A 3. rész tanulmányai kimutatták, hogy az autofágia fontos szerepet játszik a sejtes LD-lerakódás szabályozásában

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

ABSZTRAKT

Az újabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a váratlan lipidcseppek (LD) lerakódása és peroxidációja felgyorsíthatja az organellák stresszét, és döntő szerepet játszik a neurodegeneratív betegségek (NDD-k) patogenezisében. Korábbi vizsgálatunkban megerősítettük, hogy a kaempferol (Ka), egy természetes flavonoid kis molekula, neuroprotektív hatást fejtett ki az LPS által kiváltott Parkinson-kórban (PD) szenvedő egereken. Emellett korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az autofágia fontos szerepet játszik a sejtes LD lerakódás szabályozásában. A jelenlegi vizsgálatban kimutattuk, hogy a Ka védelmet nyújt a TH plusz neuronveszteség és viselkedési hiányosságok ellen MPTP/p-indukált PD egerekben, amit a substantia nigra pars compacta (SNpc) csökkent lipidoxidatív stressz kísér. A tenyésztett neuronális sejtekben a Ka viszonylag biztonságos koncentrációtartományt mutatott, és jelentősen elnyomta az LD-felhalmozódást és az MPP plusz által kiváltott sejtes apoptózist. További vizsgálatok azt mutatták, hogy a Ka védő hatása az autofágiától, különösen a lipofagiától függ. Kritikusan a Ka elősegítette az autofágiát, hogy közvetítse az LD lebomlását a lizoszómákban, ami aztán enyhítette a lipidlerakódást és a peroxidációt, valamint az ebből eredő mitokondriális károsodást, következésképpen csökkentve az idegsejtek halálát. Ezenkívül az AAV-shAtg{3}}közvetített Atg5 leütés megszüntette a Ka neuroprotektív hatását a lipidoxidációval szemben PD egerekben.Cistanche a memória javításáraEz a munka azt mutatja, hogy a Ka megakadályozza a dopaminerg neuronális degenerációt PD-ben a lipid-peroxidáció által közvetített mitokondriális károsodás gátlásán keresztül az ajak-autofágia elősegítésével, és potenciális új terápiás stratégiát biztosít a PD és a kapcsolódó NDD-k számára.

További információért kattintson ide

Bevezetés

A Parkinson-kór (PD) egy gyakori neurodegeneratív betegség (NDD), amelyet kórosan a dopaminerg (DA) neuronok progresszív elvesztése jellemez a substantia nigra pars compactában (SNpc)[1]. Bár ennek a betegségnek a pontos etiológiája és természetes lefolyása még nem teljesen tisztázott, számos rendszerszintű folyamat és diszfunkció, köztük a mitokondriális funkciók, a dopamin homeosztázis, az ideggyulladás és az autofágia szerepet játszik a PD patogenezisében [1, 2]. A legújabb jelentések feltárták, hogy a lipidcseppekkel (LD) kapcsolatos lipotoxicitás szerepet játszhat a PD patológiájában [3,4]. Az LD-k rendkívül dinamikus organellumok, amelyek az endoplazmatikus retikulum (ER) membránjából emelkednek ki, és általában a semleges lipidraktározás intracelluláris helyeiként szolgálnak [5]. A közelmúltban kimutatták, hogy az LD-k sokkal szélesebb szerepet játszanak, mint a zsírsav (FA) tárolása, és számos betegségben részt vesznek. (cistanche para que serve) Például a mieloid sejtek, beleértve a makrofágokat, leukocitákat és eozinofileket, LD-ket képeznek válaszul a gyulladásra és a stresszre,cistanche kínaiulés az LD-k a gyulladásos citokintermelés és raktározás helyszínei, és további szerepet játszanak az antigénprezentációban és a kórokozók eltávolításában [6]. Fontos, hogy ateroszklerózisban az LD-ben gazdag habsejtek a betegség minden szakaszában károsak [7].

