1. rész A Cistanche Deserticola fenil-etánozid hatásai a β-amiloid fehérje expressziójára az APP / PS1 transzgénikus egerek hippokampuszában

1. rész A Cistanche hatékony összetevői: a teljes fenetil-alkohol-glikozidok és szóbaskoskovidok terápiás hatása az Alzheimer-kórra

További információk: Ali.ma@wecistanche.com

JU Bo-wei1 ,YANG Jian-hua2 ,HU Jun-ping3*

1 A Hszincsiang Orvostudományi Egyetem ötödik kapcsolt kórháza, Urumqi 830000, Kína;

2 A Hszincsiangi Orvostudományi Egyetem első kapcsolt kórháza, Urumqi 830054, Kína;

3 Gyógyszerészeti Iskola, Hszincsiang Orvostudományi Egyetem, Urumqi 830011, Kína

Elvont:

A Cistanche deserticola fenil-etánoidnak az alzheimer-kórban szenvedő egerek hippokampuszában lévő β-amiloid fehérje expressziójára gyakorolt hatásának tanulmányozásához 60 6 hónapos APP/ PS1 kettős transzgenikus AD egereket véletlenszerűen modellcsoportokra osztották, donepezil csoport ( 0. 65 mg/kg), a magas, középső, alacsony dózisúösszes glikozida Cistanche deserticola (250,125 62. 5 mg/kg) és az aktozid( 125 mg/kg) gyógyszereit és desztillált vizet adtak 3 hónapig. 9 hónapos korukban a Morris vízlabirintus és passzív elkerülési teszteket alkalmazták a tanulási és memóriazavarok meghatározására, az egerek hippokampális elváltozásait HE festéssel figyelték meg, és az egerek hippokampuszában lévő Aβ1-42 és Aβ1-40 fehérjék expresszióit immunhisztokémiai módszerrel de- tesztelték, és Western-blot módszer.Cistanche deserticola fenil-etánoidjelentősen bizonyítani tudja a hippokampális neuronok tanulási és memóriaképességét, valamint károsodását AZ APP / PS1 kettős transzgénikus egerekben. A modellcsoporthoz képest az Aβ1-42, Aβ1-40 pozitív sejtek száma a hippokampusz CA1-ben a hippokampusz CA1-benCistanche deserticolacsoport és a kontrollcsoport szignifikánsan csökkent, és a Western-blot eredményei azt mutatták, hogy az Aβ1-42, Aβ1-40 fehérje expressziója a Cistanche deserticola hippokampuszában minden dóziscsoportban és az intervenciós csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a modellcsoportban. fő hatékony alállás aCistanche deserticolaaz AD-ellenes tevékenység gyakorlására, amely elméleti támogatást nyújt az AD elleni új gyógyszerként való továbbfejlesztéséhez.

Kulcsszavak:Cistanche deserticola; fenil-etánoid;Alzheimer-kór; APP/ PS1 kettős transzgénikus egerek; β-amiloid fehérje

Kattintson a Cistanche tubulosa porra Alzheimer-kór esetén

Alzheimer-kóregy központi idegrendszeri degeneratív betegség, amelyet progresszív memóriavesztés és kognitív diszfunkció jellemez. Jelenleg a jól ismert β-amiloid fehérje (Aβ) kaszkád hipotézise úgy véli, hogy az Aβ1-42 és Aβ1-40 monomerek normál metabolitjai fiziológiai körülmények között nem neurotoxikusak, de amikor APP exogén mediátorokkal találkoznak, rendellenességeket okoznak. A lerakódás után a felhalmozódott Aβ1-42 oldható Aβ oligomereket (ADDL- eket) képez, amelyek megakadályozzák, hogy a monomerek védőaktivitást produkáljanak, és neuronális degenerációt, szinapszisveszteséget és axonkárosodást okoznak, és végül neuronális apoptózist okoznak az agyban, hogy demenciát okozzanak, így kulcsfontosságú célpontjai, az Aβ1-42 és az Aβ1-40 fehérje expressziójának vizsgálata az agyban nagy jelentőséggel bír azCistanche fenil-etánoid glikozidokKr. u. Ugyanakkor az AD állatmodellek agyában lévő jellegzetes elváltozások hippokampuszának kórszövettani vizsgálatának tanulmányozása valóban tükrözheti a makroszkopikus nézetből az agyban lévő elváltozások gyógyszereinek javulását.

