ELISpot Assay létrehozása az S. Pneumoniae elleni sejtes immunitás kimutatására vakcinázott vesetranszplantált recipienseknél

Absztrakt:

A szervátültetett betegeknél az invazív pneumococcusos megbetegedések aránya 25-ször nagyobb, mint az általános populációban. Ebben a kohorszban a S. pneumoniae elleni védőoltás javasolt, mert csökkenti a pneumococcus fertőzés e súlyos formájának előfordulását. Korábbi vizsgálatok azt mutatják, hogy a transzplantált recipiensek képesek specifikus antitesteket termelni pneumococcus elleni oltás után.

Azonban továbbra sem világos, hogy a vakcinázás specifikus sejtes immunitást is kivált-e. A jelenlegi, 38 vesetranszplantált recipiensen végzett vizsgálatunkban létrehoztunk egy interferon-ELISpot vizsgálatot, amely képes kimutatni a S. pneumoniae elleni szerotípus-specifikus sejtválaszokat. Az eredmények azt mutatják, hogy a Prevenar 13 konjugált vakcinával és a Pneumovax 23 poliszacharid vakcinával történő szekvenciális vakcináció a szerotípus-specifikus sejtes immunitás növekedéséhez vezetett. A legerősebb választ a 9N és 14 szerotípus ellen figyeltük meg, amelyek mindketten a Pneumovax 23 összetevői. A S. pneumoniae elleni sejtes válaszok pozitívan korreláltak a specifikus IgG antitestekkel (r=0.32, p=0.12). ).

Összefoglalva, ez az első jelentés, amely arra utal, hogy a vesetranszplantált recipiensek specifikus sejtválaszokat válthatnak ki a pneumococcus elleni vakcinázás után. Az általunk létrehozott ELISpot további vizsgálatokat tesz lehetővé. Ezek segíthetnek meghatározni például a specifikus celluláris immunitást befolyásoló tényezőket immunhiányos kohorszokban vagy a sejtes immunitás időtartamát a vakcinázás után.

A sejtes immunitás a szervezet sejtjeinek idegen kórokozókkal szembeni ellenálló képességére utal, ami az immunrendszer része. A sejtes immunitás különféle sejttípusokat foglal magában, beleértve a T-sejteket, NKT-sejteket, makrofágokat, természetes ölősejteket stb. Ezek a sejtek felismerik és elpusztítják a kórokozókat, például vírusokat, baktériumokat és gombákat, így megvédik a szervezetet a fertőzésektől és betegségektől. A sejtes immunitás a tumorsejteket is képes nyomon követni és megszüntetni. Az emberi szervezetnek is javítania kell immunitását. Kutatások után kiderült, hogy a Cistanche fokozhatja az immunitást. A Cistanche kivonata serkentheti az immunsejtek, például a T-limfociták és az NK-sejtek proliferációját és aktivitását, ezáltal erősítve az emberi immunitást.

Kattintson a cistanche tubulosa előnyeinek megismeréséhez

Kulcsszavak:

pneumococcus konjugátum és poliszacharid vakcinák; szekvenciális vakcinázás; veseátültetésben részesülők; szerotípus-specifikus celluláris immunitás; interferon- ELISpot.

1. Bemutatkozás

A Gram-pozitív Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) baktérium gyakran megtelepedik az emberi orrgaratban [1]. A nasopharynxen kívül lebenyes tüdőgyulladáshoz, agyhártyagyulladáshoz, középfülgyulladáshoz vagy arcüreggyulladáshoz vezethet. A lokális fertőzésen kívül invazív pneumococcus betegségeket (IPD) is okozhat, amelyek halálozási aránya körülbelül 10 százalék [1–3]. A Centers for Disease Control and Prevention adatai szerint a szervátültetettek körében az IPD aránya 25-ször nagyobb, mint az általános populációban [2,3]. A S. pneumoniae elleni védőoltás javasolt immunkompromittáló állapotú egyéneknél, mert kimutatták, hogy csökkenti az IPD előfordulását [4–6].

A S. pneumoniae elleni poliszacharid vakcinákon (pl. Pneumovax 23, MSD Sharp és Dohme, Haar, Németország) kívül léteznek olyan vakcinák, amelyek a diftéria toxin nem toxikus mutáns formájához (pl. Prevenar 13, PCV13, Pfizer, New York, NY) konjugáltak. , USA) [7], amelyek T-sejt-függően hatnak.

Németországban a 13-valens pneumococcus konjugált vakcina, majd a 23-valens pneumococcus poliszacharid vakcina egymást követő beadása javasolt 6–12 hónap után immunhiányos egyének, például transzplantált betegek számára [8]. A beoltottak először a Prevenar 13 glikokonjugált vakcinát kapják. Korábbi egereken végzett adatok szerint a CD4 plusz T-sejtek képesek felismerni a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) II. osztálya (szénhidrát-specifikus helper CD4 T plus sejtek, Tcarbs) által prezentált glikánnal módosított peptideket [9 ,10]. Ezek a specifikus szénhidrátok fokozhatják a pneumococcus poliszacharidok elleni osztálykapcsolt (IgG) antitestválaszok termelését.

Ezek a korábbi adatok azonban nem képesek meghatározni az interferon (IFN) szekréció forrását az ELISpot vizsgálatainkban, ahol a sejteket (nem konjugált) poliszacharid antigénekkel stimulálták.

Az oltási válaszok szerológiai ellenőrzése javasolt immunhiányos betegeknél, bár továbbra sem világos, hogy az antitesttiterek milyen mértékben tükröznek védelmet [11]. Az ezzel az oltási renddel elérhető védelem továbbra is tisztázatlan a transzplantációs kohorszokban [12–14]. Jelenleg csak a S. pneumoniae elleni vakcinázást követő specifikus humorális immunitásról állnak rendelkezésre adatok [12–16]. A pneumococcusok elleni vakcinázás utáni specifikus T-sejt-adatokat még nem tették közzé egy transzplantációs kohorszban. Egészséges felnőtteknél azonban kimutatható volt, hogy a pneumococcus poliszacharidokkal szembeni celluláris immunitás fokozódott a vakcináció hatására [17].

