A Morus Albából izolált Kuwanon T és Sanggenon A gyulladáscsökkentő hatást fejt ki az NF-κB és HO-1/Nrf2 jelátviteli útvonalak szabályozásával a BV2 és RAW264.7 sejtekben

További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: Korábban a Morus alba kéreg metanolos kivonatát vizsgáltuk, és a kivonatból 11 vegyületet jellemeztünk: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) és norartocarpanon (11). Itt megvizsgáltuk agyulladáscsökkentőezeknek a vegyületeknek a mikrogliasejtekre (BV2) és makrofágokra (RAW264.7) gyakorolt ​​hatásait. Közülük a 3 és 4 jelentősen gátolta a lipopoliszacharidok (LPS) által kiváltott nitrogén-monoxid termelődését ezekben a sejtekben, ami e két vegyület gyulladásgátló tulajdonságaira utal. Ezek a vegyületek gátolták a prosztaglandin E2, az interleukin-6 és a tumornekrózis faktor-c termelődését, valamint az indukálható nitrogén-monoxid-szintáz és ciklooxigenáz-2 expresszióját LPS-stimulációt követően. A 3-as és 4-es előkezelés mindkét sejttípusban gátolta a nukleáris faktor kappa B jelátviteli útvonalának aktiválódását. A vegyületek a hem oxigenáz (HO)-1 expresszióját is indukálták a nukleáris faktor eritroid 2-rokon 2-es faktor aktiválásával. A HO-1 aktivitásának elnyomása visszafordította az okozott gyulladáscsökkentő hatásokat. 3-as és 4-es előkezeléssel, ami arra utal, hogy a gyulladáscsökkentő hatást a HO-1 szabályozta. A 3. és 4. együttvéve potenciális jelöltek a terápiás és megelőző szerek kifejlesztéséregyulladásos betegségek.

Kulcsszavak: Morus alba; kuwanon T; sanggenon A; BV2; RAW264.7 cellák; gyulladáscsökkentő hatások

További termékekért kattintson ide

1. Bemutatkozás

A Morus alba-t, a Moraceae családjába tartozó gyógynövényt a hagyományos gyógyászatban tüdőgyulladásos betegségek kezelésére használták [1]. Gyökérkérge különféle aktív komponenseket tartalmaz, mint például umbelliferont, skopoletint, mucinokat, tanninokat,flavonoidok(moruzin, mulberrin, mulberrikromén, ciklomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E és kuwanon H)[2], 2-arilbenzofuránok (moracenin D, moracin P, moracin O és mulberrofuran O), és prenilált flavonoidok (licoflavon C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin és Kuwana U)[3,4]. A M. alba kivonatai és hatóanyagai enyhíthetik a tüdőbetegségeket, amint azt a közelmúltban végzett vizsgálatok [5-7] igazolták. A M.alba tüdőre gyakorolt ​​farmakológiai hatása mellett az izoprenilezett flavonoidok (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G és mulberrofuran C) májvédő hatást fejtenek ki a t-BHP által kiváltott HepG2 sejtekben [8]. A prenil-flavonoidok (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T és morusin) és triterpenoidok (betulinsav, avail és -szitoszterol) jelentősen gátolják a 3T3-L1 zsírsejtek differenciálódását [9]. A morin-hidrát, a M. alba fő flavonoid összetevője enyhíti a krónikus, előre nem látható stressz által kiváltott memóriazavart, jelezve, hogy ez a vegyület fokozhatja az antioxidáns védekező rendszert és gátolja a neurogyulladásos folyamatokat [10]. Ezek a tanulmányok arra utalnak, hogy az M. alba-ban található összetevők potenciális jelöltek különböző betegségek kezelésére.

