A bőr pigment melanin felhalmozódása következtében a bőr sötétedik. Ennek leküzdésére a kereskedelemben kapható bőrvilágosító szerek amplitúdója, amelyek többsége gátolja a melaninszintézist. A melanin elszíntelenítése a bőr világosításának alternatív módja. Ebben a tanulmányban megmutatjuk, hogy a lignin-peroxidáz (LiP), az erdőtalajból izolált Phanerochaete chrysosporium NK-1-ból tisztított extracelluláris enzim hatékonyan képes lebontani és színteleníteni a melanint in vitro. A reakciókörülmények optimalizálása érdekében megvizsgáltuk a színtelenítés körülményeit, beleértve a pH-t, a hőmérsékletet, az inkubációs időt, az enzimkoncentrációt és a mediátor hozzáadását. Az eredmények azt mutatják, hogy a pH 3, 40 fok, 15 IU/ml és 10 órás inkubáció volt az optimális körülmény a melanin elszíneződéséhez. A közvetítő, a veratril-alkohol használatát szintén hatékonynak találták a melanin dekolonizálásának hatékonyságának fokozására, akár 92 százalékos elszíntelenítéssel. A pásztázó elektronmikroszkópos eredmények üres tereket mutattak a kezelt melanin szemcséken a kezeletlen mintához képest, ami a melanin lebomlására utal. Változásokat figyeltek meg a melanin ujjlenyomat régiójában. Az 1500-500 cm-1 hullámszámok között például a kezelt melanin 1513, 1464 és 1139 cm-1 CH2, CH3 hajlítása és C-O-C nyúlása esetén új csúcsok jelenléte jelentett szerkezeti változásokat. A színtelenített melaninban egy új csúcsot is kimutattunk 2144 cm-1-nél (alkinil C≡C szakasz). A citotoxicitási vizsgálat kimutatta, hogy a kezelt melanin és LiP alacsony citotoxikus hatással rendelkezik; a veratril-alkohol közvetítője azonban magas mortalitást eredményezhet, ami azt sugallja, hogy a használatát az egészségügyi és bőrápoló termékek összeállításakor alaposan tesztelni kell. A tanulmány eredményei azt sugallják, hogy a Phanerochaete chrysosporium által termelt LiP potenciálisan felhasználható az orvosi és kozmetikai iparban, különösen bioalapú kozmetikai fehérítőszerek kifejlesztésére.

A vonatkozó tanulmányok szerint a cisztán egy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője a cistanozid, amely különféle hatásokkal rendelkezik, mint például antioxidáns, gyulladáscsökkentő és immunfunkciót serkentő. A cistanche és a bőrfehérítés közötti mechanizmus a cistanche glikozidok antioxidáns hatásában rejlik. Az emberi bőrben a melanin a tirozin tirozináz által katalizált oxidációjával keletkezik, az oxidációs reakcióhoz pedig oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak. A Cistanche cisztanozidot tartalmaz, amely antioxidáns, és csökkentheti a szabad gyökök képződését a szervezetben, így gátolja a melanintermelést.

