Absztrakt:Ezt a vizsgálatot a cikloheterofillin melaninszintézisre gyakorolt ​​gátló hatásának tisztázására végezték. A cikloheterofillin B16F10 sejtvonalra gyakorolt ​​gátló hatásának tisztázása érdekében a sejtek életképességét, hírvivő ribonukleinsav (mRNS) expresszióját, tirozináz aktivitási vizsgálatot és melanintermelési tesztet mértünk. Meghatároztuk a cikloheterofillin tirozinázzal rokon protein 1 (TYRP1)/TYRP2/tirozináz (TYR)/microphthalmia-asszociált transzkripciós faktor (MITF) mRNS expressziójára és melanintartalomra gyakorolt ​​hatását. A kvantitatív valós idejű RT-PCR kimutatta, hogy a cikloheterofillin csökkentette a TYRP1/TYRP2/TYR/MITF gének mRNS expressziós szintjét és a melanin termelés tartalmát, mint az -MSH-val kezelt B16F10 sejtek. A tirozináz aktivitási vizsgálat kimutatta, hogy a cikloheterofillin csökkentette a melanintermelést a B16F10 sejtekben. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a cikloheterofillin fokozza a fehérítő hatást a B16F10 sejtekben; így a cikloheterofillin a bőrfehérítés hatékony összetevője. Így további kutatásokat kell végezni a cikloheterofillin hatásmechanizmusával kapcsolatban funkcionális anyagok fejlesztésére.

A vonatkozó tanulmányok szerint a cisztán egy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője a cistanozid, amely különféle hatásokkal rendelkezik, mint például antioxidáns, gyulladáscsökkentő és immunfunkciót serkentő. A cistanche és a bőrfehérítés közötti mechanizmus a cistanche glikozidok antioxidáns hatásában rejlik. Az emberi bőrben a melanin a tirozin tirozináz által katalizált oxidációjával keletkezik, az oxidációs reakcióhoz pedig oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak. A Cistanche cisztanozidot tartalmaz, amely antioxidáns, és csökkentheti a szabad gyökök képződését a szervezetben, így gátolja a melanintermelést.

Kattintson a Hogyan használjuk a Cistanche-t

További információért:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Bemutatkozás

A bőr színét a vérben lévő hemoglobin, az epidermális rétegben a melanin pigment és a bőr alatti szövet -karotin határozza meg. Közülük a bőr színét elsősorban a melanin pigment mennyisége és eloszlása ​​határozza meg [1]. A melanin egy pigment, amelyet a melanociták melanoszómájából szintetizálnak, és amely az alaprétegben van jelen. Elnyeli vagy szórja az ultraibolya (UV) sugarakat, és jótékony funkciója a bőrsejtek vagy bőrszövetek károsodásának elnyomása. A melanin túlzott felhalmozódása azonban foltokat, szeplőket és pigmentfoltokat okozhat. Ismeretes, hogy hiperpigmentációt okoz [2,3].

A melanin pigment egy reprezentatív irritáló anyag, amely exogén öregedést okoz. Az UV-sugárzásnak kitett melanociták melanogenezise során keletkezik, és jótékony funkciója a bőr UV-sugárzás elleni védelme azáltal, hogy a bőr színét sötétíti. A melanin pigment eumelaninból (fekete) és pheomelaninból (vörös-barna) áll [4,5]. A melanint az L-tirozin, egyfajta aminosav felhasználásával szubsztrátként, valamint az L-DOPA-n (3,4-dihidroxifenilalanin) keresztül állítják elő, majd a tirozináz (TYR) fő enzimek által tovább DOPA-kinonná oxidálják. tirozinázzal rokon fehérje-1 (TYRP1) és TYRP2. A DOPA-kinon szulfhidrilcsoportok jelenlétében tovább oxidálódik vörös-sárga pheomelaninná. A DOPA-kinon dekarboxileződik, oxidálódik és eumelaninná katalizálódik, amikor a szulfhidrilcsoportok kimerülnek [4,5]. A tirozináz enzim a melanin termeléséért felelős kulcsenzim, és ismert, hogy az édesgyökér kivonat, a japán tölgy kivonat, az arbutin és a kojsav, amelyek reprezentatív fehérítő anyagok, gátolják a tirozináz enzim aktivitását [6,7]. Az arbutin különösen a tirozináz aktivitásának gátlásában játszik szerepet azáltal, hogy kompetitív reakcióba lép az L-tirozinnal, amely a melanin nyersanyaga, és a kojsavval, amelyet Cu2 plus köt a tirozináz aktív helyéhez. Köztudott, hogy a kojicsav és az arbutin erős fehérítő hatásúak, de biztonsági problémák mellékhatásairól is beszámoltak, például bőrirritációról [8,9]. Számos tanulmány folyik új, hatékony anyagok felfedezésére, például természetes eredetű funkcionális anyagok kifejlesztésére [8,9].