Gyulladás, a káros ingerekre adott komplex önvédelmi válasz, fontos szerepet játszik az immunvédelemben számos immunsejt, köztük makrofágok, monociták, leukociták, hízósejtek és más sejttípusok aktiválása révén [11]. A makrofágok a legelterjedtebb és legszélesebb körben elterjedt immunsejtek a szervezetben, a mikrogliák pedig a központi idegrendszerben (CNS) rezidens makrofágok[12]. A makrofágok és a mikroglia sejtek kulcsszerepet játszanak a gyulladásos válaszban. Aktiválhatók olyan ingerekre adott válaszként, mint a lipopoliszacharidok (LPS), citokinek és kemokinek, és gyulladásos állapotokat idézhetnek elő [13]. Gyulladásos körülmények között a túlzottan aktivált makrofágok és mikrogliasejtek a gyulladást elősegítő mediátorok (nitrogén-monoxid (NO), prosztaglandin E2 (PGE,), indukálható nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS) és ciklooxigenáz (COX) abnormális szabályozását okozzák-2 ) és pro-inflammatorikus citokinek (interleukin (IL)-6 és tumor nekrózis faktor (TNF)-a) a nukleáris faktor kappa B (NF-B) jelátviteli útvonalának aktiválása révén[14,15]. A gyulladást elősegítő mediátorok megnövekedett szintje tovább súlyosbítja a gyulladásos betegségek progresszióját, ami tovább fokozza a gyulladásos faktorok aktiválódását, és ezáltal ördögi kört eredményez[16]. Ezért a gyulladásos közvetítők szabályozása elengedhetetlen a gyulladásos betegségek kezelésében és megelőzésében.

A hem oxigenáz (HO)-1 egy sebességkorlátozó enzim, amely katalizálja a hem biliverdinné, vasionná (Fe2 plusz) és szén-monoxiddá (CO) való lebomlását[17]. A HO-1 indukciót a nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2) aktiválása szabályozza. A HO-1 oxidatív stresszre és gyulladásra adott válaszként indukálható a szövetek védelme és a szervezet homeosztázisának fenntartása érdekében[18]. Ezért a HO-1 indukció megcélzása a gyulladásos betegségek kezelésének egyik lehetséges stratégiája.

Folyamatosan törekszünk arra, hogy természetes termékekből feltárjunk jelölt(ek)et a gyulladásos betegségek kezelésére, bemutatjuk agyulladáscsökkentő hatásokLPS-indukált BV2 és RAW264.7 sejtekben M. alba-ból izolált 11 1 vegyület.

2. Eredmények

2.1. Az M. albából izolált 11 vegyület hatása a BV2 és RAW264.7 sejtek életképességére

Az előző vizsgálatban az M.alba gyökérkérgét vizes metanollal extraháltuk, és a kapott kivonatokat egymás után EtOAc-ra, n-BuOH-ra és H2O2-re osztották fel. Az EtOAc frakció ismételt SiO2, ODS és Sephadex LH-20 oszlopkromatográfiája 11 vegyületet eredményezett, például kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenont. M(5), szanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) és norartocarpanon (11) [6, 19, 20]. Az M.albából izolált 11 vegyület kémiai szerkezetét az 1. ábra szemlélteti. E vegyületek citotoxikus hatásának meghatározásához egy 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il){{ 26}}.5-difeniltetrazólium-bromid (MTT) vizsgálatot végeztünk, a BV2 és RAW264.7 sejteket a jelzett koncentrációjú vegyületekkel kezeltük 48 órán keresztül, 80 μM koncentrációig. (2. ábra). A 2., 3. és 4. vegyület 80 μM, az 5. vegyület 40 μM koncentrációnál mutatott toxikus hatást. A toxicitás értékelésének eredménye alapján egy nem toxikus koncentráció-tartományt választottak ki a gyulladáscsökkentő hatások további vizsgálataihoz (2., 3.4. vegyület 40 uM-nál, 5. vegyület 200 μM-nál és egyéb vegyületek 80 μM-nál). .