Kattintson a Cistanches Herba For Whitening elemre

További információért:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

A melanin összetett, ellenszegülő és átható policiklikus biopolimer bőrpigmentek csoportja, amelyet speciális bőrsejtek, az úgynevezett melanociták 1,2 termelnek. Elsődleges feladata, hogy megvédje a bőrt a napfény káros UV-sugárzásától azáltal, hogy a bőrsejtek DNS-e körül szupranukleáris kupakokat képez 3. Emellett a különböző szabad gyökök citoplazmán belüli elnyelésével felelős a különböző bőrszínekért. A legtöbb ilyen, természeti erőforrásokból nyert bőrvilágosító szerek a tirozináz enzimek gátlásával, a pigment bioszintézis gátlásával és néhány alternatív útvonalon keresztül gátolják a melanin termelődését a bőrsejtekben. Különféle vegyületeket, például hidrokinont, hidrokinon-mono-benzil-étereket, higanyt, kortikoszteroidokat és arbutint használnak a bőrfehérítő kozmetikumok kereskedelmi formáiban, azonban alkalmazásuk komoly mellékhatásokkal jár. Például a higany a jelentések szerint károsítja a veséket, az ólom pedig szorongást, depressziót és pszichózist 4,5. A kortikoszteroidok alkalmazása Cushing-szindrómát, cukorbetegséget, magas vérnyomást, mellékvese-elégtelenséget, immunszuppressziót, bőr elvékonyodását, pattanásokat, dermatitiszt és hipertrichózist okozhat. 6. Tain et al. (2009) arról számoltak be, hogy az arbutin bőrfehérítő kozmetikumokban történő alkalmazása 3 százalékos koncentrációig volt hatásos, de a koncentráció további növelése citotoxikus hatásokat váltott ki. Figyelembe véve ezeket a korlátokat, ezeknek az inhibitoroknak a bőrfehérítő kozmetikumokban történő alkalmazását széles körben kritizálták az egészségügyi és biztonsági hatóságok. A javaslatok szerint a bőrfehérítő kozmetikumok 2021-re akár 155,44 milliárd USD-t is elérhetnek 4,9 százalékos éves növekedési ütem mellett. A biztonságos és természetes bőrfehérítő szerek iránti világszerte növekvő kereslet miatt az enzimes melanin dekolonizáció nagy érdeklődést váltott ki 7-9.

A mikrobiális extracelluláris enzimeket, például a lakkázt, a mangán-peroxidázt és a lignin-peroxidázt (LiP) korábban tesztelték melanin elszíneződésére, és a mérgező vegyszerek potenciális környezetbarát alternatívájának tekinthetők 1. Ezek közül a LiP nagyon hatékonynak bizonyult a színtelenítésben. A melanin magas redoxpotenciálja miatt oxidálja a veratril-alkoholt (VA), mint a többi rokon enzim. A magas oxidációs potenciál és a melanin hatékony katalízise ellenére a térfogati termelés és a tisztítási nehézségek jelentik a LiP bőrfehérítő szerekben történő kereskedelmi alkalmazásának fő korlátait. Ezenkívül a LiP elveszti enzimaktivitását a melanin dekolonizációjában, feleslegben lévő hidrogén-peroxid alatt, amelyet kritikusnak tartanak a melanin oxidációja szempontjából. A H2O2 fontos szerepe mellett inaktiválja a LiP-t, ezáltal csökkenti az enzim katalitikus teljesítményét.

Eredmények

A melanin elszíneződése a Phanerochaete chrysosporium NK-1 által.A gombatörzseket melanin elszíneződésére tesztelték. A gombákat melanint és LiP-induktorként VA-t tartalmazó szilárd táptalajra foltosan oltottuk be. Hétnapos inkubáció után a Phanerochaete chrysosporium NK-1 megmutatta a melanin elszíntelenítő képességét, amint azt az 1. ábra mutatja.

A melanin optimális elszíneződésének feltételei.pH. A tisztított enzimet a szintetikus melanin in vitro színtelenítésére használtuk. Különböző körülmények hatását a melanin elszíneződésére figyelték meg 10. Először a pH hatását vizsgáltuk a melanin LiP általi elszíneződésére. Ehhez a melanin színtelenítését különböző pH-körülmények között 2.0 és 6,0 között változtattuk 30 fokos hőmérsékleten VA jelenlétében és hiányában 6 órás inkubációs perióduson keresztül. A 2. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy általában a melanin elszíneződése VA jelenlétében minden pH-körülmények között magasabb volt. Különösen szembetűnőbb magasabb pH-értékű körülmények között. A VA segíthet a kationgyökök képződésében 11. Ezeknek a gyököknek sokkal nagyobb redoxpotenciáljuk van, hogy megtámadják a C–C kötéseket nem specifikusan a melaninban, és elszíneződéshez vezetnek 12. VA jelenlétében a legmagasabb, 88 százalékos melanin elszíneződést érték el. pH 3 mellett 71 százalék pH 2-nél, míg a legalacsonyabb, 39 százalékos melanin elszíneződés pH 6-nál volt megfigyelhető. VA hiányában a legmagasabb, 86 százalékos melanin elszíneződés pH 3-on volt megfigyelhető, míg a legalacsonyabb. A melanin 35 százalékos és 36 százalékos elszíneződését figyelték meg 5, illetve 6 pH-értéken. Ebben a vizsgálatban a melanin LiP általi elszíntelenítése nagyon hatékony volt alacsonyabb pH-körülmények között, azaz 2 és 3 (2. ábra), bár más tanulmányok optimális pH-körülményeket mutattak ki 4 1 mellett.

