlagai. NS (nincs szignifikáns) p > 0,05, *** p < 0,001. a p értékeket kétirányú t-próbával számítottuk ki.
8. ábra: STING fehérjéhez kötött 11 vegyület dokkoló szerkezete. (a) A 11. vegyület kötési módja. A kötött ligandum szürke színben látható, az egyes STING alegységek a szimmetrikus dimerben zölddel és lilával láthatók. A STING monomer kötőzsebeiben az alja bíbor színű, a teteje zöld. (b) A 11 vegyület intermolekuláris érintkezései a STING-hez kötődnek. A 11. vegyületet és az érintkeztetett STING aminosavakat pálcás modellként mutatjuk be. Az intermolekuláris érintkezőket és a hidrogénkötéseket sárga szaggatott vonal jelzi. Az A és B felső index fehérje monomer vagy egyedi ligandum azonosságot jelez.
3. Megbeszélés
A STING mechanizmusáról és kristályszerkezetéről szóló kiterjedt jelentések fényében lehetőségünk van megmagyarázni azt a tudományos problémát, hogy a DMXAA miért nem rendelkezik emberi STING agonista aktivitással. Ebben a tanulmányban a különböző STING kristályszerkezetek összehasonlításával érdekes eredményeket kaptunk: 1. A STING aktiválási konformációja stabil; 2. Különféle aktiválási mechanizmusok léteznek a hSTING és az mSTING számára; 3. A DMXAA és a CMA a kötőhely alján található, megkülönböztetve őket más agonistáktól. Tekintettel az mSTING és a hSTING különböző aktiválási mechanizmusaira, az alsó zsebben található DMXAA vagy CMA mSTING agonisták nem tudnak aktiválódni a hSTING-ben, mivel az apo-hSTING nagyobb kötőüreggel rendelkezik, amely megakadályozza, hogy a ligand az R238-hoz kapcsolódjon.
Gao et al. beszámoltak arról, hogy egyetlen mutáció (G230I, S162A és Q266I) a hSTING-et ugyanolyan DMXAA-érzékenységgel ruházza fel, mint az mSTING [33]. Az MD szimulációk kimutatták, hogy a fedél régió mutációja G230I oldallánc elegendő egy sztérikus gát kialakításához a DMXAA kiürülésének megakadályozására, míg a DMXAA könnyen kilép a hSTING WT-ből [27]. A kötőhely hSTING pontmutációinak (S162A/Q266I) megfelelő szerkezeti módosulás alapján jelentős DMXAA és CMA analógok állnak rendelkezésre, de nem voltak erős hSTING agonisták. Ennek az lehet az oka, hogy a "természetes" és a "mutált" hSTING-ek közötti finom szerkezeti eltérés döntő szerepet játszhat a felismerési folyamatban. MD szimulációkon keresztül Che et al. azt találták, hogy a természetellenesen mutált hSTING-ek megzavarják a vízmolekulák összehangolt mozgását, és megváltoztatják a ligandumkötéskor kiürített víz mennyiségét, ami jobban elősegíti a hSTING DMXAA aktiválásának helyreállítását [31].