A cikloheterofillin (C30H30O7), a prenilflavon egy fajtája, bőségesen megtalálható az Artocarpus heterophyllusban, és farmakológiai és biológiai funkcióiról számoltak be, beleértve a gyulladáscsökkentő, vérlemezke-ellenes aktivitást és az antioxidáns hatékonyságot [10–13]. Ezenkívül arról számoltak be, hogy antioxidáns és öregedésgátló hatása van az UV-A által indukált humán dermális fibroblasztokra [14,15].

Mint ilyen, arról számoltak be, hogy a cikloheterofillin hatásos különféle betegségekben, de nincs kutatás a cikloheterofillin melanintermelésének hatásairól. Ebben a tanulmányban a cikloheterofillin hatását vizsgáltam a TYRP1, TYRP2, TYR és MITF markerek expressziójára B16F10 sejtekben, egy egerekből származó melanoma sejtvonalban, amely a melanintermelési mechanizmushoz kapcsolódik.

2. Eredmények és megbeszélés

CCK{{0}} vizsgálatot végeztünk a cikloheterofillin citotoxicitásának meghatározására a B16F10 sejtvonalban. Különféle koncentrációjú cikloheterofillint adtunk a sejtek életképességének mérésére (1. ábra). Amikor 20 µg/ml vagy annál nagyobb koncentrációval kezeltük, bebizonyosodott, hogy a B16F10 sejtek túlélési aránya szignifikánsan csökkent a kontrollcsoporthoz képest. Amikor cikloheterofillint 10 µg/ml koncentrációban adtunk hozzá, a B16F10 sejtek túlélési aránya hasonló volt a kontrollcsoportéhoz. Ezért további kísérletekben cikloheterofillint adtunk hozzá 10, 1 és 0,1 µg/ml koncentrációban.

A tirozináz enzim az L-tirozinnal reagálva L-DOPA-t termel, és az L-DOPA végül melanin pigmentet termel a DOPAquinonon keresztül a tirozináz által, amely a melanogenezist szabályozó kulcsenzimként ismert [4,5]. Ebben a kísérletben kojinsavat használtunk pozitív kontrollként a tirozináz enzimaktivitás gátlásának mértékének értékelésére. A tirozináz enzimaktivitás gátlásának mértékét 10, 1 és 0,1 µg/ml koncentrációjú cikloheterofillinnel végzett kezelés igazolta. Megállapítottuk, hogy a tirozináz enzimaktivitást koncentrációfüggő módon gátolta a cikloheterofillin (2. ábra). Az 10, 1 és 0,1 µg/ml koncentrációjú cikloheterofillinnel kezelt csoportokban megerősítették, hogy a tirozináz enzim gátló hatása 58,0, 27,4 és 16,9 százalék volt.