Hőfok. A LiP általi melanin elszíneződését különböző hőmérsékleteken, 20-60 fok között vizsgáltuk VA jelenlétében és hiányában 6 órás inkubációs periódus mellett. VA hiányában hasonló százalékos (19%) melanin elszíneződést figyeltünk meg 20 és 30 fokos hőmérsékleten (3. ábra). A legmagasabb és legalacsonyabb melanin elszíneződést VA hiányában 40 és 50 fokon figyeltük meg. Ha azonban az oldatban van a VA, a melanin elszíneződése 20-ról 40 fokra nőtt, és 60 fokra csökkent. VA jelenlétében a melanin legmagasabb elszíneződése körülbelül 60 százalék 40 fokon. Az elszíneződés általában alacsonyabb, mert a kísérletet enyhébb pH-körülmények között végezték.

LiP koncentráció. A melanin elszíneződését is vizsgálták az enzimkoncentráció változásaival. Öt különböző koncentrációban, azaz 5, 10, 15, 20 és 25 NE/mL LiP-t vizsgáltunk a melanin elszíneződésére VA jelenlétében és hiányában, amint az a 4. ábrán látható. Meglepő módon a leghatékonyabb enzimkoncentráció 15 NE/ml VA-val és anélkül egyaránt. 6 órás inkubációs periódus után a legmagasabb melanin elszíneződés 92 százalékos volt VA jelenlétében és 70 százalék mediátor hiányában 15 NE/ml enzimkoncentráció mellett, míg a legalacsonyabb, 23 százalékos melanin elszíneződést figyeltek meg a VA hiánya 5 NE/mL LiP alkalmazásával. Nem világos, hogy a színtelenítés kevésbé hatékony magas enzimkoncentráció mellett, azaz 20 és 25 NE/ml (4. ábra).

Inkubációs idő. A színtelenítési kísérleteket 2, 4, 6, 8 és 10 órás inkubációval végeztük. Ezeket a reakciókat VA jelenlétében és távollétében is végrehajtottuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a színtelenítés hatékonysága pozitívan korrelál az inkubációs idővel, ahogy az várható volt (5. ábra). A delokalizáció mértékének növekedése a kezdeti inkubációban szembetűnőbb volt. A legmagasabb melanin elszíneződést (68 százalék) 10 órás inkubációs periódus után figyelték meg VA jelenlétében és 59 százalékos VA távollétében. A melanin elszíneződése 15 százalékos volt 2 órás, VA nélküli inkubáció után. Ezért a vizsgálati eredmények alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az optimális feltételek a pH 3, 40 fok, 15 IU/ml és 10 órás inkubáció.

SEM (Scanning elektronmikroszkóp) és FTIR (Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia) elemzések.A melanin morfológiai és szerkezeti változásait SEM-mel, illetve FTIR-rel jellemeztük. A színtelenített melanint SEM-el elemeztük, hogy megfigyeljük a felületi morfológiai változásokat. Kontrollként szintetikus melanint használtunk enzimkezelés nélkül. Amint a 6. ábrán látható, a kezeletlen mintához képest a kezelt melanin szemcséken űr volt, ami arra utal, hogy a melanin részecskéket megtámadta az enzim.