Az alsó kötőhelyen található STING-gátlók tanulmányozásán felbuzdulva [21] megkockáztatjuk, hogy az ugyanabban a régióban található DMXAA-t új STING-inhibitorokká lehet átalakítani. Egy korábbi tanulmányban finom szerkezeti módosításokkal egyesítettük a DMXAA és a CMA szerkezetét, és sikeresen felfedeztük a 3-at és a 4-et, amelyek képesek kötődni a hSTING-hez, de gyenge STING agonista aktivitásuk nem egyezik kötőképességükkel. Ebben a cikkben a tervezési ötlet az, hogy tovább erősítsük a DMXAA analógok érintkezését az alsó zsebbel, hogy versenyképesen ellenálljanak a 20,30 -cGAMP kötésének, ezért megterveztük és szintetizáltuk a 3. és 4. vegyület optimalizált szerkezetét.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Az első szűrési lépés a biokémiai aktivitás tesztelése volt több STING variáns kötőkészletével, hogy jellemezzük az új származékok kötőképességét. A kötődési vizsgálatok eredményei igazolták tervezési irányaink megalapozottságát; a 11-et és a 27-et széles spektrumú STING-kötőként azonosítottuk (a 3-nál és a 4-nél jobb), és megvitattuk a SAR-okat. A 3. vegyület analógjainál a C1 pozícióban végzett módosítások szignifikánsan javították a különböző STING variánsokhoz való kötődést, míg a C2- módosított vegyületeknek nem volt hatása. A 4-es vegyület azonban nem volt jól tolerálható a C1/C2 szerkezeti módosításokkal szemben. A karbonsav helyzetének áthelyezése után (C4 N-be) megtaláltuk a jobb 11 STING kötőanyagot, és megállapítottuk, hogy a karbonsavcsoport elengedhetetlen az aktivitáshoz. Ezután az összes vegyületet sejtszintű aktivitásra szűrtük három riporter sejtvonal segítségével, és egyik célvegyület sem volt aktív. Ezt követően létrehoztunk egy szűrési módszert a STING-inhibitorokra, és újraszűrtük az összes új analógot. A 11-es és 27-es STING-kötő ágensek mikromoláris gátló aktivitást mutattak, a kompetitív kötődési vizsgálattal összehasonlítható adatokkal. A kovalens H151 inhibitor valamivel jobb STING gátló aktivitást mutatott, mint a 11 és 27 in vitro. Ezenkívül azt is igazoltuk, hogy a 11 és 27 hatékonyan gátolja a STING kettős útvonalának 20,30 -cGAMP által kiváltott aktiválását. A leglenyűgözőbb az, hogy a 11. és a 27. számú vegyület magas koncentrációban tartja fenn a sejtek életképességének magas szintjét, ami a H151 esetében nem lehetséges. A citotoxicitás gyakori probléma a kovalens inhibitorokkal, és korlátozza a H151 alkalmazását.
A dokkoló elemzéssel betekintést nyertünk a 11. legjobb hatóanyag aktivitás szerkezeti alapjaiba. A 11-es vegyület tökéletesen elfoglalja az alsó zsebet, inaktív nyitott konformációban tartja a hSTING-et, és így kompetitív módon gátolja a 20,30 -cGAMP kötődését. Az akridin triciklusos gyűrűjének szerkezete kulcsfontosságú a hidrofób kölcsönhatások létrehozásában, ahol a karbonsavcsoport és a ketoncsoport rögzíti a vegyületet a zseb alján. Azt gyanítjuk, hogy a metoxi bensőséges asszociációkat hoz létre az S162-vel, ami a fehérje konformációját marginálisan lezárja, de nem eléggé ahhoz, hogy agonista konformációvá alakítsa. A bisz-metil szerkezet térbeli blokkolást hoz létre, amely fokozza a ligand-ligandum kölcsönhatásokat, és csökkenti az agonista bejutását a felső zsebbe. Jelenleg nem számoltak be az mSTING és a STING antagonisták ko-kristályos szerkezetéről, így nem tudjuk megmagyarázni a 11-es vegyület és az mSTING hatásmechanizmusát dokkoló megközelítéssel. Feltételezzük azonban, hogy két lehetőség van: az egyik az, hogy a működési elv azonos a hSTING-éval; a másik az, hogy a 11-es vegyület az mSTING-et aggregáltabb apo-konformációban tartja, és a 20,{12}}cGAMP nem tud belépni a zsebbe, hogy agonista hatást fejtsen ki. Összefoglalva, a gyengébb STING agonisták finom szerkezeti optimalizálása sikeresen megfordította a biológiai funkciót a STING inhibitorok felfedezése érdekében. Ezek az eredmények illusztrálják a STING kötőzsebek összetettségét, és új kutatási betekintést nyújtanak a STING agonisták vagy inhibitorok gyógyszerfejlesztéséhez.