Az UV-sugarak stimulálják a keratinocitákat az epidermiszben, hogy indukálják a - melanocyte-stimuláló hormon (-MSH) expresszióját, egy olyan hormont, amely serkenti a melanocitákat, és a sejten kívül szekretálódik, a szekretált -MSH pedig serkenti a melanocitákat. A melanocortin 1 receptorhoz (MC1R) kötődve indukálja a melaninszintézissel kapcsolatos jelátvitelt a sejtben, melanin pigment termelődését okozva [5]. Ebben a kísérletben a melanintermelés indukálására B16F10 sejtekben 200 nM -MSH-t használtunk a melanintermelés indukálására B16F10 sejtekben [16]. Az -MSH-kezelés hatására megnövekedett markerek, a TYRP1, TYRP2, TYR és MITF gének expressziós szintjének valós idejű RT-PCR-jét cikloheterofillin kezeléssel határoztuk meg -MSH-val kezelt B16F10 sejtekben. A B16F10 sejteket cikloheterofillinnel kezeltük, és a marker expresszióját valós idejű RT-PCR segítségével igazoltuk. Ennek eredményeként bebizonyosodott, hogy a TYRP1, TYRP2, TYR és MITF expressziója szignifikánsan csökkent a cikloheterofillinnel kezelt csoportban, mint az -MSH-val kezelt csoportban. Pontosabban, a 10 µg/ml cikloheterofillinnel kezelt kísérleti csoportban a TYRP1, TYRP2, TYR és MITF gének expressziója 53,3, 26,6, 58 és 34 százalékkal csökkent (3. ábra). Az 1 µg/mL cikloheterofillinnel kezelt kísérleti csoportban bebizonyosodott, hogy a markerek expressziója szignifikánsan csökkent, a TYRP1 és TYRP2 gének expressziója hasonlóan csökkent a 0,1 µg/mL cikloheterofillinnel kezelt csoportban.

Miután megbizonyosodtunk arról, hogy a cikloheterofillinnel végzett kezelés csökkentette a melanogenezishez kapcsolódó marker mRNS-expressziós szintjét, a melanin pigmenttermelés sebességét megerősítettük annak meghatározására, hogy a melanin pigment termelése a B16F10 sejtekben jelentősen csökkent-e (4. ábra). . A 10, 1, illetve 0,1 µg/ml koncentrációjú cikloheterofillinnel kezelt B16F10 sejtvonalakat összegyűjtöttük, és a melanintermelés mértékét megerősítettük. Ennek eredményeként bebizonyosodott, hogy a melanin pigment termelődését szignifikánsan csökkentette a cikloheterofillin 10 és 1 µg/ml koncentrációban (4A. ábra). Ezenkívül megerősítést nyert, hogy a melanin pigment termelése a cikloheterofillinnel kezelt állapotban csökkent a kontrollcsoporthoz képest (4B. ábra). Amikor 10 és 1 µg/ml cikloheterofillint adtunk hozzá, a melanin pigment termelési sebessége 44,6, illetve 37,8 százalékkal csökkent, ami jelentősen csökkent a kontrollcsoporthoz képest (4B. ábra). Ezek az eredmények általában összhangban vannak a valós idejű RT-PCR kísérleti eredményeivel a melanogenezishez kapcsolódó markerek mRNS expressziós szintjén.

Az antioxidánsokról, például az aszkorbinsavról ismert, hogy fontos fehérítőanyag, amely gátolja a melanin pigmentek szintézisét azáltal, hogy a DOPAquinont, az eumelanin termelési folyamat közbenső anyagát L-DOPA-vá redukálja [16,17]. A cikloheterofillinnek antioxidáns hatása is van [11,12]. Kimutatták, hogy a cikloheterofillin hatékonyan fehéríti ezt az antioxidáns hatást. Az antioxidáns hatás e DPPH gyökfogó vizsgálattal végzett in vitro megerősítése eredményeként bebizonyosodott, hogy az aszkorbinsavhoz hasonló antioxidáns hatása van, amely pozitív kontroll magas cikloheterofillin koncentráció mellett (5. ábra). A jövőben további kutatásokat kell végezni a cikloheterofillin melanocitákban kifejtett antioxidáns hatásaival és az olyan antioxidáns enzimek expressziójával kapcsolatban, mint a kataláz, SOD1, SOD2 és SOD3.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Kísérleti anyagok és sejtkultúra