Az elszíntelenedett melanint szintén FTIR-rel elemeztük, kontrollként a kezeletlen melanint (7. ábra). Mind az elszíntelenített, mind a kezeletlen melanin molekuláris ujjlenyomatait megkaptuk, és összehasonlítottuk a kezelt melanin 13 szerkezeti változásának megerősítésére. A melanin (C18H10N2O4) FTIR spektruma széles abszorpciós spektrumot mutatott 3272 cm-1-nél, ami a jellegzetes O-nak tulajdonítható. A karbonsavak és a fenolos csoportok –H nyújtó vagy N–H nyújtó rezgései. A kezelt melanin FTIR spektrumának változásai észrevehetőek voltak. A 3000-3500 cm-1 hullámszámú szélessáv -NH és -OH csoportok jelenlétét jelzi mind a kontroll, mind a kezelt mintákban. A kezelt minta intenzitása azonban szignifikánsan nagyobb, mint a kontrollminta, ami arra utal, hogy a kezelés során ezek a funkcionális csoportok enzimatikus támadások révén hozzáadódtak a szerkezethez. A 2884,4 cm-1 és 2822 cm-1 csúcsok alkilcsoportok jelenlétét jelezték a kontrollban, míg a színtelenített melaninban a 2884,4 cm-1 hullámszámú csúcs hiányzott. A 2822 cm-1-es csúcs 2835,92 cm-1-es hullámhosszra tért el, ami a kezelt melanin szerkezeti változásait jelképezi ebben a régióban is. A 1710 cm-1 hullámszámú csúcs a kontrollban a karbonsav jelenlétének tulajdonítható. Ez a csúcs a színtelenített melaninban is hiányzott vagy nagymértékben csökkent, ami ismét megerősíti a kezelt melanin szerkezeti változásait. Az ujjlenyomat-régióban is történt néhány változás. Az 1500-500 cm-1 hullámszámok között például a kezelt melaninban az 1513, 1464 és 1139 cm-1-nél új csúcsok jelenléte szerkezeti változásokat jelentett. A 2144 cm-1-nél új csúcsot is kimutattunk a színtelenített melaninban.

Citotoxicitási hatások.A lebontott melanin és LiP citotoxicitását a sós garnélarák citotoxicitási módszerével vizsgáltuk 14,15. A jelen vizsgálatban a kezelt melanin és LiP citotoxikus hatásai alacsonyak voltak, a garnélarák lárváinak életképessége 90 százalék vagy annál nagyobb (1. táblázat). A LiP-koncentráció növekedése 80 ul/ml-ig (~80 IU/ml) nem volt hatással a garnélarák lárváinak életképességére, ami alacsony citotoxikus aktivitásra utal. A VA pozitív kontrollokban a mortalitási arány 100 százalék volt, ami arra utal, hogy óvatosan kell eljárni a LiP alkalmazása során, ha az orvosi és kozmetikai területen VA közvetítőként van jelen.

Vita

Hőmérséklet esetén a P. chrysosporium természetes élőhelyének megfelelő 40 fokon érte el a legmagasabb gomba- és enzimtermelést. A LiP melanint lebontó képessége a melanin és a lignin 18 közötti szerkezeti hasonlóságán alapul. A melanin LiP általi lebontásának hatékonysága in vitro összefüggésben van számos tényezővel, így a pH-val, a hőmérséklettel, az enzimkoncentrációval és az inkubációs idővel is. mint a VA létezése. A liP képes oxidálni a VA-t kationgyökeivé (VA∙ plus ), és redox közvetítőként szolgálhat, amely tovább színteleníti a melanint, amint az a 8. ábrán látható.

A H2O2 alapvető szubsztrát, mint végső elektronakceptor a melanin színtelenítése során. A LiP feleslegben könnyen inaktiválódik, ami a hem szerkezet felszakadását vagy az inaktív III vegyület képződését idézi elő. Beszámoltak arról, hogy ezt a gátló hatást a VA oxidációja VA-kationgyökké 1 mérsékelheti. A LiP a VA-t VA-kationgyökökké oxidálja, amelyek redox közvetítőként működnek a melanin színtelenítéséhez. A VA egy természetes vegyület, amelyet fehérrothadás gombákból állítanak elő, és várhatóan kevesebb mellékhatással jár. A VA mediátor jelenléte azonban a vizsgált szervezetek magas mortalitását eredményezte, összehasonlítva a kezelt melanin és LiP alacsony citotoxikus hatásaival. Gondosan tesztelni kell az egészségügyi és bőrápoló termékek összeállítása során.