A Cistanche javíthatja az immunitást

Az LD-ket azonban nem vizsgálták alaposan a központi idegrendszerben (CNS), és kevés írás számol be az LD-k szövettani jelenlétéről az emberi agyszövetben [8,9]. Ennek ellenére az LD-k fontos funkciókat tölthetnek be az agyban, mivel a legújabb tanulmányok megerősítették, hogy a glia aggregált LD-k felgyorsították a neurodegenerációt egy Drosophila modellben [10]. A közelmúltban arról számoltak be, hogy egerekben olajvörös O-pozitív lipidekkel teli sejtek, köztük neuronok, gliafibrilláris savas protein (GFAP)t asztrociták és ionizált kalciumkötő adaptermolekula-1 (IBA{{7}) })t mikroglia számos agyi régióban jelen van, és kimutatták, hogy részt vesznek az életkorral összefüggő folyamatokban [11]. Korábbi munkánk egy PD egérmodellben is kimutatta az LD fokozott felhalmozódását az agyban [12]. Összességében ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy az LD-k részt vehetnek a PD, valamint más NDD-k patogenezisében.

Normális esetben az intracelluláris LD-k lebomlanak a lizoszómákban, és a FA-kat a mitokondriumokba szállítják, hogy alternatív energiaforrásként fogyaszthassák el a tápanyag-kimerülés időszakában [13]. A neuronok azonban kevéssé képesek mitokondriális FA-felhasználásra energiatermeléshez [14]. Ez a tulajdonság különösen érzékenysé teszi a neuronokat az LD felhalmozódására és peroxidációjára. Ezenkívül az LD-k felhalmozódása fokozza az FA oxidációs sebességét, és tartós nyomást gyakorol a mitokondriális elektrontranszport láncra, ami fokozza a reaktív oxigénfajták (ROS) termelését az I. és III. elektrontranszport lánc komplexek [15] által az oxidatív stressz felerősítése érdekében. A lipid túlterhelés extramitokondriális források, például nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) oxidázok és más oxidatív enzimek ROS-termeléséhez is vezet. Az antioxidáns enzimek csökkent expressziójával és a neuronok FA-felhasználásának alacsony kapacitásával kombinálva az LD felhalmozódása oxidatív stresszt közvetít, és tovább vezethet mitokondriális károsodáshoz, lizoszómális diszfunkcióhoz, hibás autofágiához és gyulladásos válaszok aktiválásához [16,17]. Hacsak a felhalmozódott LD-k nem gátolhatók vagy eltávolíthatók, a nagyon aktív neuronok patofiziológián mennek keresztül, ami neurodegenerációhoz vezet [17]. (cistanche pénisz) A bizonyítékok azt mutatják, hogy a lizoszóma által közvetített katabolikus folyamat, az úgynevezett autofágia kulcsszerepet játszik a sejtes LD homeosztázis fenntartásában több szövetben [17,18]. Részletesen,cistanche pénisz növekedésAz LD-k szelektíven szekvesztrálhatók az autofagoszómákban, és a lizoszómákba juttathatók lebontásra a lizoszómális savas lipázok által, ezt a folyamatot kifejezetten lipofagiának nevezik [19]. Ezért az LD-k megcélzása és autofágiás eltávolítási útvonala új megközelítést jelenthet a neurodegeneráció kezelésében.

A természetes termékek és diétás hatóanyagok mint potenciális NDD-kezelések és stratégiák forrásainak tanulmányozása óriási érdeklődést váltott ki az elmúlt években [20]. A kaempferol (Ka) egy természetes polifenolos kis molekula, amely számos kínai gyógynövényben és étrendi forrásban megtalálható [21]. A Ka antibakteriális, öregedésgátló és immunmoduláló hatást, valamint antioxidáns és neuroprotektív hatást fejt ki [20,22,23]. Korábban arról számoltak be, hogy a Ka in vitro gátolja a BV2 mikrogliasejtek gyulladását [24], és in vivo növeli a DA neuronok ideggyulladással szembeni rezisztenciáját [25]. A Kaon LD-k hatását PD-ben azonban még nem vizsgálták.