A hagyományos kínai orvoslás hazámban úgy véli, hogyCistanche, egy hagyományos kínai orvoslás, amely táplálja a vesét és táplálja az esszenciát, öregedésgátló, öregedésgátló és javítja a memóriát. Számos előzetes tanulmány megerősítette, hogy aCistanche és Acteoside fenil-etánoid glikozidjai, a fenetil-alkohol-glikozidok reprezentatív monomerje, nyilvánvaló antagonista hatást fejt ki az AD-re a hagyományos módszerekkel felépített in vivo vagy in vitro modellekben, és bizonyos mértékben megelőzi és kezeli a neurodegenerációt. A szexuális betegségek lehetősége. A Cistanche Acteoside APP/PS1 kettős transzgenikus modelljének alkalmazását azonban nem használták fel az AD megelőzésével és kezelésével kapcsolatos kutatások elvégzésére a β-amiloid szempontjából.

Összefoglalva, ez a tanulmány az AD patogenezis klasszikus hipotézisén alapul - Aβ kaszkád reakció hipotézis, egy ideális és megbízható AD állatmodell segítségével APP / PS1 kettős transzgenikus egerek, mint in vivo kutatási platform, Morris vízlabirintus és HE festési módszer, western-blot, immunhisztokémia és más fejlett technikai módszerek segítségével, az állati viselkedés szempontjából, kórszövettani és molekuláris biológia Annak érdekében, hogy új célokat találjunk az AD megelőzésére és kezelésére, referenciát nyújt a Cistanche fenil-etánoid glikozidok specifikus hatásmechanizmusának tanulmányozásához az AD megelőzésében és kezelésében.

1. Reagensek és műszerek

1.1 Reagens

Cistanche tubulosa fenil-etánoid glikozidok(a kutatócsoport saját készítésű, a fenil-etánoid-glikozidok tartalma 87,6%);Acteoside; titán-dioxid; HE festőkészlet; semleges gumi; SDS-PAGE gélkészítő készlet; BCA fehérje mennyiségiítő készlet; Aβ1-40; Aβ1-42; β-aktin; Lúgos foszpáz címkével ellátott nyúl kecskeellenes IgG (H + L); 4 × fehérjebetöltő puffer β-merkaptoetanolt tartalmaz; 10 × TBST; PVDF membrán; SDS; Tris; glicin; sovány tejpor; BCIP / NBT készlet; másodlagos antitest; Tween 20.

1.2 Állatok

60 6 hónapos APP/PS1 dupla transzgenikus AD modell egerek

És 10 alom-negatív egér, férfi és nőstény, testtömege 20 ± 10 g, az állatok szabadon esznek és isznak a kísérlet során.

1.3 Készülék

MT-100 Morris vízlabirintus; gél képalkotó; RM2016 betegség

mikrotómia; SIM-F124 jégkészítő; gél elektroforézis és transzfer membrán berendezések; teljes hullámhosszú mikrolemez-olvasó; CO2 állandó hőmérsékletű inkubátor; 4° C-os és -20°C-os hűtőszekrény; 67120 ultratiszta vízi műszer

; TP-114 elektronikus egyenleg; alacsony hőmérsékletű hűtött nagy sebességű centrifuga; DVKW-D-2 digitális kijelző elektromos fűtés állandó hőmérsékletű vízfürdő; ultrahangos sejtzavaró; WD-9405A decolorizáló rázógép; állítható állandó feszültség és állandó áramellátó rendszer; DM4000 fluoreszkáló fordított mikroszkóp.

2. Módszer

2.1 Állatok csoportosítása és alkalmazása

Az SPSS18 szerint. 0 Statisztikai szoftverek által generált véletlenszámok, 1156 Natural Products Research, and Development Vol. 31AD modell egereket véletlenszerűen osztottak modellcsoportra és donepezil csoportra (napi infúzió)

A gyomor dózisa 0. 65 mg/kg), Cistanche fenetil-alkohol összes glikozid (PhG) magas, közepes és alacsony dózisú csoportok (a napi gavage dózisok 250, 125, 62,5 mg/kg), Cistanche verbascoside intervenciós csoport (125 mg/kg) kg), csoportonként 10. 6 hónapos korban az egereket csoportok szerint intragasztrikus gavage kezelésben részesítették, és az egereket intragasztrikusan adták be naponta egyszer, 3 egymást követő hónapban. A normál csoport nem transzgénikus egerekből állt ugyanabban az alomban. A modellcsoport és a normál csoport azonos térfogatú desztillált vizet kapott a gavage által.

