A vese képalkotása: a fénytől a szuperfelbontású mikroszkópig
Mar 17, 2022
Kapcsolatfelvétel: ali.ma@wecistanche.com
Maria Lucia Angelotti1,2, Giulia Antonelli1,2 Carolina Conte1,2és Paola Romagnani1,2
ABSZTRAKT
A fontos eredmények avesefiziológiai és patofiziológiai mechanizmusok nagyrészt a mikroszkópos technológia fejlődésének tulajdoníthatók. Sok mindent tudunk az építészetrőlveseaz anatómiai mikroszkóposok alapvető leírásain alapul fénymikroszkópos, majd később elektronmikroszkópos ultrastrukturális elemzésen. Ezt a két technikát használták a vesebetegségek első osztályozási rendszeréhez és azok folyamatos frissítéséhez. A közelmúltban egy sor új képalkotó technikával kiegészítették az elemzést az idő és a tér további dimenzióiban. A konfokális mikroszkópia lehetővé tette számunkra, hogy szekvenciálisan megjelenítsük az optikai metszeteket a z tengely mentén, és a speciális elemzőszoftver elérhetősége lehetővé tette a vastagabb szövetminták háromdimenziós megjelenítését. A többfoton mikroszkópia lehetővé tette számunkra, hogy egyidejűleg vizsgáljuk megvesefunkciója és szerkezete valós időben. A fluoreszcencia-élettartamú képalkotó mikroszkópia lehetővé tette a metabolitok térbeli eloszlásának tanulmányozását. A szuperfelbontású mikroszkóppal az érzékenység és a felbontás akár nanoméretű szintig is megnőtt. A krio-elektron mikroszkóppal a kutatók az egyes biomolekulákat közvetlenül a szövetekben atomi szinten vizualizálhatták, és megérthetik kölcsönhatásukat a szubcelluláris szinten. Végül a mátrix-asszisztált lézeres deszorpciós/ionizációs képalkotó tömegspektrometria több száz különböző molekula egyidejű mérését tette lehetővé szövetmetszeteken nagy felbontásban. Ez az áttekintés áttekintést nyújt a rendelkezésre állókrólveseképalkotási stratégiák, különös tekintettel a legújabb technológiai fejlesztések lehetséges hatásaira.
Kulcsszavak:immunhisztokémia,vesebiopszia, podociták,proximáliscsatorna, őssejtek
Cistanche herba vesebetegségre, kattintson ide a minta megtekintéséhez
BEVEZETÉS
Azveselenyűgöző szerkezeti összetettségre van szükség a különféle élettani funkcióinak betöltéséhez. Kezdetben tanulmányozva avesemakroszkópos megfigyelésekre korlátozódott, és a vesebetegségek diagnosztizálásához való hozzájárulásuk tagadhatatlanul korlátozott volt. A klinikai megnyilvánulásokat leírták, de a mögöttes patogenetikai mechanizmusok ismeretlenek. A vese fiziológiájának és patofiziológiájának megértésében elért eredmények nagyrészt a mikroszkópia terén elért folyamatos fejlődésnek tulajdoníthatók. Kísérletekvesea képalkotás nagyon régen elkezdődött [1]. 1666-ban Malpighi anatómus megvizsgáltaveseszövet fénymikroszkóppal, amelynek becsült teljesítménye 25–30 volt, és először írta le a glomerulust, mint „mirigyet, amelyben a vizelet elkülönül a vértől”[2]. Ezt a hozzájárulást figyelmen kívül hagyták 1842-ig, amikor is Sir William Bowman 10-szer erősebb fénymikroszkóppal feltárta a nefronszerkezeteket. Bowman felfedezte a periglomeruláris kapszulát (később Bowman-kapszulának nevezték el), amely anatómiailag kapcsolódik a tubulus első részéhez [3]. 1862-ben Jacob Henle leírta a nevét felvevő hurokszerű tubulusszakaszt, amely összeköti a kérgi tubulust és a vesepapillát.
