Az ellenoldali nefrektómia időzítésének és az ischaemiás állapotoknak a hatásai a vesefibrózisra egyoldali vese ischaemia-reperfúziós sérülés után
Oct 27, 2023
Bevezetés
Az előfordulásaakut vese sérülés(AKI) drámaian megnövekedett világszerte az elmúlt években [1]. Az AKI-t a klinikai gyakorlatban szervátültetés, posztoperatív perfúzió, vérzés, dehidráció, sokk és szepszis okozhatja [2]. A legújabb epidemiológiai és kísérleti vizsgálatok kimutatták, hogy az AKI súlyossága, gyakorisága és időtartama szorosan összefügg a későbbikrónikus vesebetegség(CKD). Az AKI utáni vesefibrózis CKD-hez vagy akárvégstádiumú vesebetegség(ESKD) [3–5], ami arra utal, hogy az AKI és a CKD összefüggő szindrómák [6]. Az AKI-ról a CKD-re való átmenet hátterében álló mechanizmusok azonban számos kísérleti és klinikai vizsgálat ellenére ismeretlenek. Az állatmodellek fontos eszközök az AKI CKD-hez vezető mechanizmusainak vizsgálatához. A vese ischaemia-reperfúziós sérülése (IRI) az AKI egyik fő oka, és az IRI által kiváltott AKI számos állatmodelljét fejlesztették ki [7], beleértve a bilaterális IRI (bIRI) modellt, az egyoldali IRI modellt ép ellenoldali vesével. , az uIRI modell egyidejű ellenoldali nephrectómiával és az uIRI modell késleltetett kontralaterális nephrectómiával.
A bIRI modell kevésbé konzisztens, mivel ha mindkét vese ischaemiás károsodása túl enyhe, hosszú távon nincs jelentős fibrotikus változás. Ha az AKI túl súlyos, az egerek elpusztulhatnak az akut sérülés fázisában. Továbbá a két vese sérülésében mutatkozó kis különbségek néhány hét elteltével jelentős különbségekhez vezethetnek a krónikus vesepatológiájukban [8,9]. A szimultán ellenoldali nephrotomiával járó uIRI modell hasonló a bIRI modellhez, mivel a másik oldali nephrectomia miatt csak a sérült vese marad meg [10]. Az ép kontralaterális vesével rendelkező IRI modellben az ischaemiás vese fibrózisa súlyos [11,12]. Ez a modell nagyon konzisztens és megbízható a kutatók hosszú távú megfigyelésére. Az ellenoldali sértetlen vese jelenléte miatt azonban nem használható a becsült glomeruláris filtrációs ráta (eGFR), szérum kreatinin (SCr) és vér karbamid-nitrogén (BUN) értékelésére [11–14]. A fent említett két uIRI modellhez képest a késleltetett ellenoldali nephrectómiával rendelkező uIRI modell kiküszöböli ezeket a problémákat, és mind az AKI utáni hosszú távú megfigyelésekre, mind a vesefunkció monitorozására használható. Ezért ez a modell alkalmas az AKI-CKD átmenet vizsgálatára [15].
KATTINTSON IDE, HOGY KÉRJEN CISTANCHE KIVONATOTAKUT VESE SÉRÜLÉS
Mindazonáltal a különböző ischaemiás állapotok, valamint az ellenoldali nephrectomia és az uIRI közötti intervallum jelentős hatással lehetnek a CKD progressziójára és súlyosságára AKI után. A korábbi tanulmányok az ischaemiás időtartamnak az AKI utáni vesefibrózisra gyakorolt hatására összpontosítottak, és nem fordítottak nagy figyelmet a test maghőmérsékletére az ischaemia során. Például Skrypnyk et al. [12] az ischaemiás hőmérsékletet 38 C-on szabályozta vízfürdős rendszerrel, 30 perces ischaemiás időtartammal, és az ellenoldali ép vesét 8 nappal az uIRI után eltávolították. Az eredmény azt mutatta, hogy az ischaemiás vese jelentős fibrotikus változásokat mutatott 28 nappal az uIRI után. Ugyanilyen ischaemiás időtartammal Xiao et al. [8] kimutatta, hogy szignifikáns fibrotikus változások következtek be 11 nappal az uIRI után, amikor az ischaemiás hőmérsékletet 37 C 38 C-on tartották, és az uIRI és az ellenoldali nephrectomia közötti idő 10 nap volt. Egyes kutatók, mint például Colombaro et al. [14] és Li et al. [16] tanulmányaikban nem említették az ischaemiás hőmérsékletet.
