Az APOL1 hiánya a normál emberi vesék proximális tubulusaiban és a protein APOL1 transzgénikus egérvesékben
Mar 15, 2022
további információ:ali.ma@wecistanche.com
Natalya A. Áldás1, Zhenzhen Wu2, Sethu M. Madhavan3, Jonathan W. Choy4, Michelle Chen4, Myung K. Shin4, Maarten HoekID5, John R. Sedor2,6,7, John F. O'Toole2,6,Leslie A. BruggemanID2,6*
1 Rammelkamp Center for Education and Research, MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Amerikai Egyesült Államok, 2 Department of Inflammation & Immunity, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Egyesült Államok of America, 3 Department of Medicine, Ohio State University, Columbus, OH, Amerikai Egyesült Államok, 4 Merck & Company, Inc., Kenilworth, NJ, Amerikai Egyesült Államok, 5 Maze Therapeutics, SouthSan Francisco, CA, Amerikai Egyesült Államok , 6 Nephrology Department, Cleveland Clinic, Case WesternReserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Amerikai Egyesült Államok, 7 Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Amerikai Egyesült Államok.
Absztrakt
Az APOL1 polimorfizmusokkal és a nem diabéteszes krónikus vesebetegség (CKD) kockázatával kapcsolatos patogenezis mechanizmusa nem teljesen ismert. A korábbi tanulmányok minimálisra csökkentették a keringő APOL1 fehérje okozati szerepét, így a megértésre tett erőfeszítésekvesepatogenezise a vesesejtekben expresszált APOL1-re összpontosított. AveseA sejtek APOL1-et expresszálnak, aproximális tubulusAz expressziós minták nem következetesek a közzétett jelentésekben, és hogy az APOL1 szintetizálódik-e aproximális tubulusvagy esetleg a vérben lévő APOL1 fehérjét kiszűrik és a proximális tubulus újra felszívja, továbbra is tisztázatlan. Mind fehérje, mind mRNS in situ módszerekkel megvizsgáltuk az APOL1 vese expressziós mintázatát normál humán és APOL1 bakteriális mesterséges kromoszóma transzgenikus egerekben, proteinuriával és anélkül. Az APOL1 fehérjét és mRNS-t a podocitákban és az endothel sejtekben mutatták ki, de a tubuláris epitéliumban nem. A proteinuria hátterében úgy tűnt, hogy a plazma APOL1 fehérjét nem szűri vagy szívja fel aproximális tubulus. A korábbi vizsgálatokban használt kereskedelmi antitestek egymás melletti vizsgálata azt sugallja, hogy a proximális tubulusokban az APOL1 eredeti jelentései valószínűleg az antitest nem specifikusságát tükrözik. Mint ilyen, az APOL1 expressziója a podocitákban és az endotéliumban maradjon az APOL{5}}közvetített mechanikai vizsgálatok középpontjában.vesebetegségek.
Bevezetés
Az APOL1 gén polimorfizmusai jelentős kockázatot jelentenek a nem diabéteszes krónikus betegségek számos formájáhozvesebetegség (CKD) [1–3]. Ez a kockázat az APOL1-variáns allélek recesszív öröklődésének és a környezeti stresszhatásnak való kitettség kombinációjából adódik. Az APOL1 variánsok patogén funkciója és a CKD-t okozó környezeti stresszorral való kölcsönhatása nem teljesen ismert. Bár az APOL1 konstitutívan jelen van a keringésben, a korábbi tanulmányok minimálisra csökkentették a keringő APOL1 fehérje okozati szerepét [4–7], és igyekeztek megérteni.veseA patogenezis a vesesejtekben expresszálódó APOL1-re összpontosított. Az APOL1 vese expressziós mintázata továbbra is tisztázatlan, az immunhisztokémia és az mRNS in situ hibridizációs eredményei között publikáltak eltéréseket, különösen a proximális tubulus epitéliumában megfigyelt bőséges APOL1 fehérjét [8–10]. Mivel az APOL1 bőséges vér, nem világos, hogy az APOL1 szűrve van-e, különösen proteinuria esetén, amely az APOL1 fehérje újraabszorpcióját eredményezhetiproximális tubulus. Az APOL1 megjelenése a proximális tubulusban, akár génexpresszió, akár a szűrletből való reabszorpció révén, azt jelzi, hogy aproximális tubulusaz APOL{0}}kapcsolódó CKD patogenezisében.