A fénymikroszkópia bevezetésének köszönhetően a hisztomorfológiai osztályozás avesebetegségeklehetségessé vált [1]. A beteg vesékben végbemenő események megfigyelésének lehetősége lehetővé tette, hogy megértsük, hogy a kóros elváltozások jelentősen eltérnek a hasonló klinikai megnyilvánulásokkal rendelkező betegek között. A veseszövet kóros elváltozásaira vonatkozó első vizsgálatok azonban boncolási mintákon történtek, amelyek többnyire krónikus betegségek leírásához vezettek. A vesepatológiák evolúciójáról és az autolitikus jelenségek technikai problémáiról, a poszt mortem szövetek felhasználásával összefüggő információk hiánya korlátozta az emberi betegségek ismereteit. 1951-ben a bevezetéseveseA biopszia nemcsak a krónikus, hanem az akut vesebetegségek közvetlen megfigyelését és tanulmányozását is lehetővé tette. Mindeközben a mikroszkópia fokozatosan kifinomultabbá vált, fokozatosan növekvő érzékenységgel és felbontással egészen nanoméretű szintig. Ebben az áttekintésben áttekintést adunk azokról az alapvető vese-felfedezésekről, amelyeket a mikroszkópos technológia fejlődése tette lehetővé, különös tekintettel a legújabb technikai fejlesztésekből adódó lehetőségekre.
A VESE IMMUNOPATOLÓGIÁJÁNAK VIZUALIZÁLÁSA
Immunjelölés és fluoreszcens mikroszkópia
Az élő szövet reprezentatív fragmensének kinyerésének lehetősége lehetővé tette a kialakulóban lévő, maximális szövetmegőrzést igénylő technikák alkalmazását, mint például az immunhisztokémiai módszerek (először fluoreszcens, majd enzimatikus). Valójában 1950-ben Coons kifejlesztette az antitestek fluoreszcein-izocianáttal, azaz immunfluoreszcenciával történő jelölésének módszerét anélkül, hogy tönkretenné a szöveti antigénjeikkel való specifikus reakcióképességet. Azóta az immunfluoreszcenciát beépítették a fagyasztott vesebiopsziás minták értékelésére szolgáló diagnosztikai eljárásba. Ezek a technikák először tették lehetővé az intrarenális immunglobulinok (Ig) és a komplement lerakódások megfigyelését glomerulonephritisben szenvedő betegeknél, hozzájárulva bizonyos nem specifikus szöveti elváltozások hátterében álló különböző patofiziológiák megkülönböztetéséhez, például a félholdas glomerulonephritisben [4]. Ezenkívül a jellegzetes festődési mintázat megfigyelésének lehetősége és a fluoreszceinnek az immunglobulin G-n (IgG) eltérő antitestekhez való kapcsolódása az immunglobulin A (IgA) lerakódások felismeréséhez vezetett IgA nephropathiában, valamint komplement lerakódások posztinfekciós glomerulonephritisben. és membranoproliferatív glomerulonephritis [4].
Konfokális mikroszkópia
A fluoreszcens mikroszkópia jelentős technikai fejlődésen ment keresztül a konfokális mikroszkópia bevezetésével az 1980-as évek végén. A konfokális mikroszkópia kulcsfontosságú elemei a pontszerű megvilágítás, amelyet a mintára fókuszálnak és pásztáznak, valamint a detektor előtt egy változtatható konfokális rekesz (pinhole), amely lehetővé teszi a fény gyűjtését a fókuszsík körüli vékony szakaszból (úgynevezett optikai szakasz). A konfokális mikroszkópia lehetővé tette a vese első in vivo kísérleti modellekben történő vizsgálatát, valamint a fluoreszcens molekulák felvételének és transzportjának megfigyelését ép tubulusokon keresztül.vesemikropunkció után. Ez lehetővé tette a tubuláris funkció tanulmányozását fiziológiás és kóros állapotokban [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, a látható fény diffrakciós határa, a fényfehérítés és a fototoxicitás miatt.