Tekintettel az LD-k fontosságára, valamint az LD-k, a mitokondriumok és az autofágia közötti bensőséges kapcsolatra [16], amelyek mind részt vesznek a PD-ben, feltételezzük, hogy a Ka gátolja az LD-peroxidációt és megakadályozza a DA neurodegenerációját PD-ben. Jelen tanulmányunkban kimutattuk, hogy a Ka szignifikánsan védett a neurodegeneráció ellen egér PD modellben az LD felhalmozódás gátlásával. (cisztánpor) További tanulmányok kimutatták, hogy a Ka autofágiát váltott ki, és csökkentette az oxidált LD-k felhalmozódását, hogy enyhítse a mitokondriális diszfunkciót és a mitokondriális ROS (mtROS) termelést, ezáltal megelőzve az idegsejtek apoptotikus halálát.cistanche propedadesAz ebben a tanulmányban kapott eredmények segíthetnek a klinikai döntések meghozatalában a természetes Ka molekula NDD-kben, például PD-ben való felhasználásával kapcsolatban.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérleti állatok

A C57BL/6J egereket (hím, 4- hónapos) a Nanjing Medical University Animal Core-tól (Nanjing) szereztük be.cistanche tubulosa beneficiosAz egereket a Nanjing Orvostudományi Egyetem Orvostudományi Karának Állattenyésztési Központjában, valamint a Nanjing Drum Tower Hospital állattenyésztési létesítményében tartották fenn és tenyésztették. Az egerek szabadon hozzáférhetnek élelemhez és vízhez egy olyan helyiségben, ahol a környezeti hőmérséklet 22° ± 2 fok, és a fény/sötét ciklus 12:12 óra. Minden állatkísérletet szigorúan a National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Nemzeti Egészségügyi Intézetek Laboratóriumi Állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutatója) irányelveinek megfelelően hajtottak végre.

2.2.Reagensek

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.{1}} százalék,96 353) az in vitro kísérletekhez a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) és DHE (D11347) a Thermo Fisher Scientific cégtől vásárolt. Állatkísérletekhez a Ka-t 10% DMSO-t 16% SBE- -CD-vel steril sóoldatban tartalmazó oldatban oldottuk fel. A sejtkísérletekhez a Ka-t DMSO-ban (Sigma-Aldrich) és PBS-ben (végső DMSO-koncentráció 0,01%) állítottuk elő, pH 7,4.

2.3. Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) által indukált PD egérmodell indukciója és kezelése

A Ka hatásának az MPTP/p-toxicitás PD-modelljében való értékelése érdekében az egereket (hím, 4-5 hónapos) véletlenszerűen osztottuk sóoldattal kezelt, MPTP-vel kezelt, MPTP-vel és Ka-val kezelt csoportokra. , és Ka egyedül kezelt csoport. Az MPTP-vel kezelt csoportban az egerek krónikus MPTP-kezelést kaptak a korábban leírthoz hasonló protokoll szerint [26]: az MPTP-t sóoldatban oldották fel, és 25 mg/kg dózisban szubkután injektálták, majd 250 mg/kg probenecidet (dimetil-szulfoxidban oldva) intraperitoneális (ip) injekció 3,5 naponként 1 órás időközönként 5 héten keresztül. (cisztángyökér) A kontroll egerek sóoldatot és probenecid injekciót kaptak. Az MPTP plusz Ka-val kezelt csoportban az egerek kaptak Ka-t (50 mg/kg, egyszeri injekció/nap a kísérletek során, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kína) intraperitoneálisan (ip) naponta 3 nappal az MPTP-kezelés előtt és az 5 MPTP felett. injekciós hetek. Egy héttel az utolsó MPTP-injekció után az egereket viselkedési tesztnek vetettük alá, vakon csoportosítva. Ezt követően az összes egeret 40 mg/kg nátrium-pentobarbitállal elaltattuk, és leöltük agyi fehérjék kimutatására és immunhisztokémiára vagy qPCR analízisre.