A jelenlegi vizsgálat célja egy olyan ELISpot létrehozása volt, amely elég érzékeny ahhoz, hogy kimutathassa a S. pneumonia elleni specifikus sejtes immunitást beoltott vesetranszplantált recipienseknél.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Betegek

Összesen 38 klinikailag stabil vesetranszplantált recipiens (70 minta) vett részt ebben a keresztmetszeti, egyközpontú vizsgálatban (1. táblázat). A medián életkor 53 év volt (23-77 év); 12 beteg volt nő és 26 férfi. A betegek két S. pneumoniae elleni oltást kaptak. Egymás után beoltották őket egyetlen adag Prevenar 13-mal, majd hat hónappal később egyetlen adag Pneumovax 23-mal. Az (utolsó) veseátültetés és az első oltás közötti medián intervallum 38 hónap volt (3 hónap-33 év).

Stabil allograft funkció (definíció szerint<15% change in serum creatinine concentration within one month before vaccination), an interval of ≥3 months to kidney transplantation, and absence of clinical infection, of allograft rejection and pregnancy, were defined as inclusion criteria. Blood samples were drawn immediately before vaccination with Pneumovax 23 (month 6), and one month and six months thereafter (months 7 and 12, respectively). This study was approved by the institutional review board of the University Hospital Essen (14-5858-BO), and written informed consent was obtained from all participants. It was carried out by the Declarations of Helsinki and Istanbul and their subsequent amendments.

2.2. Védőoltások

A {{{{20}}}}valens pneumococcus elleni vakcina, a Prevenar 13 13 pneumococcus-szerotípus poliszacharidját tartalmazza (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 19A) és 23F), egyedileg konjugálva a diftériatoxin keresztreaktív 197-es (CRM197) nem toxikus mutáns formájához. A vakcina 5 mM szukcinát pufferben van kiszerelve, amely 0,85% NaCl-t és 0,02% poliszorbát 80-at tartalmaz, pH 5,8, és adjuvánsként 0,125 mg/adag alumínium-foszfátot tartalmaz. Mindegyik szerotípusból 2,2 µg/adagot tartalmaz, kivéve a 6B szerotípust, 4,4 µg/dózis (0,5 ml).

A 23-valens Pneumovax 23 vakcina egy nem konjugált vakcina, amely a 23 pneumococcus szerotípusból 25 µg-ot tartalmaz: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 121,A 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F és 33F. A vakcina fenol és<1 mmol sodium chloride per dose (0.5 mL). Both vaccines were injected into the deltoid muscle.

2.3. A Pneumococcusok elleni celluláris immunitás meghatározása ELISpot segítségével

Kilenc milliliter heparinizált vért gyűjtöttünk, és a perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) Ficoll gradiens centrifugálással választottuk el. A PBMC számát egy automata hematológiai analizátor (XP-300, Sysmex, Norderstett, Németország) határozta meg. 200,000 frissen izolált PBMC duplikált vagy három párhuzamos tenyészetét pneumococcus poliszacharidok nélkül, egyedi tenyészeteket pedig 100, 150 és 200 µg/ml pneumococcus poliszachariddal (pneumococcus szerotípusok (PS) 2, 1 N , 611 , és 25F, mind a Pfizer, ATCC, Manassas, VA, USA). Az IFN-termelést előre bevont ELISpot lemezek és szabványos detektálórendszer (T-Track® ELISpot kit, Mikrogen GmbH, Neuried, Németország; korábban Lophius Biosciences GmbH, Regensburg, Németország) segítségével határoztuk meg. A PBMC-ket pneumococcus poliszacharidok nélkül és velük együtt 150 µl AIMV tápközegben (Gibco, Grand Island, NE, USA) 37 ◦C-on inkubáltuk. A T-sejt mitogén fitohemagglutininnel (PHA, 4 µg/mL) végzett stimuláció pozitív kontrollként szolgált. A sejteket egy éjszakán át előinkubáltuk U fenéklemezeken (BD Falcon, Nijmegen, Hollandia).

Ezt követően további 19 órán át inkubáltuk az ELISpot lemezeken. Ezek a feltételek optimálisnak tekinthetők. Az ELISpot körülmények optimalizálása érdekében titráltuk a pneumococcus poliszacharidokat (0,5-800 µg/mL), és a sejttenyésztést végeztük egy éjszakán át tartó előinkubáció nélkül. A citokin-kiválasztó sejtek kolorimetriás kimutatását a gyártó utasításai szerint végeztük. A foltszámokat ELISpot olvasóval elemeztük (AID Fluorospot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Németország).

Az egyének poliszacharidkoncentrációinak figyelembevétele mellett meghatároztuk az optimális koncentrációk medián értékét (100, 150 és 200 µg/ml), és kivontuk a negatív kontrollok mediánját. Ezáltal spot növekményt generáltunk, jelezve a konkrét foltokat. Megjegyzendő, hogy a negatív kontrollok 0,71 folt átlagértéket és 0,47 folt átlagos szórását értek el.

2.4. A Pneumococcusok elleni celluláris immunitás meghatározása proliferációs vizsgálattal

A betegek egy részében a limfocita proliferációt is elemeztük, mérve a 3Htimidin felvételt. Sejttenyészetenként 200,000 PBMC-t használtunk, és 50-800 µg/ml poliszachariddal stimuláltuk a sejteket 2, 6A, 9N és 14 poliszacharidokkal. 5 napig 37 ◦C-on U fenéklemezekkel. Pozitív kontrollként PHA-val végzett stimulációt alkalmaztunk.