2.2 Morris vízlabirintus kísérlet

A klasszikus Morris vízlabirintust az egerek térbeli tanulási és memóriaképességének tesztelésére használták. Az első és a második napon képezze ki az egereket, hogy megismerjék a peron helyzetét, és gyakorolják a peron megtalálását. A 3.-5. napon a hivatalos tesztet úgy végezzük el, hogy megfigyeljük az egerek helyzetét minden egyes csoportban, akik edzés után keresik a platformot. A 6. napon a platform eltávolításra kerül, és az egereket megfigyelik.

Úszópálya. A kísérlet során a kamera egyszerre rögzíti az egér által a platform keresésével töltött időt (azaz a menekülési késleltetést) és az úszópálya távolságát. Ha az egér nem talál platformot a beállított időtartományon belül (általában 60 s-re vagy 120 másodpercre van állítva, ez a kísérlet 60 másodpercet használ), akkor az egér menekülési késleltetését rögzítik beállított értékként, és a személyzet néhány másodpercig a platformon marad (ebben a kísérletben 10 másodpercet használunk), hogy segítsen elmélyíteni a platform memóriáját. A kísérlet után jegyezze fel az egerek úszási idejét a vízbe való belépéstől a platform megtalálásáig. A kísérlet utolsó napján a platformot eltávolították, és a beállított idő alatt rögzítendő tartalom főként azt tartalmazta, hogy az egér hányszor haladt át a platformon, a célkvadráns tartózkodási idejét stb., És elemezték az egyes kísérleti állatok keresési stratégiáját.

2.3 Agyszövet extrakció és paraffin beágyazás

A beadás után az egereket megmértük, és az egereket 10% klór-hidráttal érzéstelenítettük. Helyezze az érzéstelenített egeret a műtőasztalra a végtagok rögzítéséhez. 4% paraformaldehid-perfúzió és rögzítés után az állatokat feláldozták, a kisagyot és más extra agyszöveteket eltávolították, és az egész kisagyot és az agyat eltávolították az agyfélteke végén.

A központi korona első fele. Rögzítsük 4% -os paraformaldehidben 24 órán át, mossuk át ultratiszta vízzel 10 percig, majd tegyük 30% etanolba (1 óra) → 40% etanolba (1 óra) → 50% etanolt (1 óra) → 75% etanolt (1 óra) ) → 90% etanolt (1 óra) → 95% etanolt (1 óra) → vízmentes etanolT I(1 óra) → vízmentes etanolt II (1 óra) → xilol I (15 perc) → xilol II (15 perc). Miután 2 órán át paraffinba merítettük, a szöveteket az egér agyának hippokampuszának CA1 területén folyamatos koronális szakaszokba ágyazták be. 60 °C-on 48 órán át szárítva szárítva, szobahőmérsékleten tárolandó.

2.4 HE festés

Süssük az egyes csoportokban kiválasztott szeleteket 60 °C-os kemencében 40 percig, majd tegyük xilol-I-be (5 perc) → xilol-II-be (10 perc) → abszolút etanolt (5 s) → 95% etanolT (5 s) → 95% etanol II(5 s) → 80% etanolt (5 s) → desztillált vízben

Másodszor, használja a HE festőkészletet a csúszdák festésére és semleges gumival történő felszerelésére.

2.5 Immunhisztokémiai festés

Az előkészített részeket immunhisztokémiai festésnek vetettük alá a viaszmentesítés, az antigén visszanyerés, az endogén kataláz blokkolása, a szérumblokkolás, az elsődleges antitest inkubálás, a másodlagos antitest inkubálás, a DAB színfejlődés, a dehidratáció és a szerelés standard lépéseinek megfelelően. Válasszon 6 megfelelő szeletet minden csoporthoz, figyelje meg a neuron finomságát az elektronmikroszkóp alatt

Sejtmorfológia, színezés, és számolja meg a hippokampális pozitív sejtek számát az Image J szoftver segítségével.