Anyagok és metódusok

Gombatörzsek izolálása és azonosítása.A gomba izolálása olyan szennyezett területről történt, amelyet hosszú ideig faanyagok lerakására használtak. A mintát steril üvegekbe vettük, és a laboratóriumba vittük tisztítás céljából. A tisztítást tengeri dextróz agar táptalajon végeztük. Négy különböző gombakolóniát izoláltunk és tisztítottunk a mintából. A legjobb törzs szűrése a melanin elszíneződése és biomassza termelése alapján történt, melanin, mint egyetlen szénforrás jelenlétében az ásványi só közegben (MSM). A szűrés alapján a kiválasztott szervezetet az 5.8S rRNS és 18S rRNS DNS-ének szekvenálásával azonosítottuk az ITS-1 és ITS-4 10 univerzális primerekkel. Genomi DNS-üket Anderson és munkatársai módszere szerint extraháltuk. 19. A tisztítást követően a PCR-termékek szekvenálását elvégeztük. A szekvenciákat az NCBI BLAST eszközével igazítottuk, és a homológokat elemeztük filogenezis szempontjából Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) segítségével. A maximális valószínűség alapján az izolált gombatörzs azonosítására szomszédos csatlakozó fát építettünk. A szekvenciákat KX064682.1 hozzáférési számmal nyújtottuk be az NCBI GenBank-hoz. A filogenetikai elemzés kimutatta, hogy a KX064682.1 izolátum a Phanerochaete chrysosporium NK-1 törzse.

Lemezvizsgálat a melanin elszíneződésére.A melanin színtelenítésére a fehérrothadás gombát, a Phanerochaete chrysosporium NK-1-t használták. A Phanerochaete chrysosporiumról ismert, hogy LiP-t termel. A szintetikus melanint (B049-97–6) használtuk modell melaninként az összes melanin színtelenítési kísérletben. A VA 2-t LiP-induktorként tartalmazó módosított tápközeget használtunk a gomba melanin színtelenítő képességének tesztelésére. Petri-csészéket használtak a Phanerochaete chrysosporium NK-1 tenyésztésére. A táptalajt 10 g glükóz, 2 g malátakivonat, 4 g MgSO4·7H2O, 1 g KH2PO4, 0.01 g FeSO4, 0,005 g ZnSO4, 0,2 g szintetikus melanin és 15 g agar 1- liter desztillált vízben. A beoltott Petri-lemezeket szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. Megfigyelték, hogy a melanin milyen mértékben színtelenedett el a gomba telepe alatt és körül. Megállapítást nyert, hogy a gomba képes a melanint elszínteleníteni, és tovább használják enzimes oldatok készítésére.

Enzim előállítása melanin színtelenítéséhez.A tenyészet folyékony tápközege 10 g glükózt, 0,2 g élesztőkivonatot, 0.07 g VA-t, 3.{13} }} g borkősav, 1 g Tween 80, 0,2 g KH2PO4, 0,146 g CaCl2·2H2O, 0,157 g K2HPO4, 0.05 g MgSO4·7H2O, 42,5 mg ZnSO4·7H2O, 7.0 mg CoCl2·6H2O, 7.0 mg CuCl2·2H2O, 0,54 mg FeCl3, 0,9 mg NaCl és 0,2 mg szintetikus melanin liter desztillált vízben 20. A tápközeg pH-ját NaOH és HCl oldattal 4,0-ra állítottuk be. 250 ml-es lombikokat, amelyek 100 ml-es tápközeget tartalmaztak, autoklávoztunk, és 5 ml-es oltóanyaggal beoltottuk. A lombikokat ezután rotációs rázógépen 30 °C-on 15 napig inkubáltuk. Kettős mintákat gyűjtöttünk a LiP aktivitási vizsgálatokhoz 24 órás időközönként.

Enzim vizsgálat.A LiP-teszt reagensei 250 mM nátrium-tartarát-puffer (pH 5,5), 10 mM VA és 4 mM H2O2 (30%) voltak. Az enzimvizsgálatot szilika küvettában végeztük, és az abszorbanciát 310 nm-en UV-látható spektrofotométerrel (Shimadzu, Kyoto, Japán) mértük. Az abszorpciót 0-30 másodpercenként figyeltük környezeti körülmények között. Az enzim aktivitását a Beer-törvény, Eq. (1) 21.

ahol c a csillapító anyag koncentrációja; A az optikai abszorpció; ε a moláris csillapítási együttható; d az optikai út hossza. Az enzimaktivitás mérése magában foglalja a koncentráció időbeli változásának meghatározását, egyenlet. (2).