Az utolsó 16 órában a tenyészeteket tenyészetenként 37 kBq 3H timidinnel jelöltük. Ezután a sejteket összegyűjtöttük (Harvester 96, Tomtec, Hamden, CT, USA) szűrőbetétekre (Wallac, Turku, Finnország), és a beépült radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálással (1450 Microbeta Trilux, Wallac) határoztuk meg. Az eredményeket percenkénti számban fejeztük ki. Ezenkívül figyelembe vettük a stimulációs indexeket (SI) (a proliferáció hányadosa specifikus stimulációval és negatív kontrollal (proliferáció stimuláció nélkül)). A legalább 3-as SI-t pozitív válaszként határozták meg.

2.5. Pneumococcusok elleni antitestek meghatározása

A S. pneumoniae elleni antitesteket ELISA-val határoztuk meg, amely 23 pneumococcus szerotípus elleni IgG antitesteket mutat ki (VaccZyme™, The Binding Site, Schwetzingen, Németország). A vizsgálatot a gyártó utasításai szerint végeztük.

2.6. Statisztikai analízis

Az adatokat GraphPad Prism 8.4.2.679 (San Diego, CA, USA) segítségével elemeztük. Az előinkubálás nélkül és azzal, valamint a Pneumovax 23-mal végzett vakcináció előtt vagy után kapott adatokat Mann–Whitney U-teszttel hasonlították össze. Spearman tesztet alkalmaztak az ELISpot eredmények és a numerikus változók korrelálására, a Mann–The Whitney tesztet pedig a páciens nemének az ELISpot eredményekre gyakorolt ​​hatásának elemzésére. Ha másképp nem jelezzük, a medián értékeket adjuk meg. A kétoldali p értékek < 0,05 szignifikánsnak tekinthetők.

3. Eredmények

3.1. Az ELISpot feltételek optimalizálása

A kezdeti titrálási kísérleteket vesetranszplantált betegek PBMC-jével 0,5–50 µg/mL pneumococcus poliszacharidokkal végezték, és szinte kimutathatatlan sejtválaszokat mutattak (1a. ábra), a S. pneumonia elleni vakcinázás ellenére. A poliszacharid koncentrációk növekedése (50-800 µg/ml), egy éjszakán át végzett előinkubálással kombinálva U fenéklemezeken (1b, c ábra), kimutatható, dózisfüggő sejtválaszokat eredményezett, ami a maximumot 100-200-nál érte el. µg/ml.

3.2. A Pneumococcus-specifikus ELISpot válaszok időbeli lefutása

Az optimalizált körülmények (100, 150 és 200 µg/mL poliszacharidok és előinkubáció) alkalmazásával klinikailag stabil vesetranszplantált recipienseket teszteltünk a pneumococcus elleni oltás megkezdését követő 6., 7. és 12. hónapban, azaz mértük a a Prevenar 13 konjugált pneumococcus vakcina hatása a 6. hónapban és mindkét vakcina (Prevenar 13 és Pneumovax 23) együttes hatása a 7. és 12. hónapban. Megjegyzendő, hogy olyan poliszacharid szerotípusokat választottunk, amelyeket csak a Prevenar 13 (6A) vakcina tartalmaz. a Pneumovax 23-ban (2, 9N, 11A), mindkét vakcinában (14), vagy egyikben sem (25F). A pneumococcus-specifikus ELISpot vizsgálatunkban kimutatott IFN-foltok nagyok és intenzívek (2. ábra).

1. ábra: Az ELISpot körülmények optimalizálása a S. pneumoniae elleni specifikus celluláris immunitás meghatározására. (a) A 2-es, 6A, 9N és 14-es szerotípusú (PS) pneumococcus poliszacharidok alacsony koncentrációinak titrálása (0,5–50 µg/mL), előkezelés nélkül. inkubációs lépés, azaz a sejteket közvetlenül inkubáltuk ELISpot lemezeken (előinkubálás nélkül). (b,c) Eredmények a pneumococcus poliszacharidok magasabb koncentrációival (50–800 µg/mL) végzett stimuláció után, akár (b) nélkül, akár (c) egy éjszakán át végzett előinkubálással U fenéklemezeken. Minden esetben (a–c) vizsgáltuk a vesetranszplantált betegeket pneumococcus elleni oltás után. A medián értékeket szürke vízszintes vonalak jelzik. Pozitív kontrollkísérleteket végeztünk a T-sejt mitogén fitohemagglutininnel (PHA). A (b, c) pontban bemutatott eredményeket Mann–Whitney teszttel hasonlítottuk össze. * p < 0,05, ** p < 0,01.

2. ábra: Interferon-ELISpot eredmények (200,000 PBMC/lyuk) egy nő, 49- éves vesetranszplantált recipiensnél a 12. hónapban. A beteg Prevenar 13-mal és Pneumovax 23-mal oltást kapott 12 hónappal és 6 hónappal a vérzés előtt. A pneumococcus poliszacharidok (PS) minden szerotípusát három koncentrációban (100, 150 és 200 µg/ml) alkalmaztuk. A bal oldali panel az ELISpot eredményeit, a jobb oldali pedig a lemezelrendezést mutatja. A teljes üreget kitöltõ összefolyó foltokat, amint azt a fitohemagglutinin (PHA) pozitív kontrollja mutatja, 600-ra állítottuk be.

A számításhoz a három koncentráció medián értékeit használtuk, így mintánként és időpontonként egyetlen eredményt kaptunk. A 2-es, 6A, 9N és 14-es poliszacharid szerotípusok esetében a válaszok növekedését figyeltük meg a 7. hónapban a 6. hónaphoz képest (3. ábra). Ez a növekedés valamivel erősebbnek tűnt a Pneumovax 23 vakcinában található négy szerotípus közül három (2, 9N és 14) esetében, mint a 6A szerotípus esetében, amelyet csak a Prevenar 13 tartalmaz. A PS 25F-re, az egyik vakcinában sem található szerotípusra adott válaszok a 12. hónapban nem voltak kimutathatók.