2.6 A fehérje expressziójának nyugati foltelemzése

Aspiráljuk a szöveti felülúszót, hogy meghatározzuk az agyszövet hippokampuszából kivont fehérjetartalmat a BCA fehérje mennyiségi meghatározási módszerének megfelelően. Keverjük össze 4× fehérjetöltő pufferrel 4:1 arányban, melegítsük 95 °C-on 10 percig, hűtsük le természetesen, és tároljuk hűtőszekrényben -20 °C-on. Készítsük el az SDS-PAGE gélt, adjuk hozzá az elektroforézis oldatot, majd egymás után adjuk hozzá a normál csoportot, a gyógyszer intervenciós csoportot és más hisztonokat, és adjuk hozzá a Marker fehérjét a géllyukakhoz mindkét oldalon. Állítsa le az elektroforézist a jégfürdőben az elválasztó gél aljára. Miután az átviteli membrán folyadéka kiegyensúlyozott, vágja ki a PVDF membránt és a szűrőpapírt a ragasztó méretének megfelelően. Az átviteli bilincsben kövesse a fekete szálszőnyeg lépéseit, → 3 réteg szűrőpapírt → gélt → PVDF membránt → 3 réteg szűrőpapírt → fekete szálszőnyeget az összeszereléshez. A buborékok eltávolítása után vigye át a membránt 80 V-os állandó nyomáson. Miután a filmátvitel befejeződött, a sovány tejet 2 órán át lezárjuk. A hígított antitestet hozzáadjuk a megfelelő membránhoz és inkubált éjszakához. Miután a másodlagos antitestet 2 órán át inkubáltuk, adjunk hozzá BCIP/NBT színképző oldatot, amíg a szín ki nem fejlődik. A BIO-RAD gélképalkotó képeket készít. Az Image J szoftver segítségével kvantitatívan elemezheti a célfehérje-sávot, és az IOD segítségével jelezheti a fehérjesáv relatív erősségét. Az eredményt a célfehérje és a kontrollfehérje integrált optikai sűrűségértékének β-aktin arányában fejezzük ki. Az eredményt (célfehérje-azonosító/belső referencia-azonosító) 100%-×-ban fejezzük ki.

2.7 Az adatok statisztikai elemzése

Használja az SPSS18-at. 0 Végezze el az adatok statisztikai elemzését. Az adatokat (x± s ) jelöli. A csoportok közötti adat-összehasonlítás az egyirányú ANOVA tesztet és elemzést használja, az adatok többszörös összehasonlítása pedig az LSD-t-tesztet (legkevésbé jelentős különbség, LSD). ), P-vel<0. 05="" or="" p=""><0. 01="" means="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

3 Kísérleti eredmények

3.1 Morris vízlabirintus-érzékelési eredmények

Ahogy a betanítási idő tovább növekszik, az egerek minden csoportjának a platform elérésére rendelkezésre álló ideje (menekülési késleltetés) jelentősen lerövidül. Az első és a második nap a képzési idő. A harmadik napon a modellcsoport escape-késése lényegesen hosszabb volt, mint a normál kontrollcsoporté (P<0.01); the="" fourth="" and="" fifth="" days="" were="" compared="" with="" the="" normal="" control.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" escape="" latency="" of="" the="" mice="" in="" the="" donepezil="" group="" was="" significantly="" shorter="" than="" that="" of="" the="" model="" group="" (p=""><0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" glycosides="" of="">cistanchefenetil-alkohol Minden adagcsoportban ésAktenzoidészekcsoportban, ahogy az adag nőtt, az egerek menekülési késleltetése jelentősen lerövidült, jelentős különbségekkel (P<0.05) (see="" table="">

A vízlabirintus kísérlet 6. napján a platformot eltávolították egy űrkutatási kísérlethez, és feljegyezték, hogy az egerek egyes csoportjai hányszor lépték át a peronhelyzetet 60 másodpercen belül. Az eredményekből látható, hogy a modellcsoportban a platformon való átkelés hányszor fordult elő a megadott időn belül, jelentősen csökkent a normál csoporthoz képest (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" total="" glucoside="" groups="" and="" mullein="" the="" number="" of="" times="" of="" crossing="" the="" platform="" in="" the="" glycoside="" group="" was="" significantly="" increased="" (p=""><0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 2).="" the="" above="" research="" results="" all="" suggest="" that="">Cistanche fenil-etánoid glikozidokjelentősen javíthatja az APP/PS1 kettős transzgénikus AD egerek tanulási és memóriaképességét, és bizonyos dózisfüggetlenséggel rendelkezik.

