A farneziltranszferáz gátló LNK{0}} enyhíti az axonális disztrófiát és csökkenti az amiloid patológiát egerekben 3. rész

Eredmények

Csökkent amiloid plakk terhelés és tau hiperfoszforiláció az LNK-754-el krónikusan kezelt 5XFAD egerek agyában

Az LNK-754 és a lonafarnib kis molekulájú FTI-k, amelyeket korábban embereken teszteltek rák klinikai vizsgálatok során, és amelyekről ismert, hogy átjutnak a vér-agy gáton [8, 9, 41, 42]. A -synuclein [8] és a tau zárványokat [9] az LNK-754 és a lonafarnib redukálja, de még nem értékelték az AD amiloid fenotípusával szemben. Ebben a tanulmányban az amiloid patológiára gyakorolt ​​hatásukat vizsgáltuk az 5XFAD egérmodellben. Az 5XFAD egerekben 2 hónapos koruktól kezdve A-lerakódások alakulnak ki [36, 37], és az amiloid lerakódás legkorábbi stádiumában disztrófiás neuritok figyelhetők meg [39, 43].

A vér-agy gát és az immunitás az emberi test két nagyon fontos része, és elválaszthatatlanul összefüggenek. A vér-agy gát egy védőgát az agy és a vér között, amely megvédi az agyat a kívülről érkező káros anyagoktól. Az immunitás fontos mechanizmusa az emberi szervezetnek, hogy ellenálljon a betegségeknek. Tehát mi a specifikus kapcsolat a vér-agy gát és az immunitás között?

Először is, a vér-agy gát meg tudja akadályozni bizonyos káros baktériumok és vírusok bejutását az agyba, ezáltal megvédi az agyat a károsodástól. Ezen túlmenően a vér-agy gát bizonyos anyagok áteresztőképességét is szabályozni tudja, így azok csak korlátozottan juthatnak be az agyba. Ez kritikus az idegrendszer egészségének védelme szempontjából, mivel bizonyos belső anyagok túl sok az agyba kerülve idegsejt-károsodást okozhat.

Ugyanakkor az immunitás az agy védelmében is szerepet játszhat. Az emberi szervezet immunrendszere képes felismerni a kórokozókat és a káros anyagokat, majd megfelelő antitesteket termelni, amelyek ellenállnak a behatolásuknak, így megvédik a szervezetet a betegségektől. Amikor azonban bizonyos kórokozók vagy anyagok átjutnak a vér-agy gáton, és bejutnak az agyba, az immunrendszer gyorsan reagál, és antitesteket termel, amelyek megtámadják és eliminálják őket.

Ezért a vér-agy gát és az immunitás nagyon fontos szerepet játszik az emberi egészség megőrzésében. A vér-agy gát megakadályozza a káros anyagok bejutását az agyba, míg az immunitás eltávolítja a kórokozókat és egyéb káros anyagokat, amelyek a vér-agy gátat megkerülve az agyba jutnak. A kettő együttesen biztosítja az agy egészséges működését.

Összefoglalva, a vér-agy gát és az immunitás a megfelelő mechanizmusokon keresztül együttműködve fontos szerepet játszanak az emberi egészségben. Egészségük védelmére kell összpontosítanunk, hogy biztosítsuk a test általános egészségét. Látható, hogy javítanunk kell a memóriánkat. A Cistanche deserticola jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche deserticola egy hagyományos kínai gyógyászati ​​anyag, számos egyedi hatással, amelyek közül az egyik a memória javítása. A darált hús hatékonysága a benne található számos hatóanyagnak köszönhető, beleértve a savakat, poliszacharidokat, flavonoidokat stb. Ezek az összetevők számos módon elősegíthetik az agy egészségét.

Kattintson a know-kiegészítőkre a memória javítása érdekében

Ezért, hogy egybeessen az amiloid patológia kialakulásával 5XFAD egerekben, az egereket 3 hónapon keresztül krónikusan kezeltük LNK-754 vivőanyaggal és lonafarnibbel, 2 hónapos koruktól kezdve. Az LNK-754-t és a lonafarnibot 0,5% nátrium-karboxi-metil-cellulózt tartalmazó vivőanyagban oldottuk fel, és naponta 1 mg/kg dózisban intraperitoneálisan injektáltuk [8, 44].