Összességében az adatok azt mutatják, hogy a Pneumovax 23-mal történő vakcinázás az abban a vakcinában található szerotípusok többségére a sejtes válaszok növekedéséhez vezetett. A legtöbb specifikus sejtet a vakcinázás után egy hónappal lehetett kimutatni. Azonban a Pneumovax 23-ban is található 11A szerotípus nem indukált kimutatható sejtes immunitást. A 12. hónapban az immunitás csökkent, ami az oltás után várható. Váratlanul a 7. hónapban a 6A szerotípusra adott válaszok enyhe növekedése is lehetett, ami a keresztreaktivitással magyarázható. A 25F szerotípussal szembeni sejtválasz hiánya a 12. hónapban megfelelt a várakozásainknak, mivel egyik vakcinában sem volt jelen.

3. ábra: S. pneumonia elleni specifikus celluláris immunitás vesetranszplantált betegeknél, miután megkapták a Prevenar 13-mal (hónap (M) 6) vagy Prevenar 13-mal és Pneumovax 23-mal (M7 és M12) végzett oltást. Megjegyzendő, hogy a pneumococcus szerotípusokat (PS) csak a Prevenar 13 vakcinában (6A, kék), csak a Pneumovax 23-ban (2, 9N, 11A, fekete), mindkét vakcinában (14, piros) vagy egyikben sem választottuk. őket (25F, zöld). A PS 14-re adott válaszokat 55-ből csak 41-ben mérték, a PS 25F-re adott válaszokat pedig csak hétben (M12-nél). Mindegyik poliszacharid három koncentrációjához medián értékeket használtunk (100, 150 és 200 µg/ml), így mintánként és időpontonként egyetlen eredményt kaptunk. A medián értékeket szürke vízszintes vonalak jelzik. Pozitív kontrollkísérleteket végeztünk a T-sejt mitogén fitohemagglutininnel (PHA). A növekmény azt jelenti, hogy a negatív kontrollokat levontuk az S. pneumoniae poliszacharidokkal végzett stimuláció utáni eredményekből.

3.3. Pneumococcus-specifikus proliferatív válaszok koncentrációfüggősége

50-800 µg/ml pneumococcus poliszacharid felhasználásával proliferációs vizsgálatokat is végeztünk. A konkrét válaszok gyengék voltak. Egy kivételével minden esetben a pneumococcus poliszacharidokkal végzett stimuláció utáni percenkénti számok 2200 alatt voltak, amit határreakciónak minősítünk (4. ábra). Öt beoltott vesetranszplantált recipiens közül három mutatott kimutatható proliferációt, amit a legalább 3-as maximális stimulációs index határoz meg. Az első beteg a 2-es, 9N-es és 14-es szerotípusra reagált (SI 5,8, 3,6 és 3,8-ig). , a második a 6A és 9N szerotípusra (SI legfeljebb 3,1 és 5,1), a harmadik pedig a 2-es szerotípusra (SI legfeljebb 3,9).

4. ábra: Proliferatív válaszok beoltott vesetranszplantált recipiensekben S. pneumoniae poliszacharidokkal történő stimuláció után. (a) Az eredmények percenkénti növekményként megadva; (b) stimulációs index, azaz a stimulált és nem stimulált tenyészetek hányadosa. A 2-es, 6A, 9N és 14-es szerotípusú (PS) pneumococcus poliszacharidokat 50-800 µg/ml koncentrációban használtuk, és hat napon át sejtetenyésztettük. A legalább 3-as stimulációs indexet pozitív válaszként határoztuk meg (szaggatott vonal). A medián értékeket szürke vízszintes vonalak jelzik. A negatív kontrollok specifikus stimuláció nélkül tenyésztett sejtek voltak, a pozitív kontrollok pedig a T-sejt mitogén fitohemagglutininnel (PHA) stimulálták.

3.4. Összefüggés a Pneumococcus-specifikus ELISpot-válaszok és a specifikus antitestek között

Az ELISpot tesztekkel párhuzamosan 23 pneumococcus szerotípus elleni IgG antitesteket határoztunk meg ELISA-val. A Spearman korrelációs elemzést a vakcinázást követő 12. hónapban végezték el, és a 2., 6A, 9N és 14. szerotípusra adott ELISpot válaszok összegét vették figyelembe az optimalizált ELISpot feltételek mellett (n=25). Pozitív korrelációt figyeltünk meg (r=0.32, p=0.12), amint azt az 5. ábra mutatja. Figyelembe vettük az egyes ELISpot vizsgálatokat is, és pozitív korrelációt figyeltünk meg mind a négy szerotípusban (PS 2). : r=0.04; PS 6A: r=0.15; PS 9N: r=0.28; PS 14: r=0.36). Ezenkívül a PS 11A-ra vonatkozó adatok 25 betegből 22-nél álltak rendelkezésre (r=0,26).

5. ábra. Az ELISpot eredmények és a S. pneumoniae elleni IgG antitestek Spearman korrelációs elemzése. Ez az elemzés a vesetranszplantált recipiensek eredményeit veszi figyelembe a 12. hónapban, azaz a Prevenar 13 és Pneumovax 23 vakcinázás után. Összefoglaltuk az ELISpot válaszokat a 2., 6A, 9N és 14. pneumococcus szerotípusokra (PS) és koncentrációkon tesztelve. 100, 150 és 200 µg/ml. Mindegyik szerotípus három koncentrációjához medián értékeket használtunk, így mintánként egyetlen eredményt kaptunk. A 23 pneumococcus szerotípus elleni IgG antitesteket párhuzamosan határoztuk meg kereskedelmi ELISA-val (n=25). A folytonos vonal a regressziós egyenest, a szaggatott vonal pedig a 95 százalékos konfidencia intervallumot jelenti.

