A kaempferol enyhíti az LD-mitokondriális károsodást az autofágia elősegítésével: A Parkinson-kór következményei 1. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:Újabb bizonyítékok arra utalnak, hogy a váratlan lipidcseppek (LD) lerakódása és peroxidációja felgyorsíthatja az organellák stresszét, és döntő szerepet játszik a neurodegeneratív betegségek (NDD-k) patogenezisében. Korábbi vizsgálatunkban megerősítettük, hogy a kaempferol (Ka), egy természetes flavonoid kis molekula. , neuroprotektív hatást mutatott LPS-indukált Parkinson-kórban (PD) szenvedő egereken. Emellett korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az autofágia fontos szerepet játszik a sejtes LD lerakódás szabályozásában. Jelen vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a Ka védelmet nyújt a TH plusz neuronveszteség és viselkedési hiányosságok ellen MPTP/p-indukált PD egerekben, amit a substantia nigra pars compacta (SNpc) csökkent lipidoxidatív stressz kísért. Tenyésztett neuronális sejtekben Ka mutatott ki viszonylag biztonságos koncentráció-tartomány, és jelentősen visszaszorította az MPP plus által kiváltott LD felhalmozódást és sejtes apoptózist. További vizsgálatok azt mutatták, hogy a Ka védő hatása az autofágiától, különösen a lipofagiától függ. Kritikusan a Ka elősegítette az autofágiát, hogy közvetítse az LD lebomlását a lizoszómákban, ami aztán enyhítette a lipidlerakódást és a peroxidációt, valamint az ebből eredő mitokondriális károsodást, következésképpen csökkentve az idegsejtek halálát. Ezenkívül az AAV-shAtg{3}}közvetített Atg5 leütés megszüntette a Ka neuroprotektív hatását a lipidoxidációval szemben PD egerekben. Ez a munka azt mutatja, hogy a Ka megakadályozza a dopaminerg neuronális degenerációt PD-ben a lipid-peroxidáció által közvetített mitokondriális károsodás gátlásán keresztül az ajak-autofágia elősegítésével, és potenciális új terápiás stratégiát biztosít a PD és a kapcsolódó NDD-k számára.

További információért kattintson ide

1. Bemutatkozás

A Parkinson-kór (PD) egy gyakori neurodegeneratív betegség (NDD), amelyet kórosan a dopaminerg (DA) neuronok progresszív elvesztése jellemez a substantia nigra pars compactában (SNpc)[]. Bár ennek a betegségnek a pontos etiológiája és természetes lefolyása még nem teljesen tisztázott, számos rendszerszintű folyamat és diszfunkció, köztük a mitokondriális funkciók, a dopamin homeosztázis, az ideggyulladás és az autofágia szerepet játszik a PD patogenezisében [1, 2]. A legújabb jelentések kimutatták, hogy a lipidcseppekkel (LD) kapcsolatos lipotoxicitás szerepet játszhat a PD patológiájában [3,4]. Az LD-k rendkívül dinamikus organellumok, amelyek az endoplazmatikus retikulum (ER) membránból emelkednek ki, és általában a semleges lipidraktározás intracelluláris helyeiként szolgálnak [5]. A közelmúltban kimutatták, hogy az LD-k sokkal szélesebb szerepet játszanak, mint a zsírsav (FA) raktározása, és számos betegségben részt vesznek. Például a mieloid sejtek, köztük a makrofágok, leukociták és eozinofilek, LD-ket képeznek válaszul a gyulladásra és a stresszre, az LD-k pedig a gyulladásos citokintermelés és -raktározás helyszínei, és további szerepet játszanak az antigénprezentációban és a kórokozók eltávolításában [6]. Fontos, hogy ateroszklerózisban az LD-ben gazdag habsejtek a betegség minden szakaszában károsak [7].