Először immunfluoreszcens mikroszkóppal próbáltuk meghatározni a krónikus LNK-754 és lonafarnib kezelés A plakkterhelésre gyakorolt ​​hatását 5XFAD egerekben az A 42-re, amely mind a diffúz, mind az aggregált amiloidot és a tiazinvöröst (TR), amely csak fibrilláris plakkot észlel. magok (1A. ábra; S1. ábra). Az LNK754-kezelt egerek agykérgi régióiban szignifikáns csökkenést tapasztaltunk a fedett területen a vivőanyaggal kezelt kontrollokhoz képest (1B. ábra). A hippocampusban a fedett terület szignifikánsan csökkent az LNK-754-kezelt egerekben a lonafarnibbal kezelt egerekhez képest, és tendencia volt az LNK-754-kezelt egerek számának csökkenése a hordozóval kezelt egerekhez képest (1. ábra). 1C).

A lonafarnibbal kezelt egerek 42 fm-es területe nem különbözött szignifikánsan a vivőanyaggal kezelt egerektől sem a kéregben, sem a hippocampusban (1A, B ábra). A plakk mérete csökkent az agykérgi és hippocampális régiókban az LNK-754 kezelés hatására a hordozó kezeléshez képest; ez a különbség statisztikailag szignifikáns volt a hippocampusban (1D. ábra, E; S2A, B. ábra). Szignifikáns különbséget figyeltek meg a plakk méretében a lonafarnib- és az LNK-754-kezelés között a hippocampusban is (1D. ábra, E; S2A, B ábra).

A plakk mérete nem változott a lonafarnibbal kezelt egerekben a vivőanyaggal kezelt egerekhez képest a kérgi vagy hippocampális agyi régiókban (1D. ábra, E; S2A, B ábra). A plakk beoltását a plakk számának TR festéssel történő elemzésével határoztuk meg. A plakkok száma szignifikánsan csökkent az LNK-754 kéregében, de nem a hippocampusban, a vivőanyaggal kezelt egerekhez képest (S2C, D ábra). A csökkent plakkterhelést az A42 mérése ELISA-val igazolta PBS-ben és guanidinoldható hemiagy-homogenizátumban (1F., G. ábra). Az immunfluoreszcenciás mikroszkópos eredményeinkhez hasonlóan a lonafarnibbal kezelt egerekben a guanidin- és PBS-frakciókban alacsonyabb A 42-szint irányába mutatott, míg a guanidinfrakciókban szignifikánsan alacsonyabb A 42-szintet értek el LNK-754 kezeléssel (2. ábra). 1. F, G).

Mivel az 5XFAD egérmodellben nemi alapú hatásokról számoltak be a steady-state APP-szintekre és a plakkterhelésre vonatkozóan [45, 46], külön immunblotot végeztünk vivőanyaggal, LNK{5}}-vel vagy lonafarnibbal kezelt hím és nőstény egereken. transzgenikus APP expresszióhoz (S3A ábra). A transzgenikus APP-szinteket immunblottal mértük az APP 6E10 antitesttel, amely csak a humán APP-t ismeri fel, és nem változott az LNK-754-val, lonafarnibbel vagy vivőanyaggal kezelt hím vagy nőstény egerekben (S3B-D. ábra). Az AD második meghatározó jellemzője a hiperfoszforilált tau zárványok jelenléte az agyban, és a plakk lerakódásával együtt az endogén egér tau hiperfoszforilálódik 5XFAD egerekben [47, 48].