3.5. Összefüggés a Pneumococcus-specifikus ELISpot válaszok és a beteg jellemzői között

A Spearman-analízis azt mutatta, hogy a 12. hónapban az ELISpot válaszok hat szerotípus közül ötben pozitívan korreláltak a transzplantáció és a vakcinázás közötti időközzel, és elérte a statisztikai szignifikanciát a PS 6A szerotípus tekintetében (r=0.37, p=0). 04). Így a transzplantáció után később beoltott betegek sejtválaszai magasabbak voltak. A férfiak átlagosan 1.{7}}szer magasabb választ adtak, mint a nők, ami nem volt szignifikáns. Az életkornak nem volt határozott hatása a sejtválaszokra (r=−0,35—r=0,25). Mivel a 12. hónapban tesztelt 33 betegből 25 kapott takrolimusz alapú immunszuppresszív kezelést, az immunszuppresszív gyógyszerek hatását nem tudtuk megfelelően elemezni meglehetősen szűk csoportunkban.

4. Megbeszélés

Jelen tanulmányunkban egy IFN-ELISpot assay létrehozását írjuk le a S. pneumoniae elleni specifikus immunitás kimutatására vakcinázott vesetranszplantált recipienseknél. Egy korábbi, beoltott egészséges egyéneken végzett vizsgálattal összehasonlítva a pneumococcus poliszacharidokra adott ELISpot válasza összességében alacsonyabbnak tűnt a transzplantált betegekben [17]. A kísérleti körülmények között azonban jelentős különbségek voltak. Míg a korábbi Wuorimaa et al. A teljes poliszacharid vakcinát (adjuvánsok nélkül) használtuk antigénként, mi itt egyedi poliszacharid szerotípusokat használtunk.

Ezáltal mérni tudtuk a szerotípus-specifikus válaszokat. Más, a pneumococcus elleni vakcinázást követő celluláris immunitásra vonatkozó korábbi tanulmányok a konjugátumot, a diftéria toxint [18] vagy a toxint tartalmazó komplett vakcinát [17, 19, 20] használták antigén stimulusként. Így a sejtes vizsgálatok nem voltak specifikusak a pneumococcusokra, de a konjugátumra adott válaszokat is kimutathatták.

Ezen túlmenően, vannak olyan tanulmányok a sejtes immunitásról, amelyek vagy bakteriális lizátumokat, felülúszókat vagy pneumococcus felszíni protein A-t, a S. pneumoniae sejtfalhoz kötődő felszíni fehérjét használnak, függetlenül a vakcinázástól és a transzplantációtól [21–24]. Ezek a korábbi jelentések azt mutatják, hogy a S. pneumoniae elleni CD4 plusz T-sejtes válaszok mérhetők IFN-ELISpot vagy áramlási citometria segítségével, amely kimutatja az IFN- vagy IL-17-termelést, illetve a CD154- vagy CD25-expressziót. Egészséges felnőttek PBMC-jét használva Wuorimaa et al. kimutatták, hogy a pneumococcus-specifikus IFN-szekréció kiemelkedő és megnövekedett a fehérje-konjugált és nem konjugált pneumococcus vakcinákkal végzett oltás után [17]. Megjegyzendő, hogy a nem konjugált pneumococcus vakcinát kapó önkéntesekben a poliszacharid antigénekkel szembeni IFN-válasz (fehérjehordozó nélkül) megnőtt az oltást követően (elővédőoltás: 0, 14. nap: 32. nap, 28. nap: 22.; az adatok a fertőzések átlagos számát jelentik IFN-t szekretáló sejtek). Így jelenlegi eredményeink összhangban vannak a korábbi tanulmányokkal.

Tisztázni kell, hogy melyik sejttípus az IFN-szekréció forrása. A foltjellemzők (nagy és intenzív) szerint az IFN- -termelő sejtek T-sejtek lehetnek. Kísérleti sejtes egérmodell alkalmazásakor a pneumococcus poliszachariddal aktivált CD4 plusz T-sejtek in vivo és in vitro klonotípus-térképezése klonotípusos T-sejt-receptor (TCR) transzkriptumokat mutatott ki [25]. Feltételezték, hogy az ikerionos poliszacharidok oligoklonális CD4 plusz T-sejt aktivációt indukáltak, ami az antigénprezentáló sejtektől függ [25]. A szerzők azt javasolták, hogy a poliszacharidok kötődjenek az MHC II. osztályú kötőbarázda külső részéhez, és a TCR CDR3 kötődoménje felismerje őket. Az MHC II. osztályú molekulákkal történő bemutatáshoz HLA-DM molekulák jelenlétére is szükség volt.

Avci és munkatársai azonban kimutatták. hogy a CD4 plusz T klónok csak az MHC II. osztályú kontextusban ismerik fel a szénhidrátokat, és csak akkor lépnek reakcióba, ha egy peptid prezentálja őket [9]. De fehérjehordozó nélküli poliszacharidokat használtunk ingerként. Azt is feltételezhetjük, hogy a reagáló sejtek nem lehetnek δ T-sejtek vagy NKT-sejtek. Úgy tűnik, hogy a δ T-sejtek nem igényelnek antigénfeldolgozást és peptidepitópok MHC-prezentációját [26]. A perifériás vérben kisebb populációt alkotnak, hidat képeznek a veleszületett és az adaptív immunrendszer között, és TCR-jüket mintafelismerő receptorként használják [26]. Ezen túlmenően bizonyítékok támasztják alá, hogy a tüdő-specifikus δ T-sejt-alcsoportok szerepet játszanak a S. pneumoniae fertőzésre adott lokális válaszokban [27]. Végül, az IFN-forrás lehet NK-sejtek, amint azt korábban leírtuk lipopoliszachariddal, a Gram-negatív baktériumok külső membránjának fő összetevőjével végzett stimuláció után [28]. Megjegyzendő, Kanevskiy et al. stimulálta az NK sejteket lipopoliszacharidokkal, de nem pneumococcus poliszacharidokkal (a Gram-pozitív S. pneumoniae baktériumból).