A Cistanche segíthet az immunitás javításában

A központi idegrendszerben (CNS) azonban nem vizsgálták alaposan az LD-ket, és kevés írás számol be az LD-k szövettani jelenlétéről az emberi agyszövetben [8,9]. Ennek ellenére az LD-k fontos funkciókat tölthetnek be az agyban, mivel a legújabb tanulmányok megerősítették, hogy a glia aggregált LD-k felgyorsították a neurodegenerációt egy Drosophila modellben [10]. A közelmúltban arról számoltak be, hogy egerekben olajvörös O-pozitív lipidekkel teli sejtek, köztük neuronok, gliafibrilláris savas fehérje (GFAP), valamint asztrociták és ionizált kalciumkötő adaptermolekula-1 (IBA-1) ) mikroglia, számos agyi régióban jelen vannak, és kimutatták, hogy részt vesznek az életkorral összefüggő folyamatokban [11]. Korábbi munkánk egy PD egérmodellben is kimutatta az LD fokozott felhalmozódását az agyban [12]. Összességében ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy az LD-k részt vehetnek a PD, valamint más NDD-k patogenezisében.

Normális esetben az intracelluláris LD-k lebomlanak a lizoszómákban, és a FA-kat a mitokondriumokba szállítják, hogy alternatív energiaforrásként fogyaszthassák el a tápanyag-kimerülés időszakában [13]. A neuronok azonban kevéssé képesek mitokondriális FA-felhasználásra energiatermeléshez [14]. Ez a tulajdonság különösen érzékenysé teszi a neuronokat az LD felhalmozódására és peroxidációjára. Ezenkívül az LD-k felhalmozódása fokozza az FA oxidációs sebességét, és tartós nyomást gyakorol a mitokondriális elektrontranszport láncra, ami növeli a reaktív oxigénfajták (ROS) termelését az I és II elektrontranszport lánc komplexek[15] által az oxidatív stressz felerősítése érdekében. A lipid túlterhelés extramitokondriális források, például nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) oxidázok és más oxidatív enzimek ROS-termeléséhez is vezet. Az antioxidáns enzimek csökkent expressziójával és a neuronok FA-felhasználásának alacsony kapacitásával kombinálva az LD felhalmozódása oxidatív stresszt közvetít, és tovább vezethet mitokondriális károsodáshoz, lizoszómális diszfunkcióhoz, hibás autofágiához és gyulladásos válaszok aktiválásához [16,17]. Hacsak a felhalmozódott LD-k nem gátolhatók vagy eltávolíthatók, a nagyon aktív neuronok patofiziológián mennek keresztül, ami neurodegenerációhoz vezet [17]. A bizonyítékok azt mutatják, hogy a lizoszóma által közvetített katabolikus folyamat, az úgynevezett autofágia kulcsszerepet játszik a sejtes LD homeosztázis fenntartásában több szövetben [17,18]. Részletesebben, az LD-k szelektíven szekvesztrálhatók az autofagoszómákban, és a lizoszómákba juttathatók lebontásra a lizoszómális savas lipázok által, amely folyamat kifejezetten lipofágiaként ismert [19]. Ezért az LD-k megcélzása és autofágiás eltávolítási útvonala új megközelítést jelenthet a neurodegeneráció kezelésében.

A természetes termékek és diétás hatóanyagok mint potenciális NDD-kezelések és stratégiák forrásainak tanulmányozása óriási érdeklődést váltott ki az elmúlt években [20]. A kaempferol (Ka) egy természetes polifenolos kis molekula, amely számos kínai gyógynövényben és étrendi forrásban megtalálható [21]. A Ka antibakteriális, öregedésgátló és immunmoduláló hatást, valamint antioxidáns és neuroprotektív hatást fejt ki [20,22,23]. Korábban arról számoltak be, hogy a Ka in vitro gátolja a BV2 mikrogliasejtek gyulladását [24], és in vivo növeli a DA neuronok ideggyulladással szembeni rezisztenciáját [25]. Azonban a Ka hatását a PD-ben lévő LD-kre még nem vizsgálták.

Tekintettel az LD-k fontosságára, valamint az LD-k, a mitokondriumok és az autofágia közötti bensőséges kapcsolatra [16], amelyek mind részt vesznek a PD-ben, feltételezzük, hogy a Ka gátolja az LD-peroxidációt és megakadályozza a DA neurodegenerációját PD-ben. Jelen tanulmányunkban kimutattuk, hogy a Ka szignifikánsan védett a neurodegeneráció ellen egér PD modellben az LD felhalmozódás gátlásával. További tanulmányok kimutatták, hogy a Ka autofágiát váltott ki és csökkentette az oxidált LD-k felhalmozódását, hogy enyhítse a mitokondriális diszfunkciót és a mitokondriális ROS (mtROS) termelést, ezáltal megelőzve az idegsejtek apoptotikus halálát. Az ebben a tanulmányban kapott eredmények segíthetnek a klinikai döntések meghozatalában a természetes Ka molekula NDD-kben, például PD-ben való felhasználásával kapcsolatban.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérleti állatok