4. Anyagok és módszerek
4.1. Kémia
A szintézishez használt oldószereket és reagenseket a Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd.-től (Peking, Kína) szereztük be. A termékek szerkezetét 1H és 13C-NMR spektroszkópiával azonosítottuk (JNM-ECA-400, Japán). A termékek molekulatömegét nagyfelbontású tömegspektrometriával (HRMS) mértük, ionizációs módként elektrospray ionizációval (ESI) (Agilent 1260-G6230A, Németország). A vegyületek NMR- és tömegspektrumai a Kiegészítő anyagokban találhatók. A 35–38. vegyületeket mi szintetizáltuk és azonosítottuk; Kérjük, olvassa el a korábban közölt cikket a részletekért [23].
Etil-{{0}}(2-metoxi-3,4-dimetil-9-oxoakridin-10 (9H)-il)-acetát (1{ {25}}): 4-metoxi{{10}},3-dimetil-anilin (6) (0,97 g, 6,4 mmol) és 2-bróm-benzoesav (7) (1,29 g, 6,4 mmol) DMF-ben (6 ml) szobahőmérsékleten, ezután porított réz-t (005 g) adtunk hozzá, Cu2O ({{60}.05 g) és K2CO3 ({{186}},71 g, 5,1 mmol). A reakcióelegyet 11 °C-on 12 órán át melegítettük. Az oldószereket vákuumban eltávolítjuk, majd a maradékot 25 ml 1 N NaOH-oldatban oldjuk. A nyersterméket a szűrlet tömény sósavval savanyítása utáni kicsapással kapjuk. HCl. Szárítás után a nyersterméket Eaton-reagenshez (5 ml) adtuk szobahőmérsékleten, majd az elegyet 1 órán át 90 °C-on melegítettük. A lehűtött reakcióelegyet telített vizes NaHC03-oldatba csepegtetjük. A csapadékot szűrjük, hogy összegyűjtsük a nyers terméket. A maradékot szilikagél oszlopkromatográfiás eljárással tisztítva 0,61 g (37,7%-os hozam) halványsárga szilárd anyagot kaptunk. NaH (1,43 mmol) és 9 (0,33 g, 1,3 mmol) DMF-fel (5 ml) készült oldatát szobahőmérsékleten 1 órán át kevertük, majd 5-7 °C-ra hűtöttük. A kapott elegyhez 0,43 g (2,6 mmol) etil-bróm-acetátot adunk, és szobahőmérsékleten 20 órán át folyamatosan keverjük. A reakció befejeződése után (TLC) a reakcióelegyet jeges vízbe (15 ml) öntjük. A képződött csapadékot kiszűrjük, szárítjuk, majd kloroformmal extraháljuk. Az oldószer lepárlása után nyers észtert kapunk, amelyet átkristályosítással tisztítunk, így 0,33 g (76%-os hozam) (10) vegyületet kapunk sárga szilárd anyag formájában. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,30 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,75-7,67 (m) 1H), 7,57-7,50 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J, 1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J {116},1 Hz, 3H). 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) 8 (ppm): 169,25, 157,87, 155,96, 147,46, 146,72, 135,46, 132,15, 130,17, 132,15, 130,17, 129,15, 130,17, 129,21,8,8,8,8,8,8,8, 157,87, 155,96, 147,46, 146,72. 19,46, 95,26, 72,06, 61,28, 56,06, 14,59 , 14,34, 13,77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ C20H21NO4-re számítva: 339,3910, talált: 340,1546. 2-(2-metoxi-3,4-dimetil-9-oxoakridin-10(9H)-il)ecetsav (11): 10 vegyületet (0,37 g, 1,1 mmol) és NaOH-t (0,05 g, 1,3 mmol) etanolban (20 ml) és vízben (2 ml) 60 °C-on melegítünk 1 órán át. Az oldószerek eltávolítása után a kapott maradékot vízben oldjuk és szűrjük. A szűrlet konc. HCI-oldattal az elegyet szűrtük, így nyers szilárd anyagot kaptunk, majd metanolból átkristályosítottuk, így 0,29 g (85,7%-os hozam) (11) vegyületet kaptunk halványsárga por formájában. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 10,51 (s, 1H), 8,33 (d, J {1H, 9 Hz, 1H), 8,04 (d, J {},5 Hz, 1H) 7,69 (s, 1H), 7,67-7,62 (m, 1H), 7,45 (t, J {226}},8 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C-NMR (101 MHz, DMSO-D6) 8 (ppm): 159,04, 155,63, 147,47, 146,64, 134,86, 131,52, 129,56, 128,98, 129,56, 128,98, 129,56, 128,98, 125,21, 5, 5, 5, 5. 01.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C18H17NO4 képletre számítva: 311,3370, talált: 312,1229.