2.4. In vivo sztereotaxiás sebészet és kísérleti kezelések

A sztereotaxiás műtétet nátrium-pentobarbitál érzéstelenítésben (40 mg/kg, ip) végeztük a leírtak szerint [25]. Az egér Atg5-öt és a kontroll shRNS-t csomagoló vektorokkal (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP) transzfektáltuk az AAV generálására. A mikroinjekcióhoz érzéstelenített egereket sztereotaxiás készülékbe helyezünk. 1 μL AV-t fecskendeztek be a DG-t célzó üvegelektródával (AP: -0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV: -0,45 mm) olyan sebességgel 0,25 μl/perc, majd a tűt további 2-percig megtartottuk 2 héttel a vírus mikroinjekciója után, az egereket MPTP-indukált PD modellvezetési és (vagy) Ka kezelésnek vetettük alá.

Az Atg5 shRNS-t a Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd.-től szereztük be. Az Atg5 csendhez a primereket az 1. kiegészítő táblázatban mutattuk be.

2.5. Viselkedéselemzés

Egy héttel az MPTP vagy sóoldat utolsó injekciója után a rotarod tesztet és a pólustesztet a korábban leírtak szerint [27] végezték el. A rotarod teszthez az egereket a kísérlet megkezdése előtt két egymást követő napon keresztül napi két kísérletben (6 perc, 12-20 fordulat/perc gyorsított sebességgel) akklimatizáltuk a rotarodhoz. Ezután az egereket 20 fordulat/perc mellett 300 másodpercig teszteltük további 3 egymást követő napon. Az esés késleltetését a Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Kína) segítségével rögzítettük. A pólusteszthez az egereket fejjel felfelé egy függőleges faoszlop tetejére helyeztük (durva felületű, 50 cm magas, 1 cm átmérőjű). Minden egeret hozzászoktattunk a berendezéshez 2 nappal a tesztelés előtt, majd a harmadik napon háromszor teszteltük. Feljegyeztük a teljes időt (T-összesen, amíg az egér négy mancsával elérte a padlót) és az elfordulási időt (T-turn, amíg az egér teljesen lefelé fordítja a fejét). A kísérletet minden egyes viselkedési tesztnél megvakítottuk egércsoportokkal, és a tesztet háromszor végeztük el.

2.6. Agymintagyűjtés

Az utolsó viselkedési tesztek után az egereket nátrium-pentobarbitállal (40 mg/kg, ip) érzéstelenítettük. A qPCR, Western blot és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) analízishez a teljes agyat gyorsan kinyertük az állatokból, majd a középagy és a striatum szöveteit gyorsan feldaraboltuk, folyékony nitrogénnel előfagyasztva. Minden mintát -80 fokon tároltunk az elemzésig.

Az immunhisztokémiai analízishez az egereket transzkardiálisan perfundáltuk 4 százalékos paraformaldehiddel (PFA). Az agyakat extraháltuk, utófixáltuk, dehidratáltuk, OCT-be (Tissue-Tek) ágyaztuk, és az agy sorozatos metszeteit kriometszettük (30 μm per szelet) minden teljes rétegen és középagyon keresztül fagyasztó mikrotom segítségével (Leica CM1950, Németország, Nussloch). ). Minden metszetet hat külön sorozatba gyűjtöttünk, és az agyszeleteket 50 százalékos glicerinben tároltuk, és -20 fokon lefagyasztottuk az elemzésig.

A TEM-hez az egereket 2,5% glutáraldehiddel és 2% paraformaldehiddel perfundáltuk a 【12】 leírása szerint. Egy kis adag (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunhisztokémiai elemzés