2.2. A M. alba-ból izolált l1 vegyületek hatása a gyulladásos faktorok és az iNOS fehérje expressziójára BV2 és RAW264.7 sejtekben

A NO egy szabad gyök a szív- és érrendszeri, idegrendszeri ésimmunrendszerek. Fenntartja az intracelluláris homeosztázist, szállítja a neurotranszmittereket, szabályozza a gyulladásgátló aktivitást és a citotoxicitást. Ha azonban nagy mennyiségű NO termelődik, az káros hatással van a szervezetre, beleértve az értágulatot, a citotoxicitást és a szövetkárosodást [21,22]. Ezután megvizsgáltuk ezeknek a vegyületeknek a nitrittermelésre gyakorolt ​​hatását LPS-indukált BV2 és RAW264.7 sejtekben. A sejteket különböző koncentrációjú vegyületekkel kezeltük 2 órán át, mielőtt 24 órán át LPS-sel (1 ug/ml) stimuláltuk. A vegyületek közül csak a 3-as (kuwanonT) és a 4-es (sanggenon A) vegyület gátolta szignifikánsan a nitrittermelést mind a BV2, mind a RAW264.7 sejtvonalban (3. ábra). Emellett további kísérletet is végeztünk a nitrittermelés gátló hatásának összehasonlítására az LPS-sel kezelt csoport között a vegyület előkezelést követően és a vegyülettel kezelt csoportban az LPS előkezelést követően. Ennek eredményeként nem volt különbség a nitrittermelés gátló hatásában a két kísérleti csoport között (S1 kiegészítő ábra). Ezért ebben a vizsgálatban a következő kísérleteket végeztük a vegyületekkel végzett előkezeléssel az LPS kezelése előtt 2-3 órán belül.

Az NO termelését fokozza a gyulladást elősegítő fehérjék, az indukálható nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS). Az iNOS túlzott expressziója azonban súlyosan rontja a betegség patofiziológiáját [23]. A 3. és 4. számú vegyületek koncentrációfüggő módon gátolták az iNOS expresszióját (4. ábra). Megvizsgáltuk a 3. és 4. vegyület hatását a gyulladásos faktorok LPS által kiváltott expressziójára BV2 és RAW264.7 sejtekben. A sejteket a 3. és 4. vegyület különböző koncentrációival kezeltük 2 órán át, majd 24 órán át LPS-sel (1 ug/ml) stimuláltuk. Mindkét vegyület szignifikánsan gátolta a PGE2, TNF és IL-6 LPS által kiváltott expresszióját BV2 és RAW264.7 sejtekben (5. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a 3. és 4. vegyülettel végzett előkezelés elnyomta az LPS által kiváltott gyulladást a BV2 és RAW264.7 sejtekben.

2.3. A 3. és 4. vegyület hatása az NF-xB transzlokációra BV2 és RAW264.7 sejtekben

Az NF-kB egy transzkripciós faktor, amely szabályozza az iNOS expresszióját [24]. A normál NF-kB inaktív formában marad azáltal, hogy komplexeket képez a szabályozó fehérjékkel, például az IKB-val. Ha azonban LPS aktiválja, az IkBa foszforilációval lebomlik, és az NF-kB (például p65) a sejtmagba transzlokálódik [25], ami elősegíti a gyulladásos mediátor gént és indukálja a gyulladásos faktorok expresszióját [26]. A 3-as és 4-es vegyületek LPS-aktivált BV2 és RAW264.7 sejtekben a proinflammatorikus faktorok termelésére gyakorolt ​​gátló hatásának további vizsgálatára a p65 expressziós nukleáris transzlokációját vizsgáltuk a 3. és 4. vegyülettel, LPS-sel, ill. mindkettő anti-p65 FITC-jelölt antitesttel. DAPI-t használtak a nukleáris festéshez. A kontroll csoportban a p65 expressziót detektáltuk a citoszolban. Az LPS-indukált sejtekben azonban a p65 felhalmozódást észlelték a sejtmagban, amint azt a DAPI és a p65 festés egyesített képei mutatják. Ezenkívül az LPS-indukált sejtekhez képest a 3-as és 4-es vegyületek jelentősen csökkentették az NF-KB (p65)DNS-kötő aktivitás LPS-közvetítette növekedését (6A. és B. ábra) és a nukleáris transzlokációt (6C-F. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 3-as és 4-es vegyületek az LPS-stimulált NF-kB nukleáris transzlokáció negatív szabályozói.