{{0}}klór-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (25): 6-karboxi-4-metoxi-2,3-dimetil-benzolanium (14) (1,3 g, 6,4 mmol) és 2-(2-bróm-4-klór-fenil)-ecetsav (15) (1,6 g, 6,4 mmol) DMF-ben (6 ml) szobahőmérsékleten, majd porított réz-t adtunk hozzá. (0.05 g), Cu2O (0.0}5 g) és K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). A reakcióelegyet 12 órán át 110 °C-on melegítettük. Az oldószereket vákuumban eltávolítjuk, majd a maradékot 25 ml 1 N NaOH-oldatban oldjuk. A nyersterméket a szűrlet tömény sósavval savanyítása utáni kicsapással kapjuk. HCl. Szárítás után a nyersterméket Eaton-reagenshez (5 ml) adtuk szobahőmérsékleten, majd az elegyet 1 órán át 90 °C-on melegítettük. A lehűtött reakcióelegyet telített vizes NaHC03-oldatba csepegtetjük. A csapadékot szűrjük, hogy összegyűjtsük a nyers terméket. A maradékot szilikagél oszlopkromatográfiás eljárással tisztítva 0,80 g (38,6%-os hozam) sárga szilárd 25. vegyületet kaptunk. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,17 (d, J =8,1, 1,5 Hz, 1H), 7{68}} (d, J=6,9 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C18H14CIN03 képletre számítva: 327,7640, talált: 328,0734. 4-klór-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]akridin{105}} ,6(2H)-dion (26): Ennek a vegyületnek a szintézise hasonló volt a 25-ös vegyülethez. A 15-ös vegyületet 2-(2-bróm-5-klór-fenil)-ecetsavval (16) cseréltük ki. 0,82 g (26) képletű vegyületet kaptunk halványsárga szilárd anyag formájában 38,7%-os hozammal. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 7,73 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 2,36 (s, 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C18H14CIN03 képletre számítva: 327,7640, talált: 328,0734.
{{0}}fluor-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]akridin{ {9}},6(2H)-dion (27): Ennek a vegyületnek a szintézise hasonló volt a 25-ös vegyülethez. (17). Mélysárga 27 szilárd anyagot kaptunk 0,84 g-mal (42,1%-os hozam). 1H-NMR (4{83}}0 MHz, DMSO-D6) 8 8,21 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,23 (d, J {{39}). },5 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C18H14FNO3 képletre számítva: 311,3124, talált: 312,1030. 4-fluor-8-metoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]akridin-1 ,6(2H)-dion (28): Ennek a vegyületnek a szintézise hasonló volt a 25-ös vegyülethez. A 15-ös vegyületet 2-(2-bróm-5-fluor-fenil)-ecetsavval (18) helyettesítettük. 0,81 g mélysárga szilárd anyagot kapunk (40,5%-os hozam). 1H-NMR (400 MHz, DMSOD6) 8: 7 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C18H14FNO3 képletre számítva: 311,3124, talált: 312,1030.