Annak meghatározására, hogy a tau hiperfoszforilációját befolyásolta-e az FTI-kezelés egy amiloid egérmodellben, immunoblot analízist végeztünk a 404-es szerinnél (1H. ábra; S3E. ábra), amely epitópról ismert, hogy hiperfoszforilált AD agyban és 5XFAD egerekben. 47, 49]. Itt csökkent foszfo-tau ser404-szintet találtunk a lonafarnibbal és LNK{9}}-vel kezelt egerek agyában (1I. ábra), míg a teljes tau-szint változatlan maradt (1J. ábra; S3F. ábra). Eredményeink összességében azt mutatják, hogy az 5XFAD egérmodellben az FTI-vel végzett farmakológiai kezelés csökkenti az amiloid plakk terhelést és a patogén tau foszforilációt, bár az LNK-754 kezelés lényegesen hatásosabb volt, mint a lonafarnib.

Az LNK-754-gyel végzett krónikus kezelés gátolja a fehérje farnezilációt az 5XFAD egerek agyában

Annak igazolására, hogy az FTáz LNK{0}} és lonafarnib ip injekcióval történő megcélzása gátolta a fehérje farnezilációt 5XFAD egerek agyában, megvizsgáltuk az FTáz gátlás különböző FTáz szubsztrátjait és downstream markereit vivőanyaggal (LNK) krónikusan kezelt 5XFAD egerek hemiagy homogenizátumaiban. -754 vagy lonafarnib immunoblot elemzéssel. Először elemeztük az A prelamint, amely az FTase gátlásakor felhalmozódik [50]. A prelamin A növekedését figyelték meg az LNK-754-mal kezelt egerek agyában a vivőanyaghoz képest, míg a lonafarnibbel kezelt egerekben nem történt változás (S4A, D ábra). Ezt követően megvizsgáltuk a HDJ-2-t, egy chaperon-fehérjét, amely az FTI-kezelést követően mobilitás-eltolódáson megy keresztül, és amelyet széles körben használnak az FTáz-gátlás markereként [50]. Az A prelaminnal összhangban a HDJ{10}} lassabban vándorló formája jelen volt az LNK-754-kezelt egerekben, de a lonafarnibbal kezelt egerekben nem (S4B, E ábra). A HDJ-2 lassabban vándorló fajtáinak szignifikáns növekedését tapasztalták az LNK754 egerekben a hordozóval vagy lonafarnibbal kezelt egerekhez képest (S4E ábra).

Ezenkívül a farneziláció aktiválja a Ras-t, ezért mértük az ERK1 (P44/P42) downstream effektormolekulájának foszforilációját is (S4C ábra). Míg a HDJ-2 és a prelamin A nem változott a lonafarnib-kezelés hatására, a pERK1 csökkenése irányába mutatott tendencia (S4F ábra). A pERK1 szintén csökkent az LNK-754-val kezelt egerekben (S4F ábra). Eredményeink arra utalnak, hogy 1 mg/kg LNK-754 gátolta az FTázt az agyban, a lonafarnib azonban kevésbé volt hatékony. Ennek oka lehet a lonafarnib alacsonyabb hatékonysága és IC50-értéke, amint azt korábban bemutattuk [41, 51], vagy esetleg csökkent agyi expozíció.

Csökkent LAMP1-felhalmozódás dystrophiás neuritokban LNK-754-gyel krónikusan kezelt 5XFAD egerekben

Egészséges idegsejtekben a lizoszómális komponensek az endoszómákba és a disztális neuritokban lévő autofág organellákba kerülnek, amelyek a neuronális szóma felé történő retrográd forgalom során savasodnak és érettek [52, 53]. Az amiloid plakkok megzavarják ezt a folyamatot, és disztróf neuritokat eredményeznek, amelyek bezárják a diszfunkcionális autofág és endolizoszómális organellákat.

A dystrophiás neuritok blokkolják a BACE1 axonális transzportját, ami A generációhoz vezet a dystrophiás neuriton belül és extracelluláris plakklerakódáshoz [16–18]. Az FTI-kről ismert, hogy fokozzák a lizoszómális funkciót és a mikrotubulusok stabilitását, ezért annak további vizsgálatához, hogy az FTI-k hogyan csökkentik a plakkterhelést, kifejezetten az 5XFAD egerek disztrófiás neuritjaira összpontosítottunk.