2.4. A 3. és 4. vegyület hatása a Nrf2/HO-1 útvonalra BV2-ben és RAW264.7-ben

A Cells Heme-oxigenáz-1(HO-1) az E2-nukleáris faktorhoz kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2) célpontja, a Nrf2/HO-1 útvonal egy erős antioxidáns jelátviteli rendszer a szabad vas elősegítésére a szén-monoxidban (CO), a biliverdinben és a hemben [27]. A szén-monoxid, a hem katabolizmus gázhalmazállapotú metabolitja szabályozó hatást fejt ki az értágító és a proinflammatorikus reakciókra [28]. Emellett a HO-1 fontos szerepet játszik a sejtek gyulladással és oxidatív stresszel szembeni védelmében, valamint az aktivált makrofágok nitrittermelésének szabályozásában [29]. Western-blot vizsgálatot végeztünk annak vizsgálatára, hogy a 3. és 4. vegyület növeli-e a HO-1 expressziós szintjét, ahol a jól ismert HO-1 induktor kobalt protoporfirint (CoPP) használták pozitív kontrollként, növelve a HO{{ 16}} fehérje expresszióját. [30]. Az eredmények azt mutatták, hogy a 3. és 4. vegyület a HO-1 expresszióját is felfelé szabályozza (7. ábra). Tovább vizsgáltuk, hogy a 3. és 4. vegyület szabályozza-e az Nrf2 aktiválását. A Nrf2 transzlokációja a sejtmagba időfüggő módon megnövekedett, ami azt jelzi, hogy a 3-as és 4-es vegyület szignifikánsan megnövelte a Nrf2/HO-1 útvonalat a BV2 és RAW264.7 sejtekben (8. ábra).

Annak további vizsgálatára, hogy a 3. és 4. vegyület neurogyulladás- és gyulladáscsökkentő hatása összefüggésben áll-e a HO-1 expressziójával a BV2 és RAW264.7 sejtekben, kísérleteket végeztünk ón protoporfirin-IX-szel (SNPP). amely a HO-1 szelektív aktivitásgátlója. SNPP segítségével, amely képes csökkenteni a HO-1 expresszióját, megpróbáltuk meghatározni, hogy a HO-1 közvetíti-e a fenti vegyületek gátló hatását az LPS 【31】 által kiváltott gyulladásos válaszra. Miután a sejteket 20 μM 3. és 4. vegyülettel 2 órán át 50 uM SNPP-vel vagy anélkül kezeltük, 24 órán át LPS-sel kezeltük. Bár a 3. és 4. vegyület csökkentette a nitrittermelést az LPS-indukált BV2 és RAW264.7 sejtekben, gyulladásgátló hatásukat az SNPP-kezelés megfordította (9. ábra). Az SNPP önmagában nem befolyásolta a nitrogén-monoxid (NO) termelődését az LPS stimulációt követően, ami arra utal, hogy a 3. és 4. vegyületek gyulladáscsökkentő hatásait a HO-1 expressziója szabályozza.

3. Megbeszélés

A jelen tanulmány kimutatta, hogy a Kuwana T és a sanggenon A elnyomja az LPS által kiváltott gyulladást a BV2 és RAW264.7 sejtekben. Ezek a vegyületek gátolták az LPS által kiváltott NO, PGE2 és pro-inflammatorikus citokinek, köztük az IL-6 és TNF- termelődését, valamint az iNOS és COX-2 expresszióját mind a BV2, mind a RAW264.7 sejtekben. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a Kuwana T és a sanggenon A az NF-kB jelátviteli útvonal inaktiválásával fejtette ki gyulladásgátló hatását. Ezenkívül ezek a vegyületek a Nrf2 aktiválásával indukálták a HO-1 expresszióját. Ezenkívül ezek a vegyületek a Nrf2 aktiválásával indukálták a HO-1 expresszióját, és ez a hatás is bebizonyosodott, hogy a a gyulladásgátló aktivitást.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), és tromboxán A2(TXA,)[361. Gyulladásos állapotok esetén az iNOS és a COX-2 szintje megemelkedik, ami a NO, illetve a PGE2 túltermelését eredményezi, és a gyulladásos betegségek súlyosbodásához vezet [37]. Ebben a tanulmányban először 11, M. alba-ból izolált vegyületet értékeltünk annak meghatározására, hogy az NO-termelés gátolt-e az LPS-stimulált BV2 és RAW264.7 sejtekben. Eredményeink azt mutatták, hogy a kuwanon T és a sanggenon A fejtette ki a legerősebb gátló hatást mind a BV2, mind a RAW264.7 sejtekben (3. ábra). Korábbi vizsgálatunkban a moracin M gyulladáscsökkentő hatással volt az alveoláris makrofágokra, eredményeink azonban eltérőt mutattak. minta. Mivel azonban minden sejt más-más tulajdonságokkal rendelkezik, eltérő aktivitások jelenhetnek meg még ugyanazon mechanizmus mellett is J38]. Ezért, akárcsak a jelen tanulmány eredményei, megerősítették, hogy a moracin M nem mutatott gyulladásgátló hatást a BV2 és RAW264.7 sejtekben a kezelési koncentrációig. Ezért a kuwanon T-t és a sanggenon A-t választottuk ki további kísérletekhez.