Eközben kevesen kutatták az ellenoldali nephrectomia és az uIRI közötti időintervallum hatását ebben a modellben, ami nagyon eltérő eredményeket eredményezett a különböző laboratóriumokban, ami drámai hatással volt a későbbi kísérletekre is. Ebben a tanulmányban az AKI utáni vesefibrózist befolyásoló fő tényezők hatását vizsgáltuk, beleértve az ellenoldali nephrectomia és az uIRI közötti időtartamot, az ischaemia alatti maghőmérsékletet és az ischaemiás időtartamot. Célunk volt referenciát adni egy megfelelő állatmodell elkészítéséhez az AKI CKD átmenet tanulmányozásához
Anyagok és módszerek Állatmodellek
Hím C57BL/6J egerek (8-10 hetesek, körülbelül 22 g súlyúak; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Kína) ingyenes hozzáférést kaptak élelemhez és vízhez a Shanxi Orvosi Egyetem Állatkísérleti Központjában. A szaporodási feltételek a következők voltak: páratartalom 40-70%, hőmérséklet 23 C, levegő tisztasági osztály 7, szabályozott 12-h fény/sötét ciklus kórokozómentes körülmények között, takarmány Co60 besugárzás és tisztított víz. A vizsgálathoz szükséges összes eljárást jóváhagyta a Shanxi Orvosi Egyetem Második Kórházának Állat-etikai Bizottsága (etikai szám: DW2022028).
Protokollok
Tekintettel arra, hogy az ischaemiás időtartamok, az ischaemia során fellépő maghőmérséklet és az ellenoldali, nem sérült vese reszekciós időpontjai mind hatással lehetnek az AKI és az azt követő vesefibrózis súlyosságára, a fenti három tényező hatását külön-külön vizsgáltuk, a másik kettőt rögzítettük. Három kísérletet végeztünk az alábbiak szerint.
1. protokoll: Az ellenoldali nephrectomia és az uIRI közötti intervallum veseműködésre és az AKI utáni fibrózisra gyakorolt hatásának megfigyelésére a bal vese ischaemiás idejét 24 percben rögzítettük, a test maghőmérsékletét pedig 37 C-on rögzítettük a vese alatt. eközben ischaemia. A jobb vese reszekcióját a 7., a 10. és a 14. napon végeztük (n ¼ 8 csoportonként) a bal vese IRI után. Korábbi vizsgálatok eredményei [8,10,12,15] és a kísérlet előtti eredményeink alapján határoztuk meg az ischaemia és a vesereszekció időtartamát. A vizsgálati protokollt lásd az 1(A–C) ábrán.
2. protokoll: Az ischaemia alatti maghőmérséklet AKI-CKD átmenetre gyakorolt hatásának megfigyelésére a bal vese ischaemiás idejét 24 percben rögzítettük, és a jobb vesét 14 nappal a bal vese IRI után eltávolítottuk. A test maghőmérsékletét 36 C-on, 36,5 C-on, 37 C-on, 37,5 C-on és 38 C-on szabályoztuk (n ¼ 8 csoportonként). A vizsgálati protokollt lásd az 1(D) ábrán.