Míg a transzplantált betegek humorális immunitásával foglalkozó számos tanulmány azt jelzi, hogy ezek a betegek az oltás után képesek antitestválaszt kifejteni – bár csökkentett szinten – [12–16], a vakcinázás utáni specifikus sejtes immunitásra vonatkozó adatokat még nem tették közzé ebben a kohorszban. Kihívást jelentett egy olyan vizsgálat kidolgozása, amely kimutatja a S. pneumonia elleni sejtes immunválaszt vesetranszplantált betegekben, mivel az egészséges kontrollokban még alacsony szinten is [17]. Még nem határozták meg, hogy ezeknél a betegeknél kialakulhat-e sejtes reakció a pneumococcusokkal szemben az élethosszig tartó immunszuppresszív kezelés ellenére. Itt beszámolunk arról, hogy a vesetranszplantált betegeknél a védőoltás után megnövekedett celluláris pneumococcus immunitás. A PS 9N és a 14 – a Pneumovax 23 mindkét komponense – összességében a legerősebb sejtes immunválaszt váltotta ki. A megállapítás jól illeszkedik a beoltott vesetranszplantált betegek humorális adataihoz [29]. Ez a korábbi vizsgálat a Pneumovax 23-mal történt vakcinázást követően erős növekedést mutatott a két 9N és 14 szerotípus ellen irányuló antitestek számában.

Ezen túlmenően a 14-es szerotípus és 12 másik szerotípus elleni antitestek a legmagasabb koncentrációt érték el a Pneumovax 23-mal immunizált 278 egészséges önkéntes egyesített szérumában [30], ami azt jelzi, hogy ez a szerotípus erősen immunogén. Az antitestválaszokhoz hasonlóan nagy eltérések mutatkoznak az egyének között, valószínűleg a korábbi S. pneumoniae fertőzés és a változó mértékű immunszuppresszió miatt. Jelenleg nincs arany standard a S. pneumonia elleni sejtes válaszok kimutatására, ezért nehéz meghatározni az ELISpot vizsgálat érzékenységét és specificitását. Az elemzést bonyolítja továbbá, hogy a pneumococcusok gyakori természetes fertőzése humorális és celluláris immunválaszokhoz is vezethet.

Mivel az ELISpot válaszok dózisfüggőségét (harang alakú dózis-válasz görbével) és a vakcinázás utáni válaszok növekedését figyeltük meg, az eredmények megfelelnek az antigén-specifikus sejtválaszok fő jellemzőinek. Míg az ELISpot módszerrel szerotípus-specifikus IFN-termelést tudtunk kimutatni, addig a proliferatív válaszok összességében alacsonyak voltak. Ez a megállapítás jól illeszkedik a beoltott egészséges kontrollokon végzett korábbi tanulmányhoz, amely szintén nem tudta kimutatni a specifikus T-sejt-proliferációt poliszacharid vakcinával végzett stimuláció után [17].

A Spearman-analízis szerint a S. pneumoniae elleni celluláris és humorális immunitás pozitívan, de meglehetősen gyengén korrelált (r {0}}.32). Ez a megállapítás összhangban van az egyéb mikrobiális antigének, például a hepatitis B vírus (r=0.38) [31] vagy a SARS-CoV-2 vírus (r=0) elleni immunválaszokkal. 20–0,52, az antigéningertől és a kohorsztól függően) [32].

Korábban elemeztük az immunszuppresszív kezelés hatását a szerotípus-specifikus humorális immunitásra a Prevenar 13 vakcinázás után [15]. Vizsgálatunk kimutatta, hogy 35 vesetranszplantáción átesett, mikofenolát-mofetil-kezelést nem kapott 14-gyel szemben reagált az oltásra az opsonophagocytic killing assay (OPA) titereinek kevésbé emelkedésével, valamint egy globális és szerotípus-specifikus anti-pneumococcus kapszuláris poliszacharid (IPPgG) IgG (IPPgG2) IgG-vel. és IgA az oltást követő 1. és 12. hónapban. Harminchárom takrolimusz-kezelésben részesülő betegnél magasabb volt az OPA-titer és a szerotípus-specifikus anti-PCP IgG, szemben a 16-tal, akiknél nem. Ezenkívül magasabb IgA-koncentrációt mutattak 12 hónappal a vakcinázás után. A celluláris és humorális immunitás közötti pozitív összefüggést figyelembe véve feltételezhető, hogy a pneumococcusok elleni celluláris immunitás is függ az immunszuppresszív kezelési rendtől.

Bár a mérés javasolt, az S. pneumoniae elleni antitest-titerek fertőzés elleni védelemre vonatkozó prediktív értéke továbbra is tisztázatlan transzplantált betegeknél. Remélhetőleg az ELISpot módszerrel kimutatott T-sejtes válasz jobban korrelál a klinikai események előfordulásával. Ennek ellenére ezt elemezni kell.

Összefoglalva, a jelen cikkben ismertetett ELISpot módszer további tanulmányokat tesz lehetővé. Ezek segíthetnek meghatározni azokat a tényezőket, amelyek befolyásolják a pneumococcusok elleni specifikus celluláris immunitást egy transzplantációs csoportban vagy a sejtes immunitás időtartamát a vakcinázás után.

A szerző hozzájárulásai:

Fogalomalkotás, OW, BW és ML; módszertan, ML; érvényesítés, ML és AG; formális elemzés, ML; nyomozás, ML, AG és OW; erőforrások, NM, KV, BW, UE, HR és OW; adatkezelés, ML, KV és AG; írás – eredeti tervezet előkészítése, ML és AG; írás – áttekintés és szerkesztés, BW, NM és PAH; vizualizáció, ML; felügyelet, ML, NM és OW; projekt adminisztráció, OW; finanszírozás megszerzése, AG, PAH és OW Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás:

Ez a kutatás nem kapott külső támogatást. Az AG-t a Stiftung Universitätsmedizin kutatási ösztöndíja támogatja. Az OW-t a RudolfAckermann-Stiftung (Stiftung für Klinische Infektiologie) korlátlan támogatása támogatja.

Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata:

A vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozat irányelvei szerint végezték, és a németországi Esseni Egyetemi Kórház Etikai Bizottsága (14-5858-BO) hagyta jóvá.