A plakkok körüli disztrófiás neuritok felhalmozódásának számszerűsítésére értékeltük a lizoszóma-asszociált membránproteint 1-et (LAMP1), amely a heterogén endolizoszomális és autofág organellumok markere. A vivőanyaggal, LNK{4}}-vel és lonafarnibbal kezelt 5XFAD egerek hippocampális és kérgi agyszöveteit együtt festettük LAMP1-re és A42-re, és konfokális immunfluoreszcens mikroszkópiát végeztünk (2A, B ábra).
Egy küszöböt határoztak meg a LAMP1 fluoreszcencia jelek kiküszöbölésére az egészséges idegsejtekben és szómákban lévő vezikulákból, hogy specifikusan elemezzék a disztrófiás neuritokat. A LAMP1 fedett terület szignifikánsan csökkent az LNK-754-vel kezelt egerek kérgi és hippocampális agyi régióiban (2C., D. ábra), míg a lonafarnibbel kezelt egerekben nem figyeltek meg különbséget a vivőanyaggal kezelt egereknél (2C., D. ábra). . Az amiloid plakkok lerakódása disztrófiák kialakulását indítja el a közeli idegsejtekben, elsősorban az axonokban és a preszinaptikus terminálisokban.

Ennek megfelelően az LNK-754 és a lonafarnib dystrophiás neuritokra gyakorolt ​​hatása összhangban van a plakkterhelésre gyakorolt ​​hatásukkal (1. ábra). Az FTI-kezelésnek a dystrophiás neuritokra gyakorolt ​​hatásának további elemzését a LAMP1 fedett terület és az A42 terület arányának számszerűsítésével végeztük annak meghatározására, hogy az FTI-k korlátozzák-e a dystrophia méretét a plakkok körül. Csökkent a LAMP1:A 42 arány az LNK-754-el kezelt egereknél a hordozó egerekhez képest, és az LNK-754- és lonafarnib-kezelés szignifikánsan különbözött (2E. és F. ábra), ami arra utal, hogy az LNK -754 egerek kevesebb disztrófiás neurittal társultak.
Emelkedett LAMP1-szinteket találtak LNK{1}}-val vagy lonafarnibbal kezelt egerek hemiagy-homogenizátumaiban (S5A, B ábra), összhangban a korábbi tanulmányokkal, amelyek szerint a lonafarnib és az LNK-754 növeli az autolizoszómák számát és lizoszómális membránfehérjék és hidrolázok szintje [8, 9]. A LAMP1 immunblot analízisének eredményeivel összhangban (S5A, B ábra), a teljes LAMP1 immunfestődés átlagos fluoreszcencia intenzitása szignifikánsan megnőtt az LNK-754 és lonafarnib-kezelt egerek agyában, összehasonlítva a hordozóval kezelt egerekkel (1. ábra). S5C, D).

Ellentétben a teljes LAMP1 fluoreszcencia szinttel, az átlagos LAMP1 fluoreszcencia intenzitása dystrophiás idegsejtekben változatlan volt a hordozó, az LNK -754 és a lonafarnib-kezelt egerek között (S5E, F ábra). Az LNK-754-vel kezelt egerek kéregében a LAMP1 fluoreszcencia intenzitása disztrófiákban és a plakkterhelésben erősen korrelált, míg a disztrófiák LAMP1 intenzitása és a plakkterhelés között nem találtak összefüggést a lonafarnibbal vagy a hordozóval kezelt egerekben (2G. ábra, H), amely összefüggést tár fel a dystrophius neurit LAMP1 felhalmozódása és a plakk terhelés között LNK-754 egerekben. A hippocampusban a disztrófiák LAMP1 intenzitása és a plakk-terhelés közötti összefüggés irányába mutató tendenciát figyeltek meg. Eredményeink együttesen azt mutatják, hogy az LNK-754 kezelés növeli a LAMP1 összszintjét, ugyanakkor csökkenti a LAMP1 kóros felhalmozódását az 5XFAD egerekben rendszerint jelenlévő dystrophiás neuritokban.