3. protokoll: A vese ischaemiás időtartamának az AKI-ról a CKD-re való átmenetre gyakorolt hatásának megfigyelésére az ischaemia során a test maghőmérsékletét 37 C-on rögzítettük, és 14 nappal a bal vese IRI után eltávolítottuk a jobb vesét. Azért választottuk ezt az időpontot, mert a vesefibrózis, amely az AKI után a CKD-re jellemző változás volt, nagyon nyilvánvaló volt a jelentések [8, 10, 12, 15] és a kísérlet előtti eredményeink szerint. A bal vese ischaemiás idejét 21 perc, 24 perc, 27 perc és 30 perc értékben szabályoztuk (n ¼ 8 csoportonként). A vizsgálati protokollt lásd az 1(E) ábrán.
A bal vese IRI után 8 héttel minden egeret elaltattunk. A bal vese szövetének egy részét 70 C-on tároltuk a későbbi RT-PCR és Western blot analízishez, a másik részét pedig semleges formalinban fixáltuk kórszövettani analízishez. Vérmintákat vettünk a retro-orbitális sinuszon keresztül biokémiai vizsgálat céljából.
1. ábra. Az unilaterális ischaemia-reperfúziós sérülés (uIRI) protokolljai késleltetett kontralaterális nephrectómiával. (A–C): A bal vesét a 0. napon vetettük alá IRI-nek, és a jobb vese reszekcióját különböző időpontokban (7. nap, 1. nap0. és 14. nap) ischaemiás időtartammal. 24 percre fixált maghőmérséklet mellett 37 C-on rögzítették a vese ischaemia során. (D): A bal vesét a(z) 0 napon IRI-nek vetettük alá, és a jobb vese reszekcióját különböző testmaghőmérsékleteken (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C és 38 C) végeztük az ischaemiás betegséggel. a bal vese idő 24 percben rögzített, és a jobb vesét 14 nappal a bal vese IRI után eltávolítottuk. (E): A bal vesét a 0. napon vetettük alá IRI-nek, és a jobb vese reszekcióját különböző ischaemiás időtartamokban (21 perc, 24 perc, 27 perc és 30 perc) végeztük, miközben a test maghőmérsékletét 37 C-on rögzítettük a vese alatt. ischaemia, és a jobb vesét 14 nappal a bal vese IRI után eltávolítottuk. A vese súlyát, a vesefunkciót, a vese szövettani sérülését és a vese fibrózisát az 56. napig értékelték.
Sebészeti eljárás
A műtét előtt az összes egér 12 órán át éheztetett, szabad hozzáférés mellett, és 3%-os pentobarbitál-nátriumot injektáltunk 50 mg/kg intraperitoneálisan. Az altatás során a rektális hőmérsékletet 36 C-on, 36,5 C-on, 37 C-on, 37,5 C-on, illetve 38 C-on tartottuk a különböző kísérleti csoportokban. Ennek elérése érdekében az egeret a hátával egy fűtőpárnára helyezték (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, Kína) úgy, hogy a feje és a nyaka kinyújtva legyen, hogy biztosítsa a légút megtartását. akadálytalanul, és a szemeket meleg sóoldattal fedjük le, hogy elkerüljük a kiszáradást az eljárás során. Érzéstelenítés után az egér bal hátsó részén lévő szőrt a hajvágóval leborotválták. A műtéti területen lévő bőrt ezután 75%-os alkoholos törlőkendővel törölték le. Általában az egér testhőmérséklete a szőrborotválkozás után csökken. A sebészeti beavatkozást a test maghőmérsékletének állandósulása után végeztük, ami körülbelül 15 percig tarthat. A bal vesét úgy lehetett látni, hogy a bal háti bőrt 0,5 cm-re a középvonal mellett, és 0,5 cm-rel az egér bordaívének alsó szélénél levágjuk. Ezután egy kézzel megszorítottuk a bal hasat, hogy a bal vese kikerüljön a testüregből, tompa ívelt csipesszel felemeltük a vesét (ügyelve, hogy ne