A C57BL/6J egereket (hím, 4-hónapos) a Nanjing Medical University Animal Core-tól (Nanjing) szereztük be. Az egereket a Nanjing Orvostudományi Egyetem Orvostudományi Karának Állatvédelmi Központjában és a Nanjing Drum Tower Hospital állattenyésztési létesítményében tartották fenn és tenyésztették. Az egerek szabadon hozzáférhetnek élelemhez és vízhez egy olyan helyiségben, ahol a környezeti hőmérséklet 22 °C ± 2 °C és a fény/sötétség ciklusa 12:12 óra. Minden állatkísérletet szigorúan a National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Nemzeti Egészségügyi Intézetek Laboratóriumi Állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutatója) irányelveinek megfelelően hajtottak végre.

2.2. Reagensek

MPTP (M0896),3-MA (M9281), penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol(HPLC>99.0 százalék,96 353) az in vitro kísérletekhez a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) a Thermo Fisher Scientific cégtől vásárolt. Állatkísérletekhez a Ka-t 10% DMSO-t 16% SBE- -CD-vel steril sóoldatban tartalmazó oldatban oldottuk fel. A sejtkísérletekhez a Ka-t DMSO-ban (Sigma-Aldrich) és PBS-ben (végső DMSO-koncentráció 0,01%) állítottuk elő, pH 7,4.

2.3. Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) által indukált PD egérmodell indukciója és kezelése

Az MPTP/p-toxicitás PD-modelljében a Ka hatásának értékelése érdekében az egereket (hím, 4-5 hónapos) véletlenszerűen osztottuk a sóoldattal kezelt, MPTP-vel kezelt csoportra, valamint az MPTP plusz Ka-val kezelt csoportokra. csoport, és a Ka egyedül kezelt csoport. Az MPTP-vel kezelt csoportban az egerek krónikus MPTP-t kaptak a korábban leírthoz hasonló protokoll szerint [26]: az MPTP-t sóoldatban oldották fel, és 25 mg/kg-os dózisban szubkután injektálták, majd 250 mg/kg probenecidet (dimetil-szulfoxidban oldva) intraperitoneális (ip) injekció 3,5 naponként 1 órás időközönként 5 héten keresztül. A kontroll egerek sóoldatot és probenecid injekciót kaptak. Az MPTP plusz Ka-val kezelt csoportban az egerek Ka-t (50 mg/kg, napi egyszeri injekció/nap a kísérletek során, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kína) kaptak intraperitoneálisan (.p.) naponta 3 nappal az MPTP-kezelés előtt és az 5 év felett. MPTP injekciós hetek. Egy héttel az utolsó MPTP-injekció után az egereket viselkedési tesztnek vetettük alá, vakon csoportosítva. Ezt követően az összes egeret 40 mg/kg nátrium-pentobarbitállal elaltattuk, és leöltük agyi fehérjék kimutatására és immunhisztokémiára vagy qPCR analízisre.

2.4. In vivo sztereotaxiás sebészet és kísérleti kezelések

A sztereotaxiás műtétet nátrium-pentobarbitál érzéstelenítésben (40 mg/kg, ip) a leírtak szerint [25] végeztük. Az egér Atg5-öt és a kontroll shRNS-t csomagoló vektorokkal (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) transzfektáltuk, hogy AAV-t hozzunk létre. A mikroinjekcióhoz érzéstelenített egereket sztereotaxiás készülékbe helyezünk. Az 1 μLAAV-t üvegelektródával fecskendezték be a DG(AP:-0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV: -0,45 mm）) sebességgel Ezután a tűt további 2-perc 2 hétig megtartottuk a vírus mikroinjekciója után, az egereket MPTP-indukált PD modellvezetési és (vagy) Ka kezelésnek vetettük alá.

Az Atg5 shRNS-t a Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd.-től szereztük be. Az Atg5 csendhez a primereket az 1. kiegészítő táblázatban mutattuk be.