A GLOMERULÁRIS SZŰRÉS GÁLYÁNAK MEGÉRTÉSE: ELEKTRON MIKROSZKÓPIA
Az első kísérlet a fény- és fluoreszcens mikroszkópok felbontási határának leküzdésére 1931-ben volt, amikor Ernst Ruska és Max Knoll feltalálta az elektronmikroszkópot (EM), amely fénysugár helyett felgyorsított elektronsugarat használ gerjesztő forrásként. és nagyobb a felbontóképessége, mint a fénymikroszkópoké (legfeljebb 0,2 nm). Ernst Ruska ezért az újításért 1986-ban fizikai Nobel-díjat kapott. A megnövekedett felbontási teljesítménynek köszönhetően hamar nyilvánvalóvá vált, hogy a glomerulus nem egyszerűen egy mechanikai szűrő, hanem egy rendkívül összetett szerv, amely három rétegből áll: endothelsejtekből, glomeruláris alapmembránból (GBM) és podocitákból [9]. A transzmissziós EM (TEM) lehetővé tette a glomeruláris sejtek belülről történő megjelenítését [10], és feltárta, hogy az endothelsejtek vékony, fenestrált sejttesttel rendelkeznek, míg a podociták nagy sejttesttel rendelkeznek, és kiterjedtek az elsődleges és másodlagos „láb” folyamatok, amelyek a GBM-hez horgonyozódnak, és összekapcsolódnak egymással. lineáris csomópontok (az enyhe membrán) (1B. ábra). Ezenkívül az EM (SEM) pásztázása, amely a visszaszórt elektronokat rögzíti, lehetővé tette a glomeruláris sejtek láthatóvá tételét a külső felületükről [10], és feltárta, hogy a szomszédos podociták lábfolyamatai interdigitálódnak és lefedik a GBM-et (1C. ábra). Az EM továbbra is hatékony eszköz maradt nemcsak a normál glomeruláris ultrastruktúrák megértésében, hanem a megértésében is.veseélettan és patofiziológia [11]. Számos humán mintán vagy kísérleti modellen végzett vizsgálat feltárta, hogy a különböző betegségi folyamatok az ultrastrukturális változások egy sor jellegzetes mintájához kapcsolódnak, ami további frissítéseket jelent a fejlődő osztályozási rendszerben.vesebetegségek. A vese ultrastruktúrájának további összetettségének megjelenítésére szolgáló technikai képesség támogatta a „nephro”patológusok specializációját.
Egy új, rendkívül érzékeny detektoron alapuló SEM technika lehetővé tette a hasított membrán legmélyebb részének tanulmányozását, és feltárta, hogy azt változó méretű pórusok jellemzik [12]. Patkányokban a proteinuria megjelenése tág pórusokkal járt, ami felveti annak lehetőségét, hogy a hasított rekeszizom ultrastrukturális változásai okozzák a glomeruláris permszelektivitás változásait [12]. További technikai fejlesztésként a blokkfelületű SEM lehetővé tette a glomeruláris filtrációs gát 2D-s nézetéből 3D-s nézetbe történő átjutást olyan felbontással, amely elegendő a legvékonyabb sejtfolyamatok nanoszerkezetének követéséhez egészséges egerekben, beteg egerekben ésvesefejlesztés [13, 14].
Végül az EM összekapcsolása röntgenmikroelemző rendszerrel (röntgenmikroszkópia) lehetővé tette a sejtek vagy sejtrészek ultrastrukturális szintű elemi elemzését. A röntgenmikroszkópos vizsgálat keskeny elektronsugárral ellátott pásztázó TEM-et használ a minta gerjesztésére. A nyalábból származó nagyenergiájú elektronok és a próbatestekben lévő atomok ütközése röntgenfotonok formájában termel energiát. Ezt az energiadiszperzív félvezető detektorral gyűjtött röntgenjelet a mintában lévő elemek azonosítására használják, legfeljebb 30 nm felbontással. Ban,-benveseA röntgen-mikroanalízist Beck és Thurau sikeresen alkalmazta a transzepiteliális tubulus iontranszport [15] és az intracelluláris elemkoncentráció tanulmányozására tubuláris sejtekben [16].