A citokinek összetett szabályozó hatást gyakorolnak a gyulladásos és immunválaszokra [39]. A makrofágok és mikroglia sejtek aktiválása fokozza a gyulladást elősegítő J40 citokinek szekrécióját, és ez a fokozott szekréció további citokinfelszabaduláshoz vezet [41]. Az IL-6 az egyik fő citokin, és a gyulladásért, az immunválaszért és a vérképzésért felelős oldható mediátor [42]. Az IL-6 jelátvitelt két különböző mechanizmus szabályozza, beleértve a membránhoz kötött IL-6 receptorhoz (mblL6R) való kötődést és az oldható IL-6 receptor (sIL6R) felismerését[43]. Mindkét mechanizmus a glikoprotein (GP)130 aktiválásával függ össze, ami a downstream jelátviteli molekulák aktiválódását eredményezi, beleértve a Janus kináz (IAK)/jelátalakítót és a transzkripciós (STAT) kinázok aktivátorát, a foszfoinozitid 3- kinázt (PI3K) ) és a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK)[44]. Az IL-6 rákos, fertőzéses, autoimmun betegségben, hasnyálmirigy-betegségben és szív- és érrendszeri betegségben szenvedő betegek gyulladásos szintjének előrejelzésére és értékelésére szolgál.

A TNF-, egy másik fontos citokin, számos immun- és gyulladásos folyamatban is fontos szerepet játszik, mint például az immunsejtek proliferációjában, apoptózisában, nekrózisában és túlélésében. A TNF- biológiai hatásait két különböző receptorhoz, a tumor nekrózis faktor receptorhoz (TNFR)1 és TNFR2-hez való kötődés szabályozza. A TNFR1 a TNF-aktivitás fő közvetítője a legtöbb sejtben, mivel a TNFR2-nek kisebb a kötődési affinitása a TNF-hez, így a TNF könnyebben disszociál a TNFR2-től, mint a TNFR1-től. A TNF-jelátvitel rendellenességei és a TNF-túltermelés számos betegség kialakulásához vezet, beleértve a rheumatoid arthritist, a pikkelysömört, a Crohn-betegséget, az érelmeszesedést, a szepszist, a cukorbetegséget és az elhízást [45,46. Ezért fontos a gyulladást elősegítő citokinek termelésének gátlása a gyulladásos reakciók és a gyulladásos betegségek kialakulásának visszaszorítása és megelőzése érdekében. Jelen tanulmányban a kuwanon T és a sanggenon A gátolta az LPS által kiváltott IL-6 és TNF-termelést mind a BV2, mind a RAW264.7 sejtekben.