2.5. Viselkedéselemzés

Egy héttel az MPTP vagy sóoldat utolsó injekciója után a rotarod tesztet és a pólustesztet a korábban leírtak szerint [27] végezték el. A rotarod teszthez az egereket a kísérlet megkezdése előtt két egymást követő napon keresztül napi két kísérletben (6 perc, 12-20 fordulat/perc gyorsított sebességgel) akklimatizáltuk a rotarodhoz. Ezután az egereket 20 fordulat/perc mellett 300 másodpercig teszteltük további 3 egymást követő napon. Az esés késleltetését a Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Kína) segítségével rögzítettük. A pólusteszthez az egereket fejjel felfelé egy függőleges faoszlop tetejére helyeztük (durva felületű, 50 cm magas, 1 cm átmérőjű). Minden egeret hozzászoktattunk a berendezéshez 2 nappal a tesztelés előtt, majd a harmadik napon háromszor teszteltük. Feljegyeztük a teljes időt (T-összesen, amíg az egér négy mancsával elérte a padlót) és a fordulási időt (T-turn, amikor az egér teljesen lefelé fordítja a fejét). A kísérletet az egércsoportokra vakon vettük minden viselkedési tesztnél, és a tesztet háromszor végeztük el.

2.6. Agymintagyűjtés

Az utolsó viselkedési tesztek után az egereket nátrium-pentobarbitállal (40 mg/kg, ip.) érzéstelenítettük. A qPCR, Western blot és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) analízishez a teljes agyat gyorsan kinyertük az állatokból, majd a középagyot és A striatum szöveteit gyorsan feldaraboltuk, folyékony nitrogénnel előfagyasztottuk. Minden mintát -80 fokon tároltunk az elemzésig.

Az immunhisztokémiai analízishez az egereket transzkardiálisan perfundáltuk 4 százalékos paraformaldehiddel (PFA). Az agyakat extraháltuk, utófixáltuk, dehidratáltuk, OCT-be ágyaztuk (Tissue-Tek), és az agy sorozatos metszeteit krioszekcióval (30 um per szelet) mindegyik teljes rétegen és középagyon keresztül fagyasztó mikrotom segítségével (Leica CM1950, Nussloch, Németország) végeztük. ). Minden metszetet hat külön sorozatba gyűjtöttünk, és az agyszeleteket 50 százalékos glicerinben tároltuk, és -20 fokon lefagyasztottuk az elemzésig.

A TEM-hez az egereket 2,5% glutáraldehiddel és 2% paraformaldehiddel perfundáltuk a 【12】 leírása szerint. Egy kis adag (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunhisztokémiai elemzés

Az agyszeleteket PBS-ben öblítettük, majd 3 százalékos H2O2-vel 10 percig, majd 1 órán át inkubáltuk 0,3 százalék Triton X-100 PBS-ben, kiegészítve 5 százalék BSA-val. Ezt követően a tárgylemezeket a primer antitestekkel 4 fokon egy éjszakán át inkubáltuk 5% BSA-t tartalmazó PBS-ben 4 fokon egy éjszakán át, majd mostuk és másodlagos antitestekben inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd diaminobenzidinnel (DAB) inkubáltuk vagy DAPI (Life Technologies, Cat P36931) immunfluoreszcens festésként 5 percig. A Nissl-festéshez a lemezeket krezilibolya (CV) oldatban (0,1 g krezilibolya, 99 ml H2O és 1% ecetsav 1 ml) 30 percig szobahőmérsékleten kevertük, majd alkohollal és xilollal dehidratáltuk. A képeket megfigyeltük, és a fényképeket Olympus BX52 mikroszkóp alatt rögzítettük (Olympus America Inc., Melville, NY, Egyesült Államok). Az SNpc-ben található TH-pozitív és Nissl-pozitív neuronok összlétszámát szerológiai úton határoztuk meg, optikai frakcionáló módszerrel MicroBrightField Stereo-Investigator szoftverrel (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) elemzés

Az egerek striatális mintáit {{0}},1 M perklórsavval (1 mg szövetek 100 μl perklórsavban) és 0,1 mM EDTA-val homogenizáltuk.