Optimalizálás a fokozott LiP-termelés és a melanin színtelenítése érdekében in vitro.A Phanerochaete chrysosporium NK-1-ból származó LiP melanin szubsztrát felhasználásával történő fokozott termelésének optimalizálását Placket Burman tervezéssel végeztük. A teljes hosszúságú Placket azon a tényen alapult, hogy aláássa a különböző változók közötti interaktív hatásokat, míg csak lineáris trendeket vesz figyelembe. (3) 22.

ahol Y a választ jelenti, a szimbólumok pedig a regressziós együtthatót, k pedig a vizsgált tényezők számát. Összesen 9 faktort vizsgáltak a Phanerochaete chrysosporium NK-1 LiP legmagasabb koncentrációjának eléréséhez a táptalajban jelenlévő melanin elszíntelenítésére. A Placket–Burman tervet összesen 12 kísérleti futtatással állítottuk össze, amint az a 2. táblázatban látható. A kísérleteket összesen 35 napig végezték, és mértük a választ (LiP aktivitás IU/ml). A kísérleti adatokat a „Design Expert 9” statisztikai szoftverrel elemeztük. Az optimalizált tápközeget a LiP fokozott termelésére használták, és ammónium kicsapással tisztították.

Az enzimtermelés és -tisztítás optimalizálása.A LiP aktivitás szempontjából optimális inkubációs idő meghatározásához merülő tápközeget használtunk. Amint az a kiegészített 1. ábrán látható, a tenyészoldat maximális enzimaktivitása a 8. napon van, 140 NE/ml. Ezért az enzimoldat előállításához 8 napos inkubációs időt alkalmaztunk.

Összesen 12 kísérletet végeztek, hogy meghatározzák azokat a tényezőket (9), amelyek hatással vannak a LiP aktivitásra. A tesztek közül a LiP-aktivitás válaszértékei 171 IU/ml és 576 IU/ml között mozognak, amint az a 2. kiegészített ábrán látható. A legmagasabb LiP-aktivitású kísérletek a 3. futtatás (576 IU/ml), majd ezt követték. 10 (547 NE/ml). A regressziós analízis szerint a hőmérséklet, az idő, a glükóz koncentráció, a szubsztrát koncentráció és a mediátor pozitív hatással van a LiP aktivitásra. Az élesztőkivonat hatása elhanyagolhatónak bizonyult. Más tényezők negatív hatással vannak. A LiP termelésének optimális feltételei: idő: 35 nap, hőmérséklet: 40 fok, glükóz (literenként): 20 g, fruktóz: 10 g, élesztőkivonat: 2 g, pepton: 2 g, oltóanyag: 10 ml, szubsztrát közvetítő: 0,1 ml. Ezeket a körülményeket használták fel az ammóniumkicsapással és gélkromatográfiás (Sephadex G{18}}) módszerekkel tisztított LiP fokozott termelésére.

Az enzimek extrakcióját optimalizált pH-n, hőmérsékleten és inkubációs időn végeztük. Sephadex G75 gélszűrő oszlopot használtunk a fehérjetartalom-frakció elválasztására a sejtlizátumból a sűrűséggradiens alapján a gyártó utasításai szerint. A fehérjék mennyiségét a nyers kivonatban a nátrium-dodecil-poliakrilamid gél (SDS-PAGE) analízis során megjelenő sávok száma is jelezte. A tisztított enzim molekulatömege 46.{3}} kDa volt, az SDS-PAGE analízisből számítva (3. ábra kiegészítve). Az ammóniumkicsapás és gélkromatográfiás tisztítás után az enzimaktivitás 684.0 és 957,6 IU/ml.