A B16F10 sejtvonalat a Korean Cell Line Banktól (Korea) vásároltuk, és a sejttenyésztő tápközeg 10%-os magzati szarvasmarha-szérum (FBS, SFBU-0500, Equitech-bio, Kerrville, TX, USA) volt Dulbecco módosított Eagle tápközegében (DMEM). , LM 001–05, Welgene, Gyeongsan-si, Korea), és 1 százalék penicillint/sztreptomicint (Gibco, 15140–122, Waltham, MA, USA) adtak hozzá. A sejteket inkubátorban tenyésztettük 37 ◦C-on és 5 százalékos CO2-tartalom mellett [16]. A kísérletben használt cikloheterofillint Artocarpus heterophyllusból DMSO-val extraháltuk, és a ChemFaces Co.-tól vásároltuk (CFN97748, Wuhan, Kína, tisztaság 98 százalék vagy annál nagyobb).

3.2. Sejtéletképességi vizsgálat Sejt

az életképességet CCK{0}} oldattal (sejtszámláló készlet; EZ-3000, EZ-Cytox, Seoul, DoGen) értékelték. A B16F10 sejtvonalakat tenyésztő tápközegbe oltottuk 2x104 sejt/96 lyukú lemez sűrűségben. 24 óra elteltével cikloheterofillint (CFN97748, Chemfaces) adtunk hozzá. A cikloheterofillinnel kezelt B16F10 sejtvonalat 24 órán át inkubáltuk, majd CCK-8 oldatot adtunk hozzá 30 percig 37 ◦C-os inkubátorban. Az abszorbanciát 450 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (Epoch, Winooski, VT, USA, BioTek), és a sejtek életképességét a sejtek nélküli kontrollcsoport abszorbanciája alapján számítottuk ki [16].

3.3. DPPH vizsgálat

3.4. In vitro gomba tirozináz aktivitás

3.5. Kvantitatív valós idejű fordított transzkripciós polimeráz láncreakció (Q-RT-PCR)

A teljes RNS-t Trizol (15596018, Carlsbad, CA, USA, Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával izoláltuk. Az RNS koncentrációját spektrofotometriásan (BioTek) határoztuk meg. Négy mikrogramm RNS-t fordítottunk cDNS-vé ReverTra Ace® reverz transzkripciós készlettel (Toyobo, FSQ101, Osaka, Japán). A reverz transzkripciót Tris-EDTA puffer (pH 8,0) hozzáadásával állítottuk le összesen 200 µl cDNS-oldathoz. A TaqMan® Gene Expression Assay készleteket az Applied Biosystemstől vásároltuk. A Q-RT-PCR-eket a gyártó utasításai szerint végeztük. Röviden, 20 µl Q-PCR keverék 10 µl 2× TaqMan Universal Master Mixet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 µL 20× Taqman expressziós tesztet (Applied Biosystems) és 50 ng cDNS-t tartalmazott. A Q-PCR keveréket 95 ◦C-on 20 másodpercig és 40-szeres ciklusos reakcióval (95 ◦C 1 másodpercig és 60 ◦C 20 másodpercig) StepOnePlus System (Applied Biosystems) segítségével reagáltattuk. A Q-RT-PCR elemzésekben használt TaqMan expressziós vizsgálathoz használt génazonosító számokat az 1. táblázat tartalmazza. Humán GAPDH-t (Applied Biosystems) használtunk a különböző mintákból származó cDNS-mennyiségek változásának normalizálására.

3.6. Melanin versenyvizsgálat

A melanin pigment mennyiségének mérésére Hosoi módszere részben módosult [17]. Összesen 1 × 105 B16F10 sejtet oltottunk be egy 60 mm-es szövettenyésztő edénybe. A sejtek 24 órás tenyésztése után 200 nM -melanocita stimuláló hormont (-MSH; M4135, Sigma-Aldrich) és cikloheterofillint (10, 1, 0,1 µg/ml) adtunk hozzá 72 órán át minden koncentrációnál. A táptalaj eltávolítása után 200 µl NaOH (1 N; S8045, Sigma-Aldrich) oldatot adtunk hozzá, és 60 ◦C-on 2 órán át inkubáltuk, hogy a melanin feloldódjon. Az abszorbanciát spektrofotométerrel (405 nm, Epoch) mértük. Pozitív kontrollként 100 µg/ml arbutint (A4256, Sigma-Aldrich) használtunk. A melanin pigment termelésének gátlását a -MSH kezelési körülmények között termelt melanin mennyiségének százalékában fejeztük ki. Három független kísérlet független elvégzésével végeztük.