sérüljön meg a vese), leválasztottuk a vesefejet és gyorsan befogtuk, majd felhelyeztük a befogott. vese a bőr alá, hogy melegen és nedvesen tartsa. A sikeres ischaemiát a vese vörösről sötétlilára történő fokozatos színváltozása jellemezte, ami 21 percig, 24 percig, 27 percig és 30 percig tartott a különböző kísérleti csoportokban. A vese színe a bilincs elengedése után 2-5 percen belül visszaváltozott vörösre. Ezután réteges varratokkal lezártuk a hasüreget. Különböző kísérleti csoportokban a jobb háti bőrt és az izmot az uIRI után a 7., a 10. és a 14. napon bemetszették, és a jobb vesét kimetszették. Ezután zárja le a sebet szokásos varratokkal. Minden műtét után 500 l sóoldatot fecskendeztünk intraperitoneálisan a műtét során fellépő folyadékveszteség kompenzálására. Ugyanakkor az egeret körülbelül 2–3 órán keresztül melegítőpárnán tartottuk, amíg teljesen eszméletére nem került, mielőtt áthelyezték volna a tartóketrecbe. Az ál-csoport nem szorította be a vesefejet, és a többi sebészeti beavatkozás megegyezett az uIRI csoportéval. Valamennyi sebészeti beavatkozást ugyanaz a személy végezte, aki több mint 2 éves tapasztalattal rendelkezik a modell üzemeltetésében.
Vesefunkció vizsgálat
Az SCr szinteket a Creatinine Kit (Jaffe Method, 100020170, Biosino Biotechnology and Science) segítségével mérték. A BUN szinteket az Urea Kit (Urease-Glutamate Dehydrogenase Method, Biosino Biotechnology and Science) segítségével mérték.
Vesetömeg-vizsgálat
A vizelés után az egerek testtömegét precíziós elektronikus mérleggel mértük. A friss veséket háromszor öblítettük le előhűtött sóoldatban, majd a veséken lévő felesleges vizet szűrőpapírral itattuk le. A vesekapszulákat a jégen lehántották és a veséket azonnal lemérték. A vese tömegének a testtömeghez viszonyított arányát kiszámítottuk a korrigált vesetömeg mg/g-ban történő értékeléséhez.
Hematoxilin-eozin (HE) festődés és vesekárosodás pontszáma
A semleges formalinnal fixált veseszöveteket rutinszerűen dehidratáltuk, paraffinba ágyaztuk, metszettek (3 lm), és HE-vel festettük, hogy megfigyeljük a veseszövetek károsodását. Az egyes szakaszok vesekéregének tíz véletlenszerűen kiválasztott mezőjét fénymikroszkóppal rögzítettük 400-os nagyítással. Két patológus külön értékelte a glomerulus és a vesetubulusok sérülését. A tubuláris sérülést egy {{20}}–4-es skálán értékelték a következő kritériumok alapján [17]: 0, nincs sérülés; 1, a veseterület 1-25%-át érinti; 2, a veseterület 26–50%-át érinti; 3, a veseterület 51-75%-át érinti; és 4, a veseterület 75-100%-át érinti. A tubuláris sérülés mértékét félkvantitatívan értékeltük a vese tubuláris sérülésének területének kiszámításával. A glomeruláris sérülést 0-4-ig terjedő skálán értékelték és pontozták a mesangialis expanzió vagy sclerosis százalékos területe szerint, a következő kritériumok alapján [17]: 0, normál glomerulusok; 1, a terület 1-25%-a sérült; 2, a terület 26–50%-a sérült; 3, a terület 51–75%-a sérült; és 4, a terület 76–100%-a sérült. A végső glomeruluskárosodás pontszáma ¼ 0 (0. fokozatú glomerulusok százaléka) þ 1 (1. fokozatú glomerulusok százaléka) þ 2 (2. fokozatú glomerulusok százaléka) þ 3 (3. fokozatú glomerulusok százaléka) þ 4 (4. fokozatú glomerulusok százaléka). Egerenként több mint 50 glomerulust értékeltek.