Csökkent BACE1-felhalmozódás dystrophiás neuritokban LNK-754-gyel krónikusan kezelt 5XFAD egerekben

A LAMP1 az endolizoszomális organellumok membránjain található, amelyek az axonális BACE1-et az érett lizoszómák felé irányítják lebontás céljából. Ezért az FTI-k gátolhatják az A-generációt és az extracelluláris plakkok lerakódását azáltal, hogy csökkentik az axonális disztrófia kialakulását és a BACE1 felhalmozódását a plakkok körül. E hipotézis alátámasztására a dystrophiás neurit LAMP1 szint és a plakk terhelés erősen korrelált az LNK-754 egerek agykérgi régióiban.

A LAMP1 immunfestéssel kapcsolatos elemzésünk feltárta, hogy a vivőanyaggal vagy lonafarnib-kezeléssel összehasonlítva az LNK-754-vel kezelt 5XFAD egerekben a plakkok kevesebb disztrófiás neurittal társultak (2. ábra). Annak megállapítására, hogy a BACE1 szintje a dystrophiás neuritokban hasonlóan csökkent-e plakkonként, konfokális immunfluoreszcencia mikroszkópos vizsgálatot végeztünk a BACE1 hordozó, LNK{5}} és lonafarnibbal kezelt egerek kérgi és hippocampális agyszöveteiről, a LAMP1 és A 42 mellett. (3A, B ábra).

Itt a BACE1-gyel fedett terület szignifikánsan csökkent az LNK-754-vel kezelt egerek agykérgi régióiban, a lonafarnibbal kezelt egereknél pedig egy tendenciát figyeltek meg (3C. ábra). A hippocampus disztrófiás neuritjaiban a BACE1-gyel fedett terület elemzését hátráltatta a BACE1 magas expressziós szintje a CA3 hippocampalis mohorost útvonal preszinaptikus terminálisaiban [17]. Ezenkívül elemeztük, hogy disztrófiás neuritokban kevesebb BACE1 lokalizálódott-e az endolizoszómákban, a BACE1 és LAMP1 Pearson-féle korrelációs együtthatójának mérésével disztrófiákban. A plakkonkénti BACE1 és LAMP1 együttes lokalizációban szignifikáns csökkenést találtak LNK{14}}kezelt egerek agykérgi régióiban a hordozóval kezelthez képest (3D. ábra).

A hippocampusban a plakkonkénti BACE1 és LAMP1 együttes lokalizáció szignifikáns csökkenése volt tapasztalható az LNK-754 esetében a lonafarnibhoz képest, az LNK-754 kezelésnél pedig csökkenést figyeltek meg a vivőanyaghoz képest (3. ábra). 3E). Ezek az eredmények összhangban vannak a plakkterhelésre és a LAMP1 fedett területre vonatkozó megállapításainkkal, és tovább támasztják azt az elképzelést, hogy az LNK{7}} kezelés csökkentette a disztrófiás neuritok képződését, csökkentve a károsodott endolizoszómális organellumok felhalmozódását, amelyek a BACE1-et célozzák a lebontás érdekében.

Az LNK-754-gyel végzett akut kezelés csökkenti a késői endoszóma- és lizoszóma-felhalmozódást dystrophiás neuritokban 5XFAD egerekben élő agyszeletekben

Ezt követően az LNK{0}} és a lonafarnib dystrophiás neuritokra gyakorolt ​​akut hatását teszteltük élő agyszövetek konfokális képalkotásával. Ebben a kísérletben 5-hónapos 5XFAD egereknek naponta vivőanyagot, LNK-t-754 vagy lonafarnibot fecskendeztek be 3 héten keresztül. A szöveteket LysoTracker-Green (LT) szondával festettük meg, egy szondával, amelyet gyakran használnak az élő sejtekben a savasodott késői endoszómák és lizoszómák nyomon követésére és szelektív azonosítására [53]. Az LT és tiazinvörös festődés mintázata összhangban volt az 5XFAD egerekben a disztrófiás neurit markerekre vonatkozó immunfestési eredményeinkkel (2A., B. ábra; 3A., B. ábra); Az LT-pozitív késői endoszómák és lizoszómák nagymértékben koncentrálódtak a disztrófiás neuritokban, amelyek szorosan kapcsolódnak az élő agyszövetekben lévő amiloid plakkokhoz (4A. ábra).