2.17. Áramlási citometria

A sejteket emésztettük és D-hank-kal öblítettük, majd Annexin V-FITC-vel (5 ul 500 ul PBS-ben/PI-ben hígítva (0,1 ul 500 ul PBS-ben) hígított apoptózis kittel (CA1020, Solarbio, Peking) megfestettük. Chian) a gyártó protokollja szerint. Ezt követően az apoptotikus sejteket áramlási citometriával (guava easyCyteTM 8, Millipore, USA) elemeztük. A mitokondriális ROS és a mitokondriális membránpotenciál méréseket a közzétett 【12】 szerint végeztük. Az SH-SY5Y sejteket MitoSOX-szal (2,5 μM, Invitrogen, USA) vagy JCl-vel (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) festettük. ） 37 °C-on 30 percig. Kétszer PBS-sel történő mosás után a sejteket 1% FBS-t tartalmazó hideg PBS-ben újraszuszpendáltuk áramlási citometriás analízishez. Az adatokat az FCS Express szoftverrel (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA) elemeztük.

2.18. Csikóhal légzési tesztjei

Élő SH-SY5Y sejtekben a mitokondriális légzésfunkciót Seahorse extracelluláris fluxus (XFe96) analizátorral (Agi-lent, Santa Clara, USA) mértük az oxigénfogyasztási ráta (OCR) változásán keresztül. A 3×103 sejt/lyuk arányban beoltott SH-SY5Y sejteket hagytuk tapadni a Seahorse sejttenyésztő lemezekhez, és a kísérlet idején megközelítőleg 80 százalékos összefolyást érnek el. A következő napon a sejteket előkezeltük Ka-val, majd további 24 órán át MPP plusznak tettük ki. Az OCR-t alapkörülmények között detektáltuk, majd egymás után 1 μM oligomicint, 1 μM FCCP-t, valamint 1 μM rotenont és antimycin A-t adtunk hozzá.

2.19. Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában adtuk meg. A különbség szignifikanciáját Student-féle t-próbával, kétutas varianciaanalízissel vagy egytényezős varianciaanalízissel (ANOVA) határoztuk meg, amelyet Tukey post hoc teszt követett. A különbséget szignifikánsnak tekintették P<>

3. Eredmények

Eredmény 1. A Ka helyreállítja a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet az MPTP/p PD modell egerek striatumában

A Kaon PD patogenezisének neuroprotektív hatásának vizsgálatára 4-hónapos hím C57BL/6 egereket injektáltunk MPTP neurotoxinnal, hogy létrehozzuk az MPTP/p PD modellt, és Ka-val kezeljük őket (la ábra). A modellindukciót követően a rotarod tesztet és a pólustesztet használtuk az egerek motoros és viselkedési teljesítményének értékelésére a különböző csoportokban. Amint látható, a rotarod teljesítményének ideje jelentősen csökkent az MPTP-vel kezelt egerekben, és ezt a hatást a Ka megakadályozta (1b. ábra). Ka helyreállította az MPTP által kiváltott viselkedésbeli hiányosságokat, amint azt a pólustesztben a fordulási idő és a teljes idő csökkenése jelzi (lc. és d. ábra), anélkül, hogy az egerek testsúlyát befolyásolta volna (1e. ábra). Ezenkívül a HPLC analízis azt mutatta, hogy a striatum dopaminszintje szignifikánsan csökkent MPTP/p-vel kiváltott egerekben, és ezt a szintet a Ka-kezelés visszaállította (1f. ábra). A Ka-kezelés emellett enyhítette a dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC, a dopamin metabolitja) szintjének MPTP/p által kiváltott csökkenését a striatumban (1g. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Ka helyreállítja a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet a striatumban MPTP-indukált PD egerekben.

2. eredmény: A Ka enyhíti a DA neuronok elvesztését MPTP/p PD modell egerek SNpc-jében

Ezt követően a Kaon MPTP/p-indukált DA neuronális károsodásának neuroprotektív hatásának további értékelése érdekében a tirozin-hidroxilázt (THD plusz neuronok az egér SNpc-ben immunfestéssel) vizsgáltuk. Amint a 2a és b ábrákon látható, az MPTP/p szignifikáns csökkenést indukált a TH plusz neuronok számában, amit a Ka-kezelés enyhített, továbbá az SNpc-ben lévő összes neuron sztereológiai száma, Nissl meghatározása szerint

1. ábra: A Ka-kezelés enyhíti a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet MPTP/p PD modell egerek striatumában.