A VESEÉZIOLÓGIA VÉGZÉSE MULTIFOTON MIKROSZKÓPIÁVAL
A többfoton mikroszkóp (MPM) további előrelépést jelentettvesekutatás, vagyis a vesefunkció és a veseszerkezeti összefüggések egyidejű, valós időben történő vizsgálatának lehetősége [17]. A hagyományos fénymikroszkópoktól eltérően a kétfotonos gerjesztés két foton egyidejű abszorpciójától függ, amelyeknek a gerjesztési hullámhossza kétszerese a fluorofor gerjesztéséhez a klasszikus egyfotonos gerjesztésben (1D ábra). A kereskedelemben kapható impulzusos infravörös, alacsony energiájú gerjesztő lézerek használata növelte a mély szövetek behatolását és minimálisra csökkentette a fototoxicitást (1D ábra). Ez lehetővé tette a kutatóknak, hogy közvetlenül élő állatokban vizualizálják a dinamikus sejtfolyamatokat, ami korábban semmilyen más technikával nem volt elérhető. Az MPM lehetővé teszi az alapvető vesefunkciók és a kóros elváltozások számszerűsítését, mint például a glomeruláris permeabilitás, a vaszkuláris véráramlás, az egynefron glomeruláris filtrációs sebessége és a tubuláris áramlás [17] (1E és F ábra). Ezen túlmenően, az MPM lehetővé teszi a sérülésekre adott válaszként a sejten belüli folyamatok tanulmányozását, beleértve a sejthalált és sejtvesztést, a leukociták gördülését, valamint a GBM toborzását és megzavarását [17]. További technikai fejlesztések lehetővé tették az intravitális képalkotást napok-hetek alatt [18], amelyet fluoreszcens fehérjéket expresszáló transzgenikus egerekkel kombinálva az egészséges és sérült vesékben közvetlenül in vivo egyetlen sejt sorsának nyomon követésére [19] alkalmaztak. jobban megérti a vesesejtek forgalmának és regenerációjának mechanizmusait.
Címkementes képalkotó technikák is lehetségesek voltak az MPM-mel, a nikotinamid-adenin-dinukleotid-hidrát (NADH) természetes autofluoreszcenciáját kihasználva a tubuláris sejtek sérülés utáni redoxállapotának tanulmányozására [20]. Ezenkívül a fibrilláris kollagénből származó második harmonikus generációt használták a kollagén lerakódásának számszerűsítésére, amely a vesefibrózis markere [21]. A második harmonikus generálás egy nemlineáris optikai folyamat, amelyben két azonos hullámhosszú gerjesztési foton kölcsönhatásba lép a biológiai szövetek nem-centroszimmetrikus struktúráival, például kollagénnel vagy mikrotubulusokkal, és egy új fotont generál, amelynek hullámhossza fele.
Az intravitális mikroszkópia legújabb innovációja egy miniatürizált multifoton endoszkóp bevezetése volt, amelyet sikeresen alkalmaztak élő, érzéstelenített egerek veséinek képalkotására [22]. Ez a minimálisan invazív MPM megnyithatja az utat a valós idejű in vivo diagnózishoz, szöveteltávolítás nélkül és nagyon rövid időn belül.
A VESE 3D-BEN: SZÖVETTISZTÍTÁSI TECHNIKÁK ÉS KITERJESZTÉSI MIKROSZKÓPIA
A technológiai fejlesztések ellenére a mélyebb volumetrikus képalkotás egyik fő korlátja a veseszövet opacitása, amiveseaz egyik optikailag legnagyobb kihívást jelentő szerv. Ez az oka annak, hogy a szövettisztító technikák nagy érdeklődést váltottak ki [23]. Ezeknek a megközelítéseknek az a célja, hogy egy átlátszatlan szövetet átlátszóvá alakítsanak át, megőrizve a fehérjéket és végül a fluoreszcens markereket, hogy vastag szövetszeleteket lehessen leképezni. Az optikai tisztítás és a legkorszerűbb mikroszkópiás kombináció lehetővé teszi a morfometrikus elemzést, például a glomerulusok térfogatának és számának kvantifikálását vastag szövetekben vagy akár az ép vesében [24]. Egyéb alkalmazások közé tartozik a különböző tubulusszegmensek [25], funkcióik [26] elemzése, valamint a podocitaveszteség számszerűsítése [27].