3.7. Statisztikai analízis

4. Konklúziók

A mindennapi életben előforduló UV-sugárzásnak jótékony funkciói vannak, mint például a D-vitamin szintézise és sterilizálása, de más szempontból a bőr rugalmasságának elvesztését, ráncokat, pigmentációt, bőrpírt, gyulladást stb. okoz a reaktív oxigénfajták láncreakciója révén [18, 19]. Ezenkívül a külső tényezők, például az UV sugárzás által okozott exogén öregedés megakadályozza a normál szövetek működését és a regenerációt, amikor a szövet károsodik az élő szervezet sejtjeinek csökkenése és leromlása miatt [20,21].

Ezzel a vizsgálattal sikerült megerősíteni a cikloheterofillin megfelelő koncentrációját a B16F10 sejtek kezelésére. Megállapítást nyert, hogy a 10 µg/ml koncentráció nem befolyásolja a sejtek életképességét, amint az 1. ábra is látható. A tirozináz enzim aktivitásgátló hatásának mérési eredményeivel igazoltuk, hogy a 10, 1, 10, 1, 1, 1-es cikloheterofillin-koncentráció és 0,1 µg/ml szignifikánsan csökkentette a tirozináz enzim aktivitását (2. ábra). Ezenkívül megerősítést nyert, hogy a cikloheterofillin szignifikánsan csökkentette a markerek (TYRP1, TYRP2, TYR és MITF gén) expresszióját az -MSH-val kezelt állapothoz képest (3. ábra). Ezenkívül megerősítették, hogy a cikloheterofillin csökkentette a melaninszintézis mennyiségét a B16F10 sejtekben (4. ábra). Ezen eredmények alapján a cikloheterofillin potenciális új fehérítőjelölt.

Ez a tanulmány az első, amely megerősíti a cikloheterofillin gátló hatását a melaninszintézisre, és felveti az UV-sugarak okozta bőröregedés gátlásának lehetőségét. Ezen túlmenően szükségesnek tűnik a B16F10 sejtek jelátviteli mechanizmusaira, a fehérítésben részt vevő jelátviteli rendszerekre és a melanocitákban jelenlévő különféle antioxidáns enzimekre gyakorolt ​​hatásának mélyrehatóbb vizsgálata.

Hivatkozások

1. Bonaventure, J.; Domingues, MJ; Larue, L. Melanociták és melanomasejtek migrációját szabályozó celluláris és molekuláris mechanizmusok. Pigment Cell Melanoma Res. 2013, 26, 316–325. [CrossRef] [PubMed]

2. Gilchrest, BA; Eller, MS DNS fotokárosodás serkenti a melanogenezist és más fényvédő válaszokat. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 1999, 4, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

3. Sugumaran, M. Az eumelanogenezis összehasonlító biokémiája és a fenoloxidáz és a melanin védő szerepe rovarokban. Pigment Cell Res. 2002, 15, 2–9. [CrossRef] [PubMed]

4. Ito, S.; Wakamatsu, K. Az eumelanin és a pheomelanin kvantitatív elemzése emberekben, egerekben és más állatokban: Összehasonlító áttekintés. Pigment Cell Res. 2003, 16, 523–531. [CrossRef]

5. Yoon, YM; Bae, SH; An, SK; Choe, YB; Ahn, KJ; Az ultraibolya sugárzás IS hatásai a bőrre és a bőrsejtek jelátviteli útvonalaira. Kor. J. Aesthet. Cosmetol. 2013, 11, 417–426.