(a) A kísérleti terv sematikus diagramja. (b) A pálcán töltött időt három egymást követő napon mértük a rotarod teszthez. (cd) A rúdteszthez feljegyezték a megforduláshoz (fordulás ideje) és a rúdon való leereszkedéshez szükséges időt (mászás ideje). (e) A vizsgálat végén megmértük az egerek testtömegét, (fg) A dopamint (DA) és a dihidroxi-fenil-ecetsavat (DOPAC) a striatumban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával elemeztük. Az adatokat átlag ± SEM.n =9-10 értékben fejezzük ki a (b, C, d) minden csoportra vonatkozóan; n=6-8 minden csoporthoz in(f,g).ns, nem szignifikáns,*P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

festést, igazolta, hogy a THt sejtek elvesztése a sejthalált tükrözi, de nem a TH expresszió csökkenését, és kimutatta, hogy a Ka-kezelés helyreállította az MPTP-vel kezelt egerek SNpc-jében a Nissl-pozitív neuronok számának 43,3 százalékról 25,4 százalékra csökkenését. 2c. és d. ábra. Ezenkívül a Ka szignifikánsan javította a TH- és DAT-fehérje-expresszió MPTP-indukálta csökkenését, Western-blot-vizsgálattal mérve (2e-g ábra). Ez a bizonyíték megerősíti a Ka neuroprotektív hatását a PD egérmodellre.

3. eredmény: A Ka csökkenti az LD vakuolák felhalmozódását és az oxidatív stresszt az MPTP/p-vel kezelt egerek SNpc-jében

Egyre több bizonyíték támasztja alá az LD-k szerepét az NDD-kben [10], következetesen korábbi munkáink megnövekedett LD-értékeket azonosítottak MPTP-indukált PD egerek SNpc-jében [12]. Az LD-k könnyen azonosíthatók, és kerek, kis sűrűségű struktúrákat mutatnak homogén amorf tartalommal [28]. Normális esetben az LD-k autofágiával lebonthatók a felhalmozódás elkerülése érdekében [29]. Annak vizsgálatára, hogy a Ka szabályozhatja-e az LD-ket PD-ben, transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) elemeztük az LD-k felhalmozódását a kontroll, MPTP/p és MPTP/p plusz Ka egerek SNpc-jében. Amint azt korábbi munkánkból [12] mutattuk, az LD-k száma és mérete nőtt az MPTP/p egerekben a sóoldattal kezelt kontrollokhoz képest (3a. és b. ábra), és jelentősen csökkent a Ka-val kezelt egerekben (3c. ábra). e). Ezenkívül a Ka-kezelt egerekben az LD-ket gyakrabban figyelték meg az autolizoszómák közelében, azokba zárva vagy lebontva, amelyeket elektronsűrű lipofuscin granulátumként határoztak meg. A TH plusz neuronok további szövettani festése BODIPY-val, egy olyan festékkel, amely specifikusan jelöli a semleges lipideket, és általánosan használt LD-k kimutatására [30], azt mutatta, hogy az SNpc-ben a BODIPY plusz LD-k száma és mérete is magasabb volt PD egerekben, mint a kontrollokban. , és szignifikánsan csökkent a Ka-kezelés (3f-h ábra).

Ha az LD-ket nem lehet időben lebontani, a felhalmozódott LD-k peroxidáción mennek keresztül, és hozzájárulhatnak a mitokondriális ROS által közvetített stresszhez [4], ami felerősíti a neurotoxicitást és a betegség progresszióját. Ezért tovább vizsgáltuk a szabad FA toxicitás (Gpx8), a semlegesítő oxidatív fajok, a szuperoxid gyökök (Sod3) és a hidrogén-peroxid (Cat), valamint az FA metabolizmus (Acsbg1 és Dbi) elleni védelemmel kapcsolatos gének expressziós profilját, ahogyan a beszámoltak [31] , amelyek mindegyike feltűnően csökkent az MPTP-vel kezelt egerek SNpc-ében a kontrollokhoz képest, és ezek a hatások javultak a Ka-val kezelt PD egerekben (3i. ábra). Hasonlóképpen, az MPTP/p is növelte az mRNS expressziós szintjét

Az MPTP/p egerek SNpc-jében a NADPH-oxidáz alegységek, például a Nox1, Nox2 és Nox4, amelyeket Ka-kezelés tovább tompított (3j. ábra). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a Ka enyhíti az MPTP/p által kiváltott LD-felhalmozódást, a peroxidációt és a ROS által közvetített stresszt.

Ez a cikk a ScienceDirect Redox Biology folyóirat honlapján elérhető tartalomjegyzékből származik: www.elsevier.com/locate/redox