A nagy mennyiségű szövet leképezésére és ezzel egyidejűleg a finom szerkezeti részletek feloldására a közelmúltban új technikai megközelítést vezettek be, az expanziós mikroszkópot (ExM). Az ötlet egy teljes szerv fizikai kiterjesztése 4- 5-hajtásra, miközben megőrzi az általános architektúrát és a 3D-s proteom tartalmát. A mintán belül közvetlenül szintetizált expandáló polimer segítségével a fény diffrakciós határához közelebb eső molekulák izotróp módon elkülönülnek a térben nagyobb távolságra, és ezért még hagyományos fluoreszcens mikroszkóppal is optikailag felbonthatók. Ezenkívül az ExM nagyobb optikai átlátszóságot biztosít, és csökkenti a fényszórást, így nagyobb mennyiségű szövet látható. Ezzel a megközelítéssel több fehérje lokalizációja a hasított membránban és a GBM-ben még normál konfokális mikroszkóppal is szétszedhető [28]. Például proteinurikus egerekben 2D-ben és 3D-ben is feltárhatja a lábfej kiürülését, olyan nanométeres felbontás mellett, amelyet korábban soha nem értek el [29]. A közelmúltban az ExM-et a már hematoxilinnal és eozinnal festett paraffinba ágyazott minták klinikai hisztopatológiai értékelésére használták [30]. Ezzel a technikával nanoléptékű szinten vizualizálható a lábfej-elmosódás, amely korábban csak EM-nél volt lehetséges. A volumetrikus képalkotás fejlődése lehetővé teszi a teljes szerv nagy felbontású 3D analízisét oly módon, hogy a mélyképalkotás fő korlátja jelenleg az antitestek szövetbe való behatolási képessége.
AZ anyagcsereprofil tanulmányozása: FREKVENCIA-DOMAIN FLUORESZCENCIA-ÉLETTARTAMÚ KÉP MIKROSZKÓPIA
Azvesemagas mitokondriumtartalmú anyagcsere-szerv. A NADH redukált formája és más metabolitok természetesen fluoreszkálóak, és ez az autofluoreszcencia felhasználható a redox állapot indexeként [20]. Azonban ezen endogén fluoroforok emissziós spektruma átfedésben van, és külön azonosításuk lehetetlen volt. A fluoreszcencia élettartama (azaz a fluoreszcencia időbeli lecsengése) azonban szignifikánsan eltérő volt. Ezért a fluoreszcencia-élettartamú képalkotó mikroszkóp (FLIM) lehetővé teszi a metabolikus profilok tanulmányozását [31]. Az utóbbi időben az MPM és a FLIM kombinációjával lehetővé vált a sejtspecifikus metabolikus aláírások jellemzése és a metabolikus változások in vivo nyomon követésevesebetegség [32]. A FLIM várhatóan további betekintést nyújt a témábaveseanyagcsere in vivo egészségben és betegségekben.
A FELBONTÁS HATÁRON TÚL TÖLTÉSE: A VESE SZUPER FELBONTÁSÚ KÉPZÉSE
A szabványos fénymikroszkóppal az optikai felbontás 200 nm feletti határa van. Az új technológiák, amelyeket szuperfelbontású képalkotásnak neveznek, ma már lehetővé teszik a fluoreszcens mikroszkóppal, hogy a diffrakciós határt meghaladó képet készítsenek a nanoszkópia korszakának kiindulópontjaként [33]. Ezek a megközelítések egyesítik a nanoszkopikus felbontást a többszínű fluoreszcens jelölés előnyeivel. Ezen innovációk lehetséges hatásának elismeréseként a 2014-es kémiai Nobel-díjat Eric Betzig, Stefan Hell és William Moerner kapta „a szuperfelbontású fluoreszcens mikroszkópia kifejlesztéséért”. A szuperfelbontású képalkotás különböző stratégiái alkalmazhatók különböző biológiai kérdések megválaszolására. Ezek a megközelítések két fő kategóriába sorolhatók, attól függően, hogy a szuperfelbontást egyedi molekulák vagy együttesek szintjén használják ki [33].
Együttes alapú technikák
Az együttes alapú technikák áttörik a diffrakciós határt a gerjesztő fénynyaláb időbeli és térbeli modulálásával. Ezek közül a szuperfelbontású stimulált emisszió kimerülés (STED) képalkotás két lézert használ, egy gerjesztő lézert és egy egymásra helyezett, vörös eltolt, depletion lézert (STED lézer), fánk alakú, hogy elnyomja a távoli fluoroforok fluoreszcens emisszióját. a gerjesztés középpontja. Ezt az elnyomást stimulált emisszió révén érik el, és csak a diffrakciós határ alatti dimenziójú fókuszpontból származó jel gyűjtését teszi lehetővé (2A. ábra). STED képalkotást használtunk a hasított membrán optikailag tiszta képéreveseszövetekben (2B–c' ábra), és lehetővé tette a podocin és a nephrin térbeli eloszlásának lokalizálását nanométeres skálán legalább 30 lm mélységig [34]. Ezen túlmenően, a lábfolyamat elhalványulásának kísérleti modellben való megfigyelésének és számszerűsítésének lehetősége hasznossá teheti a STED-képalkotást a glomeruláris filtrációs gát vizsgálatában [34].