4,8-dimetoxi-9,10-dimetil-6H-pirrolo[3,2,1-de]akridin-1,6(2H) )-dion (29): Ennek a vegyületnek a szintézise hasonló volt a 25-ös vegyülethez. A 15-ös vegyületet 2-(2-bróm-5-metoxi-fenil)-ecetsavval (19) cseréltük ki. {{20}},73 g sárga szilárd anyagot kaptunk 35,2%-os kitermeléssel. 1H-NMR (4{88}}{92}} MHz, DMSO D6) 8 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C19H17NO4 képletre számítva: 323,348{132}} talált: 324,1230. 7-metoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9,10-dihidroakridin-4-karbonsav (33): oldatba 6-karboxi-4-metoxi-2, 3-dimetil-benzolanium (14) (1,30 g, 6,4 mmol) és 2-bróm-benzoesav (7) (1,29) g, 6,4 mmol 6 ml DMF-ben, szobahőmérsékleten, ezután porított Cu (0,05 g), Cu2O (0,05 g) és K2C03 (0,71 g, 5,1 mmol) hozzáadása következik. A reakcióelegyet 12 órán át 110 °C-on melegítettük. Az oldószereket vákuumban eltávolítjuk, majd a maradékot 25 ml 1 N NaOH-oldatban oldjuk. A nyersterméket a szűrlet tömény sósavval savanyítása utáni kicsapással kapjuk. HCl. Szárítás után a nyersterméket Eaton-reagenshez (5 ml) adtuk szobahőmérsékleten, majd az elegyet 1 órán át 90 °C-on melegítettük. A lehűtött reakcióelegyet telített vizes NaHC03-oldatba csepegtetjük. A csapadékot szűrjük, hogy összegyűjtsük a nyers terméket. A maradékot szilikagél oszlopkromatográfiás eljárással tisztítva halványsárga szilárd anyagként (1,} g, 52,7%) (33) vegyületet kaptunk. 1H-NMR (4{114} MHz, DMSO-D6) 8 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J {},7 Hz, 1H), 7,69 (d , J=8,5 Hz, 1H), 7,48 (t, J{131}},0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,32 (s, 3H) 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C17H15NO4 képletre számítva: 297,3100, talált: 298,1073. 2,7-dimetoxi-5,6-dimetil-9-oxo-9,10-dihidroakridin-4-karbonsav (34): ennek a vegyületnek a szintézise hasonló volt a 33-as vegyülethez. A 7-et 2-bróm-5- metoxi-benzoesavval (30) cseréltük ki. A sárga szilárd anyagból 1,05 g terméket kapunk 50,2%-os kitermeléssel. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 12,96 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ a C18H17NO5 képletre számítva: 327,3360, talált: 328,1179.
4.2. Biológiai vizsgálat
Az egér STING kötőkészleteket, a humán STING WT kötőkészleteket, a humán AQ STING kötőkészleteket és a humán H232 STING kötőkészleteket a Cisbio cégtől vásároltuk. A 293T mSTING (ISG/KI-IFNb) sejteket, a 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb) sejteket, a THP1-KI-hSTING-R232 sejteket, a THP1-KO-STING sejteket a következőtől vásároltuk Invivogen. A 293T mSTING sejteket és a 293T hSTING-R232 sejteket DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4,5 g/l glükóz (Sigma-) felhasználásával tenyésztettük. Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL{26}} µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen, San Diego, CA, USA), és szelektív antibiotikumokkal (Invivogen) kiegészítve blaszticidin (10 uM), higromicin (100 uM) és zeocin (100 uM). A THP1-KO-STING sejteket és a THP1-KI-hSTING-R232 sejteket RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES alkalmazásával tenyésztettük. (Sigma-Aldrich), 10% hővel inaktivált FBS (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen), és szelektív antibiotikumokkal (Invivogen) kiegészítve blaszticidinnel ( 10 uM) és zeocin (100 uM). A QUANTI-Blue oldatot, a QUANTI-Luc, 20,{53}}cGAMP-t az Invivogentől vásároltuk. A H151-et a Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd.-től (Peking, Kína) szereztük be. A CellTiter-Glo lumineszcens sejt életképességi vizsgálati készletet a Promegától szereztük be.
4.2.1. HTRF STING Binding Competitive Assay
A STING kötőkészletek utasításai szerint a következő oldatokat adtuk egymás után a 384-lyuklemez minden üregébe: 5 µL detektáló vegyület vagy 2 0,30 -cGAMP (pozitív kontroll) ) különböző koncentrációjú vagy hígítószerrel (negatív kontroll); 5 µl humán STING 6His-címkézett fehérje (negatív kontroll mérőhelyet adtunk a kimutatási pufferhez); 10 µL STING ligandum d2 és Anti 6His-Tb{11}} előkevert munkaoldat. A lemez lezárása és szobahőmérsékleten 3 órás inkubálás után a fluoreszcencia értékeket 665 nm-en és 620 nm-en olvastuk le. A két fluoreszcencia intenzitás (665 nm/620 nm) arányát használtuk a vegyületek kötőképességének becslésére. Az IC50 (50%-os gátló koncentráció) értékeket a GraphPad Prism szoftverrel számítottuk ki.