Az NF-KB a legelterjedtebb transzkripciós faktor[47], és az NF-kB jelátvitel fontos szerepet játszik a gyulladásos válaszokkal kapcsolatos gének expressziójában, beleértve az iNOS-t, COX-ot{3}} és gyulladást elősegítő citokineket kódoló gének expressziójában. 48]. Inaktivált állapotban az NF-kB alegységek a citoplazmában találhatók annak inhibitorfehérjéhez, a kappa B (kB)- inhibitorhoz kötve. Számos inger, köztük az LPS és a citokinek, indukálják az IkB- foszforilációját és lebomlását, lehetővé téve az NF-kB alegységek felszabadulását és transzlokációját a sejtmagba. A transzlokált alegységek a célgének kB-helyeihez kötődnek a DNS-ben, ami a gyulladást elősegítő mediátorokat kódoló gének transzkripciójának indukálását eredményezi [49]. Ezért az NF-kB útvonal inaktiválása a gyulladásos betegségek terápiás célpontja lehet. Jelen tanulmányban a kuwanon T-vel és a sanggenon A-val végzett előkezelés gátolta az NF-kB jelátvitel LPS-indukálta aktiválását azáltal, hogy gátolta az NF-kB alegységek DNS-kötő aktivitását és nukleáris transzlokációját (6. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kuwanon T és a sanggenon A gyulladáscsökkentő hatása az NF-kB jelátviteli útvonal szabályozásán keresztül fejtik ki.

Normál körülmények között az Nrf2 a citoplazmában a Kelch-szerű ECH-asszociált protein 1-hez (Keap1) kötődik. Azonban disszociál a Keapl-ről, áthelyeződik a sejtmagba, és a DNS-en lévő antioxidáns válaszelem (ARE) helyekhez kötődik, ami különböző antioxidáns gének expressziójához vezet, beleértve a HO-1, NAD(P)H-t kódoló géneket. : kinon-oxidoreduktáz 1 (NQO1), peroxiredoxin (Prx) és tioredoxin (Trx)[50]. Konkrétan a HO-1-ról ismert, hogy gyulladáscsökkentő hatással jár, és aktivitását a CO szintje mutatja, amely a HO{{12 enzimatikus aktivitása által a hemből származó három melléktermék egyike. }} [51]. Jelen tanulmányban azt találtuk, hogy a kuwanon T és a sanggenon A HO-1 expressziót váltott ki a Nrf2 aktiválásával (7. és 8. ábra). Ezen kívül igazoltuk a korrelációt a kuwanon T és a sanggenon A gyulladáscsökkentő hatása, valamint a HO-1 expressziója között az SNPP, a HO-1 aktivitás szelektív inhibitora segítségével. A kuwanon T és a sanggenon A NO- és TNF-termelésre és NF-kB aktivációra gyakorolt ​​gátló hatásai részben megfordultak az SNPP-vel történő együttes kezeléssel (9. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kuwanon T és a sanggenon A gyulladáscsökkentő hatását a HO-1 expressziója szabályozza.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Anyagok

A Roswell Park Memorial Institute 1640-et (RPMI 1640) és a magzati szarvasmarha-szérumot a Gibco BRL Co.-tól (Grand Island, NY, USA) vásároltuk. Minden vegyszert a Sigma-Aldrich Chemical Co.-tól (St. Louis, MO, USA) szereztünk be. Az anti-iNOS, anti- -aktin, anti-p65 és anti-HO-1 elsődleges antitesteket a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, CA, USA) vásároltuk; valamint a nyúl és egér elleni másodlagos antitestek a Millipore-tól

(Billerica, MA, USA). A PGE, IL-6 és TNF-hez enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) készleteket az R&DSystems Inc.-től (Minneapolis, MN, USA) vásároltuk. A Morus albából származó 11 vegyület izolálását és szerkezeti meghatározását máshol leírták [19-21].

4.2. Sejtkultúra és életképességi vizsgálatok

A BV2 és RAW264.7 sejteket 1% antibiotikummal (penicillin-sztreptomicin) és 10% hővel inaktivált FBS-sel kiegészített RPMI 1640-ben 5x105 sejt/ml sűrűségben oltottuk be. A sejteket 37 °C-on tenyésztettük párásított 5% CO-ban, 95% levegő atmoszférában, egy korábban leírt módszer szerint [52].

4.3. NO termelés mérése

A NO oxidáció stabil végterméke, a nitrit termelődését a sejtek NO-termelésének indikátoraként mérték. Röviden, a kondicionált közegben a nitrit koncentrációját Griess-reakción alapuló módszerrel határoztuk meg [53]. A vizsgálat részleteit korábban már leírtuk [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

A PGEz koncentrációját minden mintában a kereskedelemben kapható ELISA kittel mértük, egy korábban leírt módszer szerint [55].