A STED-mikroszkópiához speciális protokollokra van szükség a minta-előkészítéshez, speciális fluoroforokhoz és technikai képzéshez. Emiatt az elmúlt néhány évben nagyobb figyelmet fordítottak egy másik szuperfelbontású technikára, a strukturált megvilágítási mikroszkópiára (SIM), amely oldalirányban és axiálisan is kétszeresére növelheti a diffrakciós határt. A SIM finom csíkos megvilágítási mintával rendelkező, széles látómezős mikroszkóp-beállítást használ, amely lehetővé teszi a magas frekvenciájú információk (a minta finom részleteinek megfelelő) rögzítését alacsonyabb térbeli frekvenciákon. Több, különböző fázisú és tájolású megvilágítási mintázatú kép készítésével nagy felbontású kép rekonstruálható (3A. ábra). A SIM kompatibilis a szabványos fluoroforokkal, nem igényel speciális minta-előkészítést, és lehetővé teszi a 3D megjelenítést. Mindezeket az előnyöket figyelembe véve különböző tanulmányokat végeztek annak értékelésére, hogy a SIM-t gyorsdiagnosztikai eszközként [35] lehet-e használni, például az EM-nél rövidebb átfutási idővel. A közelmúltban 3D SIM-kártyát és automatizált képfeldolgozást alkalmaztak a lábfej eltávolításának gyors diagnosztikai eszközeként minimális elváltozásban szenvedő betegek biopsziájából származó rutin paraffin metszetek felhasználásával [36] (3B és C ábra). Ez a képesség a nanoméretű patológiát mutató betegségekben bekövetkezett változások sikeres azonosítására megerősítette, hogy a SIM ígéretes eszköz a rutin diagnosztikában.
Egymolekulás lokalizáción alapuló képalkotó eljárások
Ezek a technikák azon a lehetőségen alapulnak, hogy ciklikusan be- és kikapcsolják az egyes fluoreszcens molekulákat, amelyek túl közel vannak ahhoz, hogy feloldódjanak. Ezekben a megközelítésekben a diffrakció-korlátozott tartományban lévő molekulák különböző időpontokban aktiválhatók, így egyedileg leképezhetők, majd nanométeres pontossággal lokalizálhatók központjaik számítási megkeresésével (3D. ábra). Ezen megközelítések közül először a sztochasztikus optikai rekonstrukciós mikroszkópot (STORM) vezették bevese2013-ban végzett kutatás egy olyan tanulmánysal, amely feltárta a GBM bonyolult molekuláris szerveződését nanométeres pontossággal, beleértve a molekulák orientációját is [37]. Egy ritka veleszületett nefrotikus szindróma egérmodelljében a STORM feltárta a laminin 521 integrációját és helyes orientációját a GBM-en belül intravénás injekciót követően, ami utat nyitott a betegek számára a fejlett terápiás lehetőségek számára [38]. Egy másik tanulmány az aktin citoszkeleton szerveződését írta le podocitákban molekuláris méretű felbontásban [39] (3E–I. ábra). Új felfedezésként a podociták kontraktilis aktinkötegeket tartalmaznak, amelyek a lábfolyamatokban nem összehúzódó aktinkötegekhez kapcsolódnak. A podocita sérülési modellekben az aktin szerkezete a lábfolyamatokban szétesett, ami a fő test kontraktilis szerkezetének összeomlásához vezetett [39].