Masson-féle trikróm festés
A semleges formalinnal rögzített veseszöveteket rutinszerűen dehidratáltuk, paraffinba ágyaztuk, metszeteket (3 lm) vágtunk, és Masson-féle trikrómmal megfestettük, hogy megfigyeljük a vesefibrózist. Masson trikrómmal festett szeleteiben a vesekéreg húsz nem átfedő mezőjét rögzítették 200-as nagyítással. Az automatikus méréshez és elemzéshez az Image-Pro Plus képelemző szoftvert használtuk. A fibrotikus terület százalékát használták a vese intersticiális fibrózis szintjének meghatározásához [8].
RT-PCR
Az egyes csoportok veseszövetéből a teljes mRNS-t Trizollal extraháltuk és megmértük annak koncentrációját, majd cDNS-vé alakítottuk (Taka Reverse Transcription Kit). A Taqman fluoreszcens módszert (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) alkalmaztuk a fibronektin (FN) és a kollagén I (COL-I) RNS expressziójának mennyiségi meghatározására a veseszövetekben. Specifikus primereket használtunk az FN-hez (előre: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 és fordított: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30 ), valamint a COL-I-hez (előre: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} és fordítva: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (szolgáltató: Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kína). Az amplifikációs körülmények a következők: 95 C 30 s, 95 C 5 s, 60 C 30 s, 40 ciklus; 95 C 10 másodpercig, 65 C 5 s és 95 C/5 C. A termékek amplifikációs görbéinek és oldhatósági görbéinek elemzése után a relatív mRNS szinteket összehasonlító CT módszerrel (2-DDCt) határoztuk meg. 18SrRNS-sel (előre: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 és fordított: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) belső referenciaként.
Western blot
A veseszövetek líziséhez Radio-immuno-precitation-assay (RIPA) lízispuffert használtunk, és a fehérje koncentrációját BCA módszerrel határoztuk meg. Gradiens gélelektroforézissel választottuk el a fehérjéket 50 lg mintából. Ezután a fehérjéket nitrocellulóz membránra vittük át. 5%-os zsírmentes tejjel 2 órás blokkolást követően a membránokat egy éjszakán át 4 °C-on blottoltuk nyúl anti-egér monoklonális antitesttel a-simaizom aktin (a-SMA) ellen (1:1000, No.19245, Cell Signaling Technology). ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) vagy COL-I (1:1000, No.72026, Cell Signaling Technology). A következő napon a membránokat 0,5 órán át szobahőmérsékleten újra felmelegítettük. TBST-vel történő mosás után a membránokat HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-nyúl IgG-vel (H þ L) (1:1000, No.BA1054, BOSTER Biological Technology) inkubáltuk 2 órán át. Miután ismét TBST-vel mostuk, ultra-nagy érzékenységű ECL kemilumineszcens reagenssel festettük meg az immunblotokat. A b-aktint ugyanazon a membránon mértük, mint a belső referencia. A fehérjeexpressziót a célfehérjék és a b-aktin relatív expressziójának számszerűsítésével határoztuk meg.
Adat- és statisztikai elemzés
Az összes vizsgált adatot átlag ± standard deviációban fejezzük ki. A két csoport összehasonlítása független t-próbával történt. A több csoport közötti összehasonlításokat egyutas ANOVA-val tudtuk elérni, ha az adatok eloszlása normális, és a variancia homogén, a Welch ANOVA-t használtuk a statisztikai szignifikancia értékelésére, ha a variancia heterogén volt, majd Tukey post hoc tesztjét többszörös összehasonlításra. Minden statisztikai elemzést a GraphPad Prism 8.{3}} szoftverrel végeztünk. p < 0,05 volt statisztikailag szignifikáns.
Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb cisztanche exportőre:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Vásároljon további specifikációkért:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