A tisztított enzimet a melanin színtelenítésére használták különböző fizikai-kémiai körülmények között, beleértve a pH-t, a hőmérsékletet, az inkubációs időt és az enzimkoncentrációt. A szintetikus melanint (B049-97-6) használtuk modell melaninként az összes melanin színtelenítési kísérletben a 23. pont szerint.

Színtelenítési kísérletek.A pH hatása a melanin elszíneződésére. A pH LiP általi melanin elszíneződésére gyakorolt ​​hatásának megfigyelésére melanin színtelenítési reakciókat végeztünk 2.0–6.0 pH-értéken. A reakcióelegy 1 0 µl nyers enzimet tartalmazott TE pufferben oldva és 1990 µl 0,02 tömeg/térfogat%-os melanint. Ezeket a reakciókat VA jelenlétében és távollétében is végrehajtottuk. A reakcióelegyeket 30 °C hőmérsékleten 6 órán át inkubáltuk. A kontrollkísérleteket párhuzamosan végeztük úgy, hogy az aktív LiP-t 95 fokon forralt denaturált enzimmel helyettesítettük. A reakcióelegyeket a melanin elszíneződése szempontjából spektrofotométerrel követtük nyomon, 540 nm hullámhosszon az inkubálás előtt és után. Az enzim színtelenítési hatékonyságát százalékban ( százalék ) fejeztük ki. A melanin elszíneződését az Eq. (4) 11.

Az inkubációs idő hatása a melanin elszíneződésére. Az inkubációs idő optimalizálása érdekében a melanin színtelenítési reakcióit 2-1 0 óra inkubációs idővel végeztük. A reakcióelegy 10 µl nyers enzimet tartalmazott pufferben oldva, és 1990 µl 0,02 tömeg/térfogat%-os melanint pH 4-en VA jelenlétében és anélkül. A reakcióelegyeket ezután 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk, és megkaptuk a melanin elszíneződésének százalékos arányát.

A lebontott melanin SEM elemzése. Felület A melanin morfológiai változásait pásztázó elektronmikroszkóppal (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, USA) elemeztük. 24. Kontrollként kezeletlen melanint használtunk. A mintákat megszárítottuk és rézcsonkra (10×10mm2) rögzítettük kétoldalas szénszalaggal (mindkét oldalon ragadós). A csonkokat mosószerrel mostuk és hőpisztolyos szárítóval (KADA 85U/SMD) 200 fokon 2 percig szárítottuk a minta rögzítése előtt. Ezüstpaszta vezetést (SPI-CHEM, West Chester, PA, USA) használtunk az elektronsugár vezetésének biztosítására. Az aranyat nagyfeszültségű (25 mA áram 50 másodpercig) és vákuum (10-2 ATM) körülmények között létrehozott plazmával vitték fel a mintára. A minták felületi morfológiáját 3000-es nagyítási teljesítménnyel vizsgáltuk.

A színtelenített melanin FTIR elemzése.Az optimalizálási kísérletben a melanin legnagyobb elszíneződését mutató reakciókat vagy mintákat tovább elemeztük FTIR (56. modell, Merlin, Németország) spektroszkópiával. A mintákat centrifugáltuk (10, 000 rpm 1 percig) és levegőn szárítottuk az FTIR analízis előkészítési lépéseként 20. A melanin minták kvalitatív elemzését UV-Vis közeli infravörös (NIR) spektrométerrel végeztük. Lambda 900/Perkin Elmer Instruments. A spektrumokat 1000-3500 cm-1 tartományban vettük fel. A mintákat KBr-pelletben készítettük elő pordiszperzióval. Ebben az analízisben a kezeletlen szintetikus melanint használtuk kontrollként.

A lebontott melanin és a LiP citotoxicitása.Sós garnélarák-letalitási teszteket végeztek a lebontott melanin 14,15 citotoxicitásának ellenőrzésére. A sós garnélarák tojásait mesterséges tengervízzel ellátott téglalap alakú edényben keltették ki. Az edényben kis lyukakkal ellátott műanyag elválasztó volt, és az edényt két egyenlőtlen rekeszre osztotta. A tojásokat a nagyobb rekeszben pettyesek és letakarták, hogy elkerüljék a fény behatolását, míg a kisebb rekeszt lámpával világították meg a tetején. A kikelt lárvákat a fény a kis rekesz felé vonzotta. 48 órás inkubáció után az érett naupliusokat pasztőrözött pipettával gyűjtöttük ki a megvilágított rekeszből.