4.2.2. Celluláris vizsgálat a vegyületek agonista aktivitásra történő szűrésére
180 µl mennyiségű 293T mSTING sejtet, 293T hSTING-R232 sejtet és THP1-KOSTING sejtszuszpenziót osztottunk el 96-üreges lapos fenekű lemezeken, amelyek sűrűsége ~50,000 sejt volt. /lyuk (293T) vagy ~100,{12}} sejt/lyuk (THP1). 20 µl sóoldatot vagy egy tesztvegyület sóoldatát, vagy pozitív referenciaként 20,{16}}cGAMP-ot adtunk hozzá, és a sejteket 37 ◦C-on, 5% CO2 mellett 48 órán át inkubáltuk. Ezt követően 20 µl felülúszót adtunk egy 96-üregű lapos fenekű lemezre, majd 180 µl QUANTI-Blue oldatot minden egyes lyukba. A lemezt 37 ◦C-on 3 órán át inkubáltuk, majd a SEAP szinteket (az IRF útvonal aktivitását) spektrofotométerrel határoztuk meg 620-655 nm-en.
4.2.3. Celluláris vizsgálat a vegyületek gátló aktivitásra történő szűrésére
Előkísérlet: 180 µl 293T mSTING sejtet, 293T hSTING-R232 sejtet (~50,000 sejt/lyuk) stimuláltunk 48 órán keresztül 37 ◦C-on 5%-os CO2 inkubátor 10 µL 20, 30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) és 10 µL H151 (1.{68}} µM) ). Ezt követően 20 µl felülúszót adtunk egy 96-üregű lapos fenekű lemezre, majd 180 µl QUANTI-Blue oldatot minden egyes lyukba. A lemezt 37 ◦C-on 3 órán át inkubáltuk, majd a SEAP szinteket (az IRF útvonal aktivitását) spektrofotométerrel határoztuk meg 620-655 nm-en. 180 µl 293T mSTING sejtből, 293T hSTING-R232 sejtszuszpenziót osztottunk el 96-lyukú lapos fenekű lemezeken ~50,000 sejt/lyuk sűrűséggel. 10 µl 2 0, 30 -cGAMP (3,125 µM) és a 11. vegyület vagy a 27. vegyület (0,78 µM, 1,56 µM, 3,13 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 01,0 µM, 12,5 µM, 0 µM, 27 µM) µM) vagy H151-et (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) adtunk hozzá, és a sejteket 37 °C-on 48 °C-on 48 °C-on inkubáltuk. Ezt követően 20 µl felülúszót adtunk egy 96-üregű lapos fenekű lemezre, majd 180 µl QUANTI-Blue oldatot minden egyes lyukba. A lemezt 37 ◦C-on 3 órán át inkubáltuk, majd a SEAP szinteket (az IRF útvonal aktivitását) spektrofotométerrel határoztuk meg 620-655 nm-en. Az IC50 értékeket GraphPad szoftverrel számítottuk ki.
4.2.4. Celluláris vizsgálat a STING kettős út gátlására
180 µl THP1-KI-hSTING-R232 sejtszuszpenziót osztottunk el 96-lyukú lapos fenekű lemezeken, amelyek sűrűsége ~100,000 sejt/lyuk volt. 10 µL 20,30 -cGAMP-t és 10 µl 11. vegyületet (20 µM) vagy 27. vegyületet (33 µM) vagy H151-et (2 µM) adtunk hozzá, és a sejteket 37 ◦C-on 5%-os koncentrációban inkubáltuk. CO2 24 órán át. Ezt követően egy 96-üregű fehér (átlátszatlan) lemezbe egy bizonyos mennyiségű felülúszót adtunk, majd QUANTI-Luc vagy QUANTI-Blue oldatot minden lyukba, és a lumineszcenciaszinteket vagy SEAP-szinteket a gyártó utasításai szerint leolvastuk. Ez lehetővé teszi az IFN szabályozó faktor (IRF) útvonal egyidejű tanulmányozását a Lucia luciferáz és az NF-κB útvonal aktivitásának felmérésével, a SEAP aktivitásának monitorozásával.