A 5-hónapos 5XFAD egerek LNK-754 vagy lonafarnib akut 3-hetes kezelése nem volt elegendő a plakk méretének csökkentésére (4B. ábra), bár az LNK-754 kezelés okozta a plakkonkénti LT:TR arány és a dystrophiás neuritméret szignifikáns csökkenése (4C, D ábra). Érdekes módon a LAMP1-re vagy BACE1-re vonatkozó eredményeinkkel ellentétben az akut lonafarnib-kezelés csökkentette a disztrófia méretét és az LT:TR plakkonkénti arányát is (4C, D ábra). A disztróf neurit mérete és a plakk mérete erősen korrelált az LNK-754-vel kezelt 5XFAD egerekben (4F. ábra), és szignifikáns összefüggést figyeltek meg a lonafarnibbel kezelt egerekben is (4G. ábra). Nem volt összefüggés a vivőanyaggal kezelt egerekben (4E. ábra). Eredményeink megerősítik, hogy az LNK-754 csökkentette az axonális disztrófiát, és arra utalnak, hogy az FTI-k még kiterjedt plakklerakódás és axondegeneráció után is gyengíthetik a késői endoszóma- és lizoszóma-felhalmozódást a plakkok körül.

A tanulási és memóriazavarok javulása hAPP/PS1 egerekben rövid távú LNK-754 kezelés után

Az LNK-754 megakadályozta a LAMP1, BACE1 és LT felhalmozódását dystrophiás neuritokban 5XFAD egerekben, ami arra utal, hogy az LNK-754 kezelés véd az A-vel összefüggő szinaptikus diszfunkció ellen. Annak értékelésére, hogy az LNK-754-kezelés jótékony hatással volt-e a kognitív funkciókra, megvizsgáltuk az orális LNK-754-kezelés rövid távú hatásosságát a térbeli tanulásra és a memóriára a hAPP/PS1 AD egérmodellben [40]. . A Morris Water Maze (MWM) vizsgálata szerint a hAPP/PS1 egerek térbeli memóriája javult 12 napos LNK-754 orális kezelés után.

A rejtett platformon végzett tréningek során az LNK{0}}-vel kezelt hAPP/PS1 egerek gyorsabban megtanulták megtalálni a platformot, mint a járművel kezelt hAPP/PS1 egerek, ami a járművel kezelt hAPP-okétól jelentősen eltérő tanulási görbét eredményezett. /PS1 kontroll egerek (5A. ábra). A vivőanyaggal kezelt hAPP/PS1 egereknek szignifikánsan több időbe telt megtalálni a platformot, mint a vivőanyaggal kezelt vad típusú kontrolloknál a kiképzési kísérletek 4. és 7. napján, míg az LNK-754-vel kezelt hAPP/ között nem találtunk szignifikáns különbséget. PS1 egerek és hordozóval kezelt vad típusú egerek (5A-C. ábra).

A próbateszt során az LNK{0}}kezelt hAPP/PS1 állatoknál megnövekedett a célnegyedben eltöltött idő (5D. ábra), és megnövekedett a peron keresztezési gyakorisága (5E. ábra), ami összehasonlítható a járművel kezelt vad típusú állatokkal . A 42 szintet ELISA-val mértük, és változatlanok voltak a vivőanyaggal kezelt vagy LNK{8}}kezelt hAPP/PS1 egerek oldható és oldhatatlan agyi homogenizátumaiban (5F, G ábra), ami arra utal, hogy a jobb memória és a térbeli tanulás nem az LNK{11}}-vel kezelt hAPP/PS1 egerek csökkent amiloidterhelésének eredménye.

For more information:1950477648nn@gmail.com