Tájékozott beleegyező nyilatkozat:

A vizsgálatban részt vevő összes alanytól tájékozott beleegyezést kaptunk.

Adatelérhetőségi nyilatkozat:

A jelen tanulmányban bemutatott adatok a megfelelő szerzőtől kérésre rendelkezésre állnak. Az adatok az adatvédelmi korlátozások miatt nem nyilvánosak.

Köszönetnyilvánítás:

Hálásak vagyunk Babette Große-Rhode-nak a kiváló technikai segítségéért.

Összeférhetetlenség:

Az AG előadói díjakat, tiszteletdíjakat és utazási költségeket kapott az Alexiontól, a BioMérieux-tól, a Novartistól és a Sanofitól. Az OW kutatási támogatást kapott klinikai tanulmányokhoz, előadói díjakat, tiszteletdíjakat és utazási költségeket az Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers Squibb, Correvio, Chiesie, Gilead, Hexal, Janssen, F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi és TEVA. A többi szerző nem nyilatkozik összeférhetetlenségről. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmány megtervezésében; az adatok gyűjtésében, elemzésében vagy értelmezésében; a kézirat megírásában; vagy az eredmények közzétételéről szóló döntésben.

Hivatkozások

1. Simell, B.; Auranen, K.; Kayhty, H.; Goldblatt, D.; Dagan, R.; O'Brien, KL; Pneumococcus Carriage, G. A pneumococcus hordozás és a betegség közötti alapvető kapcsolat. Expert Rev. Vaccines 2012, 11, 841–855. [CrossRef] [PubMed]

2. Országos Oltóanyagprogram Iroda. Felnőttkori védőoltási tervek.

3. Arora, S.; Kipp, G.; Bhanot, N.; Sureshkumar, KK Vesetranszplantált betegek oltása: A sáros vizek tisztítása. World J. Transpl. 2019, 9, 1–13. [CrossRef] [PubMed]

4. Betegségellenőrzési és -megelőzési központok. A 13-valens pneumococcus konjugált vakcina és a 23-valens pneumococcus poliszacharid vakcina alkalmazása immunhiányos állapotú felnőttek számára: Az Immunizációs Gyakorlatok Tanácsadó Bizottságának (ACIP) ajánlásai. MMWR 2012, 61, 816–819.

5. Robert-Koch-Institut. Wissenschaftliche Begründung für die Aktualisierung der Empfehlungen zur Indikationsimpfung gegen Pneumokokken für Risikogruppen. Epid. Bika. 2016, 37, 385–406.

6. Bonten, MJ; Huijts, SM; Bolkenbaas, M.; Webber, C.; Patterson, S.; Gault, S.; van Werkhoven, CH; van Deursen, AM; Sanders, EA; Verheij, TJ; et al. Poliszacharid konjugált vakcina pneumococcus tüdőgyulladás ellen felnőtteknél. N. Engl. J. Med. 2015, 372, 1114–1125. [CrossRef]

7. Európai Gyógyszerügynökség: A Prevenar 13 értékelő jelentése.

8. Soininen, A.; Seppala, I.; Nieminen, T.; Eskola, J.; Kayhty, H. Az antitestek IgG alosztályának megoszlása ​​felnőttek pneumococcus konjugált vakcinákkal történő vakcinázása után. Vaccine 1999, 17, 1889–1897. [CrossRef]

9. Avci, FY; Li, X.; Tsuji, M.; Kasper, DL Az adaptív immunrendszer glikokonjugált vakcina aktiválásának mechanizmusa és hatása a vakcina tervezésére. Nat. Med. 2011, 17, 1602–1609. [CrossRef]

10. V, X.; Stefanetti, G.; Berti, F.; Kasper, DL A poliszacharid szerkezet határozza meg a glikonjugátum vakcinákra adott adaptív immunválasz mechanizmusát. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2019, 116, 193–198. [CrossRef]

11. Niehues, T.; Bogdan, C.; Hecht, J.; Mertens, T.; Wiese-Posselt, M.; Zepp, F. Impfen bei Immundefizienz. Bundesgesundheitsblatt Gesundh. Gesundh. 2017, 60, 674–684. [CrossRef]

12. Tobudic, S.; Plunger, V.; Sunder-Plassmann, G.; Riegersperger, M.; Burgmann, H. Véletlenszerű, egyszeresen vak, ellenőrzött vizsgálat a pneumococcus elleni vakcináció elsődleges fokozási stratégiájának értékelésére vesetranszplantált betegeknél. PLoS ONE 2012, 7, e46133. [CrossRef]

13. Dendle, C.; Stuart, RL; Mulley, WR; Holdsworth, SR Pneumococcus elleni védőoltás felnőtt szilárd szervátültetett betegeknél: A jelenlegi bizonyítékok áttekintése. Vakcina 2018, 36, 6253–6261. [CrossRef]

14. Hoffman, TW; Meek, B.; Rijkers, GT; Grutters, JC; van Kessel, DA Pneumococcus konjugált vakcináció, majd pneumococcus poliszacharid vakcináció tüdőtranszplantációra jelölteknél és recipienseknél. Transpl. Közvetlen 2020, 6, e555. [CrossRef]

15. Oesterreich, S.; Lindemann, M.; Goldblatt, D.; Horn, PA; Wilde, B.; Witzke, O. Humorális válasz egy 13-valens pneumococcus konjugált vakcinára vesetranszplantált betegeknél. Vakcina 2020, 38, 3339–3350. [CrossRef]

16. Blanchard-Rohner, G.; Enriquez, N.; Lemaitre, B.; Cadau, G.; Giostra, E.; Hadaya, K.; Meyer, P.; Gasche-Soccal, PM; Berny, T.; van Delden, C.; et al. Pneumococcus immunitás és PCV13 vakcina válasz SOT jelöltekben és recipiensekben. Vakcina 2021, 39, 3459–3466. [CrossRef]