Az agyszeleteket PBS-ben öblítettük, majd 3 százalékos H2O2-vel 10 percig, majd 1 órán át inkubáltuk 0,3 százalék Triton X-100 PBS-ben, kiegészítve 5 százalék BSA-val. Ezt követően a lemezeket a primer antitestekkel 4 fokon egy éjszakán át inkubáltuk 5% BSA-t tartalmazó PBS-ben 4 fokon egy éjszakán át, majd mostuk és másodlagos antitestekben inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd diaminobenzidinnel (DAB) inkubáltuk vagy DAPI (Life Technologies, Cat P36931) immunfluoreszcens festésként 5 percig. A Nissl-festéshez a lemezeket krezilibolya (CV) oldatban (0,1 g krezilibolya, 99 ml víz és 1%-os ecetsav 1 ml) összeöntöttük 30 percig szobahőmérsékleten, majd alkohollal és xilollal dehidratáltuk. A képeket megfigyeltük, és a fényképeket Olympus BX52 mikroszkóp alatt rögzítettük (Olympus America Inc., Melville, NY, Egyesült Államok). Az SNpc-ben található TH-pozitív és Nissl-pozitív neuronok összlétszámát szerológiai úton határoztuk meg, optikai frakcionáló módszerrel MicroBrightField Stereo-Investigator szoftverrel (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7.Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) elemzés

Az egerek striatális mintáit {{0}},1 M perklórsavval (1 mg szövetekkel) homogenizáltuk 100µl perklórsavban és 0,1 mM EDTA-ban, ultrahanggal kezeltük, és 20, 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 30 percig, ahogy azt közölték [27]. Ezután a felülúszó folyadékokat összegyűjtöttük méréshez. A mozgófázis egy vegyes oldat, amely 90 mM egybázisú nátrium-foszfátot, 1,7 mM 1-oktánszulfonsavat, 50 mM citrátot, 50 nM EDTA-t, 10% acetonitrilt tartalmaz, áramlási sebessége 0,2 ml/perc. Ezzel párhuzamosan a kvantitatív standard görbe kiszámításához dopamin és dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC) törzsoldatot (Sigma-Aldrich, USA) készítettünk 0,1 M HClO4-ben, majd 10 ul elkészített felülúszót vagy standard oldatot injektáltunk. a mozgófázisba, és ESA Coulochem III elektrokémiai detektorral (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific) teszteltük.A mintákat mértük és a csúcsokat számszerűsítettük.A monoaminok koncentrációját a standarddal való összehasonlítással kvantifikáltuk ClarityChrom szoftverrel (Knauer,Németország), majd A DA és DOPAC standard görbéjét az 1a és b kiegészítő ábra mutatja.

2.8. Sejtkultúrák és kezelések

A mesencephalikus primer neurontenyészeteket a korábban leírtak szerint végeztük [12]. Röviden, a C57BL/6 egerek mesencephalis szöveteit a 14/15. embrionális napon (E14/15) óvatosan eltávolítottuk, mechanikusan disszociáltuk, hogy eltávolítsuk a membránokat és a nagy vérereket. majd felboncolták. Ezt követően tripszin-EDTA-val emésztettük (Amresco, Solon, OH, USA), majd egy 100-um szűrőn átszűrtük, hogy egysejtű szuszpenziót kapjunk. Ezt követően a sejteket poli-L-lizinnel előzetesen bevont 12-/24-lyukú lemezekre szélesztettük 2,5 × 10 fokos sejt/ml-ben, amely Neurobasal táptalajt (Cat 21103049, GibcoTM) tartalmazott. , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA), kiegészítve B27-tel (2 térfogatszázalék, Cat 1750404, GibcoTM) és penicillinnel/sztreptomicinnel (0,5 térfogatszázalék). A tenyészeteket párásított kamrában (37 °C, 5% CO2 inkubátor) tartottuk. A táptalajt 3 naponta cserélték, és a sejtek 7-10 naponként használhatók fel.