ALAPVETŐ BIOMOLEKULÁK 3D-S SZERKEZETEI VÉGZÉS ATOM SZINTEN: KRIO-ELEKTRON MIKROSZKÓPIA
Egészen a közelmúltig az alapvető biomolekulák szerkezetének tanulmányozásának lehetősége az elektronmikroszkópiára korlátozódott, néhány nanométeres felbontással. Technikai akadályok, mint például az intenzív elektronsugár által okozott mintakárosodás, az alacsony képkontraszt és az elektronokkal való kölcsönhatás utáni molekulamozgások, vagy a biológiai mintákban lévő víz megőrzésének nehézségei az EM-kamrában alkalmazott vákuumban, ami lehetetlenné teszi az ennél kisebb molekulák felbontását. . A minta hűtése csökkentheti a vízpárolgást és az elektronok okozta károsodást [40]. Ebből az ötletből indult ki a krio-EM az 1950-es években. Néhány évvel ezelőtt egy új, egyelektronos számláló detektor bevezetése végre a korábbi határokon túllépte a felbontást. 2017-ben a kémiai Nobel-díjat Jacques Dubochet, Joachim Frank és Richard Henderson kapta „az oldatban lévő biomolekulák nagy felbontású szerkezetének meghatározására szolgáló krioelektronmikroszkópia kifejlesztéséért”. Ezek a fejlesztések ma már lehetővé teszik az oldatban lévő biomolekulák szerkezeti meghatározását [41].
Ban benvesekutatások során az alapvető fehérjék szerkezetét atomi szinten határozták meg [42, 43]. Közülük a humán policisztin szerkezete-2, amelynek mutációi felelősek az autoszomális domináns policisztásvesebetegséget [44], valamint a tranziens receptorpotenciál kanonikus 6 ioncsatornák szerkezetét, amelyek mutációi FSGS-t okoznak emberben [43], néhány angström felbontással határozták meg [44].
A VESEBETEGSÉGEK MOLEKULÁRIS ALAPJÁNAK MEGÉRTÉSE: INTEGRATÍV VESEMIKROSZKÓPIA
Az elmúlt néhány évben megnőtt az érdeklődés a címkementes megközelítések iránt, amelyek képesek specifikusan és egyidejűleg feltérképezni a szövetekben található molekulák teljes spektrumát [45]. Ezek közül a mátrix-asszisztált lézeres deszorpciós/ionizációs képalkotó tömegspektrometria (MALDI-IMS) több száz különböző molekula egyidejű mérését teszi lehetővé közvetlenül szövetmetszeteken, nagy felbontásban. Egy MALDI-IMS kísérletben egy vékony, fagyasztott vagy paraffinba ágyazott szövetmetszetet vonnak be egy mátrixszal, amely elnyeli a lézerenergiát, és elősegíti a szövetanalitok ionizációját. A tömegspektrométerben végzett elemzés minden x/y koordinátához spektrumot generál. A MALDI mérést követően ugyanazt a szövetmetszetet meg lehet festeni hagyományos hisztokémiai és immunhisztokémiai eljárásokkal, hogy a molekulamintázat integrálódjon a szövettani részletekbe. A vesekutatásban a MALDI-IMS-t gyógyszerek, metabolitok, lipidek, peptidek és fehérjék tanulmányozására használják normál és beteg szövetekben [45].
A MALDI-IMS egyik leggyakoribb alkalmazása a molekuláris markerek azonosítása a vesesejtes karcinóma osztályozására [46], valamint molekuláris és szövettani szinten a rákos és a normál szövet közötti valódi határ megállapítására [47]. A MALDI-IMS-t sikeresen alkalmazták a vese-gyógyszer-toxicitás tanulmányozására is, hogy biztosítsák a mérgezés korai felismerésétvesegyógyszerjelöltek által közvetített károsodás mechanizmusai [48]. Ezenkívül a MALDI-IMS-t a lipidek és a vesepatológiákban betöltött szerepük tanulmányozására használják, mint például a diabéteszes nephropathia [49], az akut vesekárosodás [50] és a policisztás.vesebetegség [51], valamint endogén metabolikus profilok feltárása a betegséggel kapcsolatos mechanizmusok mélyebb megértése érdekében [52]. A lehetséges biomarkerek molekuláris profiljainak azonosítását is véglegesítettük, amelyek új potenciális diagnosztikai és prognosztikai biomarkerek lehetnek [53, 54].
KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JÖVŐBELI KITEKINTÉSEK
A képalkotó technikák folyamatos fejlesztése számos kritikus technikai akadályt fokozatosan megoldottvesekutatást végeztek, és lehetővé tették a normál és beteg vesék szerkezetének és működésének dinamikus ábrázolását. Valójában az új mikroszkópos technológiák megjelenése alapvető tudományos felfedezéseket tett lehetővé, és ezt követően megváltoztatta a vese fiziológiájáról és patofiziológiájáról alkotott nézetünket, amelyek ma már 3D-ben is megjeleníthetők, sőt videókon is leforgathatók, ahol az idő a negyedik dimenziót képviseli. A szuperfelbontású mikroszkópia legújabb technológiai innovációjával és a molekuláris képalkotó technikák fejlődésével a kutatók immár közvetlenül a szövetekben vizualizálhatják az egyes biomolekulákat, és meghatározhatják, hogyan hatnak egymásra sejt- és szubcelluláris szinten.
Lehetőség van ezeknek az eszközöknek a patológiás kezelésérevesea minták, a klinikai biopsziák molekuláris és szubcelluláris részleteire összpontosítva, segíthetnek a betegségek újraosztályozásában. Jelenleg nem világos, hogy ez hatással lesz-e a vesebetegség diagnózisára vagy akár a betegek kezelésére, és mikor.
FINANSZÍROZÁS
A támogatást az Európai Kutatási Tanács biztosította az Európai Unió Horizont 2020 kutatási és innovációs programja keretében (648274 támogatási szerződés).
IRODALOM
1. Weening JJ, Jennette JC. Történelmi mérföldkövek a vesepatológiában. Virchows Arch 2012; 461: 3–11
2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna1666
3. Bowman W. A malpighi testek szerkezetéről és használatáról avese, az azon a mirigyen keresztüli keringéssel kapcsolatos megfigyelések. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80
4. D'Agati VD, Mengel M. A vesepatológia felemelkedése a nephrológiában: a szerkezet megvilágítja a funkciót. vagyok JVeseDis 2013; 61: 1016–1025
5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo konfokális lézeres pásztázó mikroszkópia és mikropunkció ép patkányokban. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25
6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. A CXCL12 blokád elsősorban az elveszett podocitákat regenerálja a kortikális nephronokban azáltal, hogy egy belső podocita-progenitor visszacsatolási mechanizmust céloz meg.VeseInt 2018; 94:1111–1126
7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. Az endociklushoz kapcsolódó tubuláris sejtek hipertrófiája és a progenitor proliferáció helyreállítja a vesefunkciót akut utánvesesérülés. Nat Commun 2018; 9: 1344
8. LeHir M, Kriz W. Új betekintések a glomerulosclerosisban előforduló szerkezeti mintákba. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Funkcionális anatómiája avese. Hosp Pract 1978; 13
10. Liapis H. Elektronmikroszkópia bevesekutatás: látni hinni. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345
11. Erős ML, Evers P. A vesediagnosztika harmadik dimenziója. A normál és abnormális vesék pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálata. S Afr Med J 1979; 55:174–177
12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. A glomeruláris epiteliális szűrőrés porózus ultrastruktúrájának leképezése. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089
13. Lausecker F, Tian X, Inoue K et al. Vinculin szükséges a glomeruláris gát integritásának fenntartásához.VeseInt 2018; 93: 643–655
14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. A podociták fejlődésének morfológiai folyamata, amelyet blokk-arcú pásztázó elektronmikroszkóppal tártunk fel. J Cell Sci 2017; 130: 132–142
15. Rick R, Dorge A, Beck FX et al. A transzepiteliális iontranszport elektronszondás röntgensugaras mikroanalízise. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259
16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Intracelluláris elemi koncentrációk a vese tubuláris sejtjeiben. Elektron mikroszonda elemzés. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999
17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Újszerű in vivo vizualizációs technikákveseanatómia és funkció. Vese Int 2015; 88: 44–51
18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E és mtsai. A hosszú hullámhosszú multifoton gerjesztés előnyös az intravitálisanveseképalkotás.VeseInt 2016; 89, 712–719
19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et al. Glomeruláris epiteliális sejtek sorsának nyomon követése in vivo sorozatos multifoton képalkotás segítségével új egérmodellekben, fluoreszcens származási címkékkel. Nat Med 2013; 19: 1661–1666
20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N és társai. A többfoton képalkotás különbségeket tár fel a mitokondriális funkcióban a nefron szegmensek között. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302