4.2.5. CellTiter-Glo lumineszcens sejtéletképességi vizsgálat
A sejtek életképességét CellTiter-Glo lumineszcens sejt életképességi vizsgálati kittel mértük a gyártó utasításai szerint. Röviden, a sejteket három különböző koncentrációban (5 µM, 10 µM, 100 µM) a 11. számú vegyülettel, 27. vegyülettel vagy H-151-val inkubáltuk 48 órán át. 100 µl CellTiter-Glo reagenst adtunk egy 96-lyuk vizsgálati lemezre 10 percre, majd a lumineszcenciát feljegyeztük.
4.3. A 11. vegyület molekuláris dokkolása
Az STING komplex kristályszerkezetét (PDB ID: 6MXE) a Protein Data Bank bejegyzéséből vettük, és kiindulási pontként használták. A fehérjét a Maestro Protein készítményével állítottuk elő, és A láncra és B láncra osztották fel. A Receptor Grid Generation segítségével létrehoztunk egy kötőhelyet a STING monomer LBD-jében az eredeti ligandum (Merck-18) alapján. A molekuláris dokkolási részhez a Glide-dokkolás SP pontosságát használtuk, lehetővé téve a 11-es vegyület legfeljebb 20 póz létrehozását. Végül 16 kötött konformációt állítottunk elő (mind az alsó zsebben), és teszteltük a komplexek kötési szabad energiáját a Schrödinger szoftverében található Prime MM-GBSA modul segítségével. Ezenkívül a dokkolási pontszám, a siklásmodell pontszáma és az MMGBSA dG kötési pontszáma alapján kiválasztottuk azt az optimális konformációt, amely kettőben első, egyben pedig harmadik helyen végzett (lásd az S2 táblázatot). Végül egyesítettük az A és B láncok legjobb konformációit, hogy megkapjuk a teljes dokkoló szerkezetet.
Hivatkozások
1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING A citoplazmatikus DNS felismerése serkenti a sejtvédelmet. Mol. Cell 2013, 50, 5–15. [CrossRef]
2. Wu, J.; Sun, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ A ciklikus GMP-AMP endogén másodlagos hírvivő a citoszolikus DNS általi veleszületett immunszignálban. Tudomány 2013, 339, 826–830. [CrossRef]
3. Abe, T.; Barber, GN citoszolikus DNS-közvetített, STING-függő gyulladásos génindukció kanonikus NF-κB aktiválást tesz szükségessé a TBK1-en keresztül. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [CrossRef]
4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ A cGAS-cGAMP-STING útvonal a citoszolikus DNS érzékelésében és jelzésében. Mol. Cell 2014, 54, 289–296. [CrossRef] [PubMed]
5. Gao, D.; Li, T.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ A ciklikus GMP-AMP szintáz saját DNS általi aktiválása autoimmun betegségeket okoz. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]
6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR A cGAMP daganatellenes aktivitása a cGAS-cGAMP-STING-IRF3 által közvetített veleszületett immunválasz stimulálásán keresztül. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA DNS-érzékelés a cGAS-STING útvonalon az egészségben és a betegségekben. Nat. Genet tiszteletes. 2019, 20, 657–674. [CrossRef]
8. Zhang, H.; Te, QD; Xu, XL Interferongének célzási stimulátora (STING): Az orvosi kémia perspektívája. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [CrossRef]
9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. A 30 3 0 -ciklikus GMP-AMP-t specifikusan lebontó foszfodiészterázok azonosítása és jellemzése. Cell Res. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]
10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF A gazdaszervezet STING útvonala a rák és az immunitás határfelületén. J. Clin. Investig. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]
11. Baguley, Kr. e.; Ching, LM DMXAA: Egy antivaszkuláris szer több gazdaválaszra. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503–1511. [CrossRef]
12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fan, X.; et al. Véletlenszerű, III. fázisú, placebo-kontrollos vizsgálat a karboplatinnal és a paklitaxellel a Vadimezan (ASA404) érromboló szerrel vagy anélkül, előrehaladott nem-nem kissejtes tüdőrákban. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [CrossRef]
13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; Monks, B.; Jin, T.; Xiao, TS; et al. Az egér, de nem az emberi STING, kötődik és jeleket ad válaszul az 5. érrendszert megrontó anyagra, a 6-dimetil-xanthenon-4-ecetsavra. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]
14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ A rákellenes flavonoidok egérszelektív szúró agonisták. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]
15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. A CMA vírusellenes kis molekulájú vegyület fajspecifikus kimutatása STING segítségével. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [CrossRef]
16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Szisztémás aktivitású amido-benzimidazol STING receptor agonisták tervezése. Természet 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]
17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; et al. Egy szisztémás STING-aktiváló nem nukleotid cGAMP mimetikum daganatellenes hatása. Tudomány 2020, 369, 993–999.