4.5. IL-6 és TNF-a szintek mérése

A táptalajt összegyűjtöttük, hogy meghatározzuk az IL{0}} és a TNF-szintet egy kereskedelmi forgalomban kapható kit (BioLegend, San Diego, CA, USA) segítségével. A vizsgálatot a gyártó utasításai szerint végeztük. Röviden, a BV2 és RAW264.7 sejteket 24-lyukú tenyésztőlemezekre oltottuk 20×10 sejt/lyuk sűrűséggel. Az inkubálás után a felülúszót összegyűjtöttük, és ELISA kitekkel mértük az IL-6 és a TNF-koncentrációt.

4.6. Western Blot analízis

A pelletált BV2 és RAW264.7 sejteket PBS-sel mostuk és RIPA pufferben lizáltuk. A fehérjék egyenlő mennyiségét a Bio-Rad Laboratories-tól (#5000006; Hercules, CA, USA) beszerzett fehérjevizsgálati festékreagens koncentrátum segítségével határoztuk meg, a mintatöltő pufferbe kevertük, és SDS-PAGE-val elválasztottuk. Az elválasztott fehérjéket ezután nitrocellulóz membránra vittük át. A membránhoz való nem specifikus kötődést lefölözött tej oldatában történő inkubálással blokkoltuk. A membránt primer antitestekkel (melyeket 1:1000 arányban használtak) 4 fokon egy éjszakán át inkubáltuk, majd egy torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel reagáltattuk (mindegyik 1:5000 arányban került felhasználásra) (Millipore). 31].

4.7. NF-xB lokalizáció és immunfluoreszcencia analízis

Az NF-kB lokalizációjának tanulmányozására BV2 és RAW264.7 sejteket Lab-Tek II kamra tárgylemezeken tenyésztettünk, és különböző koncentrációjú vegyületekkel kezeltük 2 órával az LPS stimuláció előtt (0,5 ug/ml) 1 órára. h. A sejteket ezután formalinban fixáltuk, hideg acetonnal permeabilizáltuk, és anti-p65 antitestekkel (1:200) vizsgáltuk, majd fluoreszcein-izotiocianáttal jelölt másodlagos antitesttel (1:1000) inkubáltuk (Alexa Fluor 488, Invitrogen). A sejtmagok megjelenítéséhez a sejteket 1 ug/ml 4'6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) kezeltük 30 percig, mostuk PBS-sel 5 percig, és 50 μl VectaShielddel (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A megfestett sejteket láthatóvá tettük, és a képeket Zeiss fluoreszcens mikroszkóppal (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokió, Japán) készítettük. [31].

4.8. Statisztikai analízis

Az adatokat három független kísérlet átlaga ± standard deviációjaként adjuk meg. Egyirányú varianciaanalízist, majd Tukey többszörös összehasonlító tesztjét alkalmaztuk a három csoport közötti különbségek összehasonlítására. A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism szoftverrel (5.01-es verzió, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) végeztük.

5. Következtetések

A Kuwanon T és a sanggenon A gyulladáscsökkentő hatást fejtett ki az LPS-indukált BV2 és RAW264.7 sejtekben azáltal, hogy gátolta a NO, PGE2, IL-6 és TNF-termelést, valamint az iNOS és COX{{8} expresszióját. }. Eredményeink azt mutatták, hogy ezeket a gátló hatásokat az NF-KB útvonal inaktiválása közvetíti a kuwanon T-vel és a sanggenon A-val végzett kezeléssel. Ezenkívül ezek a vegyületek a HO-1 expresszióját indukálták azáltal, hogy aktiválták a Nrf2 transzlokációját a sejtmagba . Eredményeink azt mutatták, hogy a kuwanon T és a sanggenon A által kiváltott HO-1 expresszió összefüggésben volt az LPS által kiváltott gyulladás elleni szuppresszív hatásokkal. Összességében eredményeink bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a Kuwana T és a M. Albu-ból izolált sanggenon A jelöltek lehetnek az ideggyulladásos betegségek, például az Alzheimer-kór és a Parkinson-kór terápiás és megelőző szerek kifejlesztésére.