Sejtvonalak: Az SH-SY5Y sejtvonalakat 1% FBS-ben és 1% penicillin/sztreptomicinben tenyésztettük párásított inkubátorban 37 fokos hőmérsékleten és 5% CO2 mellett. A kísérletekben az SH-SY5Y sejteket MPP plusz (200 μM) vagy különböző dózisú Ka-val (0,3,30,60,100,300,600 uM) kezeltük 24 órán át.Ka(3,10, 30,60 μM, 3h) primed-SH- Az SY5Y sejteket MPPt-vel (400 μM) 24 órán át stimuláltuk. Ka (30 μM, 3 óra) (vagy anélkül) 3-MA-val (3 mM, 1 óra) vagy -tokoferollal (50 μM, 1 óra, 3 dús, 47-8 Al d, 47-8 Al d) ）A primed-SH-SH5Y sejteket MPPT-vel (200 µM) stimuláltuk 24 órán keresztül.

2.9. Sejtéletképességi CCK8 vizsgálat

A Ka-kezelés megváltozott sejtéletképességét a Cell Counting Kit-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA) kimutatta. Röviden, az SHSY5Y sejteket egy 96- lyukú lemezt, majd különböző koncentrációjú Ka (3,30,60,100,300,600,600 uM)-val kezeljük 24 órán keresztül. Ezután 10 ul CCK-8 reagenst adtunk mindegyik lyukba 4 órán keresztül. Végül az abszorbanciát a Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) 450 nm-en detektáltuk.

2.10. ATP vizsgálat

A celluláris ATP-szinteket ATP Bioluminescence Assay Kit-tel (Beyotime Biotechnology Co., Kína) detektáltuk a gyártó utasításai szerint. A kezelést követően a sejteket lizáltuk és 12, 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig 4 fokon, majd a felülúszókat összegyűjtöttük. Munkaoldatot (100 μL) adtunk 20 µl mintához a 96-lyuklemezben, és a lumineszcenciát azonnal megmértük egy automata mikrolemez-leolvasón. Az összes mintából származó méréseket a fehérjekoncentrációra normalizáltuk.

2.11.Na plusz -K plusz -ATPáz vizsgálat

A Nat-K plusz -ATPáz méréshez (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Kína) a sejteket ultrahanggal kezeltük, és 600 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig, hogy a felülúszót megkapjuk. Nat-Kt-ATPáz detektálási reakcióoldatokat adtunk hozzá, és a gyártó utasításai szerint inkubáltuk. Ezután az abszorbanciát 660 nm-en detektáltuk. Az összes minta mérését a fehérjekoncentrációra normalizáltuk.

2.12. Western blot elemzés

A sejteket vagy agyszöveteket RIPA pufferben lizáltuk (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl, 1% NP-40 (FNN0021, Thermo), 0,5% nátrium-dezoxikolát (D6750, Sigma), 0,1% SDS (74255, Sigma), proteázzal kiegészítve és foszfatáz inhibitorok (Roche, Shanghai, Kína). A fehérjekoncentrációt Micro BCA Kittel (Beyotime, Shanghai, Kína) határoztuk meg. Minden mintából egy 30- ug fehérjét választottunk el SDS-PAGE-val poliakrilamid TGX gélek (Bio-Rad, Hercules, California, USA) segítségével, majd polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra vittük át (Millipore, Bedford, MA). A blokkolást követően a PVDF membránokat különböző specifikus primer antitestekkel inkubáltuk TBST-ben 4 fokon egy éjszakán át, majd mostuk és megfelelő torma-peroxidázzal (HRP) konjugált másodlagos antitestekben inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Az immunreaktív sávokat fokozott kemilumineszcenciával (ECL) plusz detektáló reagenssel (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) tettük láthatóvá és detektáltuk, majd ImageQuantTM LAS 4000 képalkotó rendszerrel (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) elemeztük.

2.13. Valós idejű kvantitatív (Q) és reverz transzkripciós (RT) - PCR

A teljes RNS-t az agyszövetekből és a tenyésztett sejtekből Trizol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk. A reverz transzkripciót a TAKARA PrimeScript RT reagenskészlettel (TaKaRa, Japán) végeztük. A valós idejű qPCR-t SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) segítségével végeztük StepOnePlus készülékben (Applied Bio-systems). A primereket a General (Sanghaj, Kína) vásárolta és validálta. A qPCR-hez használt primereket a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Ez a cikk a Redox Biology 41 (2021) 101911-ből származik