18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Ügető, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Cash, B.; et al. Orálisan beszerezhető, nem nukleotid STING agonista daganatellenes hatással. Science 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]
19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andrew, L.; Iris, A.; Rebecca, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Egy új, emberspecifikus STING agonista jellemzése, amely vírusellenes aktivitást vált ki a feltörekvő alfavírusok ellen. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]
20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Sun, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. A STING-inhibitorok a ciklikus dinukleotidkötő zsebet célozzák. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]
21. Siu, T.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Ho, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. A STING inaktív formájának új cGAMP kompetitív ligandjának felfedezése. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]
22. Haag, SM; Gülen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. A STING megcélzása kovalens kismolekulájú inhibitorokkal. Természet 2018, 559, 269–273. [CrossRef]
23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Sun, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Az akridonanalógok, mint új STING receptor agonisták tervezése, szintézise és biológiai értékelése. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Ouyang, S.; Dal, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; et al. A STING Adapter Protein szerkezeti elemzése feltárja a hidrofób dimer interfészt és a ciklikus di-GMP kötés módját. Immunity 2012, 36, 1073–1086. [CrossRef] [PubMed]
25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. A ciklikus di-GMP-hez kötött STING szerkezete feltárja a ciklikus dinukleotidok immunrendszer általi felismerésének mechanizmusát. Nat. Struktúra. Mol. Biol. 2012, 19, 722–724. [CrossRef]
26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. A ciklikus di-GMP STING általi érzékelésének és megkötésének szerkezeti alapja. Nat. Struktúra. Mol. Biol. 2012, 19, 728–730. [CrossRef]
27. Shih, AY; Damm-Ganamet, KL; Mirzadegan, T. Dinamikus szerkezeti különbségek az emberi és az egér STING között, ami a DMXAA iránti eltérő érzékenységhez vezet. Biophys. J. 2018, 114, 32–39. [CrossRef]
28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. STING-aktiváció szerkezet-funkció elemzése c[G(20,50)pA(30,50)p]-vel és célzás antivirális DMXAA-val. Cell 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]
29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Az STING TBK1-gyel való kötődésének és foszforilációjának strukturális alapja. Természet 2019, 567, 394–398. [CrossRef]
30. Vavˇrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavˇrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Protein-ligand kölcsönhatások a STING kötőhelyén, racionálisan megtervezett egypontos mutációkkal vizsgálva: Kísérlet és elmélet. Biochemistry 2021, 60, 607–620. [CrossRef] [PubMed]
31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; Hosszú, ZR; Igen, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Egyetlen mutációk átalakítják a DMXAA-Human STING komplexum strukturális korrelációs hálózatát. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]
32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE A cGAS veleszületett immun-DNS-érzékelő olyan nemkanonikus ciklikus dinukleotidot állít elő, amely aktiválja az emberi STING-et. Cell Rep. 2013, 3, 1355–1361. [CrossRef] [PubMed]
33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; A Patel, DJ Binding-Pocket és Lid-Region helyettesítések az emberi STING-et érzékennyé teszik a fajspecifikus DMXAA gyógyszerre. Cell Rep. 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]
34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. C7-funkcionalizált DMXAA-származékok, mint potenciális humán STING-agonisták tervezése, szintézise és biológiai értékelése. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]