3.2 Patológiai szövetfestés megfigyelési eredményei

Az eredmények azt mutatják, hogy a normál csoportban a hippokampusz CA1 területén lévő neuronok szépen és szorosan vannak elrendezve, egyenletesebben oszlanak el, tiszta rétegekkel, és a csigolyatest sejtmagja nagyobb, és az alakja megközelítőleg kerek. A modellcsoport egerek hippokampuszának CA1 területe azonban megsérült, ami nyilvánvaló változásokat eredményezett az idegsejtekben és a morfológiában, az elrendezés laza és kaotikus volt, nem volt nyilvánvaló hierarchia, a sejtek közötti kapcsolatok lazaak voltak, és néhány mag pyknosisnak és apoptózisnak tűnt, így a festés mélyebb lett. A hippokampális CA1 sejtek a különböző dózisokCistanche fenetanolozidbeavatkozási csoport, donepezil csoport és szó szerinti beavatkozási csoport egyaránt különböző mértékben javult. A pyknotikus és mélyen festett neuronális sejtek jelentősen csökkentek a modellcsoporthoz képest, de a nagyobbak még mindig láthatók az intercelluláris térben (lásd az 1. ábrát).

3.3 Az immunhisztokémiai kísérlet eredményei

A Cistanche fenetil-alkohol-glikozidokkal végzett kezelés után egy kilenc hónapos APP/PS1 kettős transzgénikus egér agyszövet-szakaszt vettünk, és a hippokampális CA1 területet Aβ1-40 immunhisztokémiai festésnek vetettük alá. Az eredmények azt mutatták, hogy a pozitív sejtek többnyire kör alakúak voltak a látótérben A sejtmembránok többsége barnás-sárga. A normál csoporthoz képest az Aβ1-40 pozitív sejtek száma a modellcsoport hippokampusz CA1 területén jelentősen nőtt (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" phenethyl="" alcohol="" glycosides="" of="">Cistanche tubulosamagas volt. A közepes dózisú csoportban és az Acteoside glikozid csoportban a pozitív sejtek száma jelentősen csökkent (P<0.01), the="" donepezil="" group,="" and="" the="">Cistanche fenil-etánoid glikozidokalacsony adag.

Az Aβ1-40 pozitív sejtek száma a dóziscsoportban jelentősen csökkent (P<0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 3,="" figure="">

A Cistanche fenil-etánoid glikozidok beavatkozása után a 9 hónapos APP/PS1 kettős transzgénikus egerek agyszöveteit vettük, és a hippokampális CA1 területet Aβ1-42 immunhisztokémiai festéssel festettük meg. Az eredmények a következőket mutatták: A modellcsoporttal összehasonlítva,Cistanche fenil-etánoid glikozidokA pozitív sejtek száma a glikozidok és az Acteoside glikozid csoport minden egyes dóziscsoportjában jelentősen csökkent, jelentős különbséggel (P<>

3.4 Western-blot vizsgálati eredmények

A western-blot módszert az Aβ1-40 és az Aβ1-42 fehérje expressziójának kimutatására használtuk egerek hippocampusában. Az eredmények azt mutatták, hogy az Aβ1-40 és az Aβ1-42 fehérje expressziója a modellcsoport hippokampuszában szignifikánsan felfelé szabályozott volt a normál csoporthoz képest, és szignifikáns különbség volt (P< 0.="" 05).="" the="" protein="" expressions="" of="" hippocampus="" aβ1-40="" and="" aβ1-42="" in="" mice="" in="" the="" intervention="" group="" of="">Cistanche fenil-etánoid glikozidésverbascosideaz intervenciós csoport szignifikánsan lefelé szabályozott volt a modellcsoportba tartozó egerekhez képest (P<0.01), and="" there="" was="" a="" significant="" difference="" (p=""><0.01). 01),="" see="" figure="">