17. Wuorimaa, T.; Kayhty, H.; Eskola, J.; Bloigu, A.; Leroy, O.; Surcel, HM A sejt által közvetített immunitás aktiválása pneumococcus konjugátummal vagy poliszacharid vakcinával végzett immunizálást követően. Scand. J. Immunol. 2001, 53, 422–428. [CrossRef]

18. Rabian, C.; Tschope, I.; Lesprit, P.; Katlama, C.; Molina, JM; Meynard, JL; Delfraissy, JF; Chene, G.; Levy, Y.; Csoport, APS Celluláris CD4 T-sejt-válaszok a konjugált pneumococcus vakcina diftériából származó hordozófehérjére és antitestválasz pneumococcus elleni vakcinációra HIV-fertőzött felnőtteknél. Clin. Megfertőzni. Dis. 2010, 50, 1174–1183. [CrossRef]

19. Gazi, U.; Karasartova, D.; Sahiner, IT; Gureser, AS; Tosun, O.; Derici, MK; Dolapci, M.; Taylan Ozkan, A. A lépeltávolítás hatása a PCV-13-indukált memória B- és T-sejtek szintjére. Int. J. Clin. Gyakorlat. 2018, 72, e13077. [CrossRef]

20. Karasartova, D.; Gazi, U.; Tosun, O.; Gureser, AS; Sahiner, IT; Dolapci, M.; Ozkan, AT Anti-pneumococcus Vaccine Induced Cellular Immune Responses in Posttraumatic Splenectomized Individuals. J. Clin. Immunol. 2017, 37, 388–396. [CrossRef]

21. Glennie, SJ; Sepako, E.; Mzinza, D.; Harawa, V.; Miles, DJ; Jambo, KC; Gordon, SB; Williams, NA; Heyderman, RS A Streptococcus pneumoniae-ra adott károsodott CD4 T-sejt-memóriaválasz megelőzi a CD4 T-sejtek kimerülését HIV-fertőzött malawi felnőtteknél. PLoS ONE 2011, 6, e25610. [CrossRef]

22. Sepako, E.; Glennie, SJ; Jambo, KC; Mzinza, D.; Iwajomo, OH; Banda, D.; van Oosterhout, JJAWN; Gordon, SB; Heyderman, RS A pneumococcus CD4 T-sejtes immunitás hiányos helyreállítása az antiretrovirális terápia megkezdése után HIV-fertőzött malawi felnőtteknél. PLoS ONE 2014, 9, e100640. [CrossRef]

23. Baril, L.; Dietemann, J.; Essevaz-Roulet, M.; Beniguel, L.; Coan, P.; Briles, DE; Guy, B.; Cozon, G. A pneumococcus felszíni fehérje A (PspA) hatékonyan váltja ki a T-sejt által közvetített válaszokat invazív pneumococcus-betegség esetén felnőtteknél. Clin. Exp. Immunol. 2006, 145, 277–286. [CrossRef]

24. Jaat, FG; Hasan, SF; Perry, A.; Cookson, S.; Murali, S.; Perry, JD; Lanyon, önéletrajz; De Soyza, A.; Todryk, SM Az antibakteriális antitestek és a T-sejtes válaszok bronchiectasisban eltérően kapcsolódnak a tüdő kolonizációjához és betegségéhez. Respir. Res. 2018, 19, 106. [CrossRef]

25. Groneck, L.; Schrama, D.; Fabri, M.; István, TL; Harms, F.; Meemboor, S.; Hafke, H.; Bessler, M.; Becker, JC; Kalka-Moll, WM Oligoklonális CD4 plusz T-sejtek elősegítik a gazdaszervezet memória immunválaszát a Streptococcus pneumonia ikerionos poliszacharidjára. Megfertőzni. Immun. 2009, 77, 3705–3712. [CrossRef]

26. Holtmeier, W.; Kabelitz, D. Gamma delta T-sejtek összekapcsolják a veleszületett és adaptív immunválaszokat. Chem. Immunol. Allergy 2005, 86, 151–183. [CrossRef]

27. Kirby, AC; Newton, DJ; Kártolás, SR; Kaye, PM Bizonyíték a tüdő-specifikus gamma-delta T-sejt-alcsoportok részvételére a Streptococcus pneumoniae fertőzésre adott helyi válaszokban. Eur. J. Immunol. 2007, 37, 3404–3413. [CrossRef]

28. Kanevskiy, LM; Telford, WG; Szapozsnyikov, AM; Kovalenko, EI A lipopoliszacharid IFN-gamma termelést indukál humán NK sejtekben. Elülső. Immunol. 2013, 4, 11. [CrossRef]

29. Lindemann, M.; Heinemann, FM; Horn, PA; Witzke, O. Immunitás pneumococcus antigénekkel szemben vesetranszplantált betegeknél. Transzplantáció 2010, 90, 1463–1467. [CrossRef]

30. Goldblatt, D.; Plikaytis, BD; Akkoyunlu, M.; Antonello, J.; Ashton, L.; Blake, M.; Burton, R.; Care, R.; Durant, N.; Feavers, I.; et al. Új humán pneumococcus standard referencia szérum, 007sp. Clin. Vaccine Immunol. 2011, 18, 1728–1736. [CrossRef]

31. Lindemann, M.; Barsegian, V.; Siffert, W.; Ferencik, S.; Roggendorf, M.; Grosse-Wilde, H. A G-protein béta3 C825T alegységének és a HLA II. osztályú polimorfizmusainak szerepe a HBV-oltás utáni immunválaszban. Virology 2002, 297, 245–252. [CrossRef]

32. Lindemann, M.; Klisanin, V.; Thümmler, L.; Fisenkci, N.; Tsachakis-Mück, N.; Ditschkowski, M.; Schwarzkopf, S.; Klump, H.; Reinhardt, HC; Horn, PA; et al. Humorális és sejtes vakcinázási válaszok a SARS-CoV-2 ellen vérképző őssejt-transzplantált betegeknél. Vaccines 2021, 9, 1075. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com