Statisztikai analízis.A kísérleti adatokat a „Design Expert 9” statisztikai szoftverrel elemeztük. Grafikus képek készültek három kísérleti kísérlet segítségével, számított szórással. A kísérleti futtatás statisztikai szignifikanciáját ANOVA módszerrel számítottuk ki.

Az adatok elérhetősége

Hivatkozások

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ. A higany toxikológiája – jelenlegi expozíció és klinikai megnyilvánulások. N. Engl. J. Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. A melasma és a gyulladás utáni hiperpigmentáció helyi kezelései. Skin Therapy Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Kortikoszteroidok. Clin. Dermatol. 15, 715-721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Melanin szintézis mikroorganizmusokban: biotechnológiai és orvosi vonatkozások. Acta Biochim. Pol. 53, 423–443 (2006).

8. Lim, Y.-J. et al. Az arbutin gátló hatásai a melanocita stimuláló hormon által kiváltott hiperpigmentáció melanin bioszintézisére tenyésztett barnás tengerimalac bőrszövetekben. Boltív. Pharmacal Res. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Bőrvilágosító termékek újralátogatása. Int. J. Cosmet. Sci. 25, 169–181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Mikroorganizmusok szűrése kékfoltgombák által termelt melaninok elszíntelenítésére. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 210–213 (2001).

11. Nagasaki, K. et al. A Ceriporiopsis sp. MD-1 peroxidáz törzs, amely elszínteleníti az emberi haj melanint. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. A lignin mikrobiális lebomlása: hogyan lehet hatékonyan újrahasznosítani egy terjedelmes, ellenszegülő polimert a természetben, és hogyan tudjuk ezt kihasználni. Microb. Biotechnol. 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW & Tompson, KD (Google Patents, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Sós garnélarák citotoxicitása, gyulladásgátló és fájdalomcsillapító tulajdonságai Woodfordia fruticosa Kurz virágaiban. Irán. J. Pharm. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Helyreállító fogászati ​​anyagok toxicitási vizsgálata sós garnélarák lárváival (Artemia salina). J. Appl. Oral Sci.

16, 297–301 (2008). 16. Falade, AO et al. Lignin-peroxidáz funkciói és várható alkalmazások. Microbiologyopen 6, e00394.

17. Sung, HJ Melanin színtelenítése lignin-peroxidázzal in situ generált H2O2-val fehérítő kozmetikai alkalmazásokhoz (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Biodegradation and Biological Treatments of cellulose, hemicellulose, and lignin: an overview. Int. Microbiol. 5, 53–63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW. Molekuláris tipizálás polimorf DNS véletlenszerű amplifikációjával és az Aspergillus fumigatus rokon párosított izolátumainak M13 déli hibridizációja. J. Clin. Microbiol. 34, 87–93 (1996).

20. Sabar, MA et al. Egy pakisztáni szénbányából izolált Rhizopus oryzae által az alacsony rangú szén lebontása és a szerves anyagok fokozott kibocsátása. Üzemanyag 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. A Lenzitus betulina MTCC-ből származó lignin-peroxidáz tisztítása, jellemzése és széndepolimerizációs aktivitása-1183. Appl. Biochem. Microbiol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Plackett–Burman tervezés alkalmazása a táptalaj komponenseinek szűrésére tannáz előállításához programhéjból, merített fermentációval. Int. J. Pharm. Res. Rev. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Melanin színtelenítése Phanerochaete chrysosporiumból származó lignin-peroxidáz által. Biotechnol. Biofolyamat. Eng. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM et al. Az emberi embrionális őssejtek tenyésztése az embrioid test lépése nélkül fokozza az oszteogenezist in vitro. Stem Cells 24, 835–843 (2006).

Elismerés

Szerzői hozzájárulások

Versengő érdekek

KiadójegyzetA Springer Nature semleges marad a közzétett térképeken szereplő joghatósági igényeket és az intézményi kapcsolatokat illetően.

További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501