6. Baek, YS; Ryu, YB; Curtis-Long, MJ; Ha, TJ; Rengasamy, R.; Yang, MS; Park, KH A Broussonetia Kozinski-ból származó 1,3- difenil-propán tirozináz-gátló hatása. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 35–41. [CrossRef]

7. Kim, HJ; Seo, SH; Lee, BG; Lee, YS Tirozináz inhibitorok azonosítása Glycyrrhiza uralensisből. Planta Med. 2005, 71, 785–787. [CrossRef]

8. Han, NK; Park, CM; Kwon, JC; Joung, MS; Choi, JW A Fagopyrum tataricum kivonat fehérítő hatása. J. Soc. Kozmetika. Sci. Korea 2014, 40, 179–186.

9. Kim, BY; Park, SH; Park, BJ; Kim, JJ Az Androsace umbellate kivonat fehérítő hatása. J. Soc. Kozmetika. Sci. Korea 2015, 41, 21–26.

10. Lin, CN; Lu, CM; Lin, HC; Fang, SC; Shieh, BJ; Hsu, MF Új vérlemezke-ellenes összetevők Formosan moraceous növényekből. J. Nat. Prod. 1996, 59, 834–838. [CrossRef]

11. Wang, JP; Raung, SL; Tsao, LT; Hsu, MF; Lin, CN A protein kináz C blokkolása részt vesz a cyclometersphyllin által a neutrofil szuperoxid anionok képződésének gátlásában. Naunyn. Schmiedeberg Arch. Pharm. 1997, 355, 551–558. [CrossRef]

12. Ko, FN; Cheng, ZJ; Lin, CN; Teng, CM Az Artocarpus heterophyllusból izolált prenilflavonok Scavenger és antioxidáns tulajdonságai. Free Radic. Biol. Med. 1998, 25, 160–168. [CrossRef]

13. Jantan, I.; Yasin, YH; Jamil, S.; Sirat, H.; Basar, N. Artocarpus fajokból izolált prenilált flavonoidok és kalkonok hatása a vérlemezke-aggregációra emberi teljes vérben. J. Nat. Med. 2010, 64, 365–369. [CrossRef]

14. Huang, CH; Li, HJ; Wu, NL; Hsiao, CY; Lin, CN; Chang, HH; Hung, CF A cikloheterofillin fotoprotektív hatásai az UVA által kiváltott károsodások és az oxidatív stressz ellen humán dermális fibroblasztokban. PLoS ONE 2016, 11, e0161767. [CrossRef]

15. Shim, JH A cikloheterofillin öregedésgátló hatásai UVA-sugárzással besugárzott dermális fibroblasztokban. Kor. J. Pharmacogn. 2019, 50, 285–290.

16. Tomita, Y.; Seiji, M. A tirozináz inaktivációs mechanizmusa egér melanomában. J. Dermatol. 1977, 4, 245–249. [CrossRef]

17. Panzella, L.; Ebato, A.; Napolitano, A.; Koike, K. A melanogenezis késői szakaszai: A kémiai szempontok és az alkalmazási lehetőségek feltárása. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1753. [CrossRef]

18. Talwar, HS; Griffiths, CE; Fisher, GJ; Hamilton, TA; Voorhees, JJ Csökkentett I. és III. típusú prokollagén fotosérült felnőtt emberi bőrben. J. Invest. Dermatol. 1995, 105, 285–290. [CrossRef]

19. Kim, J.; Lee, CW; Kim, EK; Lee, SJ; Park, NH; Kim, HS; Kim, HK; Char, K.; Jang, YP; Kim, JW A Gynura procumbens kivonat gátló hatása az UV-B-indukált mátrix-metalloproteináz expresszióra humán dermális fibroblasztokban. J. Enthnopharmacol. 2011, 137, 427–433. [CrossRef]

20. Kirkwood, TB Az öregedés furcsa tudományának megértése. Cell 2005, 120, 437–447. [CrossRef]

21. Jones, DL; Rando, TA Az őssejtek öregedésének feltörekvő modelljei és paradigmái. Nat. Cell Biol. 2011, 13, 506–512. [CrossRef] [PubMed]

További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501