A keringésben lévő APOL1 egy 500 kDa-os HDL3-részecskéhez, az úgynevezett tripanolitikus 1-es faktorhoz, egy 1000 kDa lipidszegény IgM-komplexhez, más néven tripanolitikus 2-es faktorhoz kötődik, és esetleg más, a komplementhez kapcsolódó lipidszegény, nagy molekulatömegű komplexekhez. tényezők [7, 11–13]. A két CKD-asszociált APOL1 variáns allél, a G1 és a G2 által termelt fehérjék a közös G0 allélhoz hasonlóan megkötik a nagy molekulatömegű tripanolitikus faktorokat [14]. Bár az APOL1 fehérje (42,5 kDa) elég kicsi ahhoz, hogy átlépje a glomeruláris filtrációs gát méretkorlátozását, nem ismert, hogy ezektől a nagy molekulatömegű komplexektől függetlenül keringne [15]. A lipoproteinek és a HDL-ek egyéb komponensei azonban kiszűrhetők [16], és proteinuria esetén nagyobb molekulatömegű fehérjék, amelyeket általában a filtrációs gát korlátoz, beszivároghatnak. Nem világos, hogy az APOL1 vagy APOL{22}}tartalmú komplexek kiszűrhetők-e proteinuria esetén.
E problémák megoldása érdekében megvizsgáltuk az APOL1 gén és a fehérje expresszióját emberbenveseszövetek és vesék humanizált transzgenikus egérmodellekből, amelyek újrateremtik a natív humán APOL1 expressziót. Ezekhez a vizsgálatokhoz validáltuk a kereskedelmi forgalomban lévő anti-APOL1 antitesteket a specificitás szempontjából, amelyek hozzájárulhattak a vese expressziós mintázatainak korábbi eltéréseihez. Emellett APOL1 transzgénikus egérmodelleket is készítettekproteinurikuskeresztezve a HIV-vel összefüggő nephropathia (HIVAN) modelljével, amely egy olyan CKD, amely erősen kapcsolódik az APOL1 kockázati allélok hordozásához, annak meghatározására, hogy a proteinuria megváltoztatja-e az APOL1 fehérje megjelenését a tubuláris epitéliumban.
Kattintson az organikus lehetőséghezCisztanche krónikus vesebetegség esetén
Anyagok és metódusok
Emberi szövet- és egérmodellek
Formalinnal fixált, paraffinba ágyazott embervese(n {0}}) és máj (n=3) szövetet a rákreszekció normál széleiről a Cleveland Clinic Lerner ResearchInstitute Biorepository-tól szereztük be. Korábban már leírtak három transzgenikus egérvonalat, amelyek egy 47 kb-os humán genomi fragmentumot expresszálnak egy mesterséges bakteriális kromoszómában (BAC), amelyek magukban foglalják a humán APOL1 gén promóterét és kódoló régióit minden G0, G1 vagy G2 allél esetében [17, 18]. A BAC-APOL1 transzgenikus vonalak mindegyike 10 generáción át kereszteződött FVB/Nj-re, amely egy HIVAN-ra fogékony genetikai háttér. A proteinuria indukálására használt egér HIVAN-modell a Tg26 HIVAN4 kongenikus [19] volt, amely proteinuriát és progresszív fokális szegmentális glomerulosclerosis-t fejleszt ki szülői Tg26 modellként (JacksonLaboratory #22354), de a betegség progressziója lassabb. Minden vizsgálatban a vesebetegséget az elválasztás után hetente ellenőrizték a proteinuria (azaz a spontán kiürült vizeletben lévő fehérje mennyiségének) mérésével, vizeletvizsgálattal, diagnosztikai mérőpálcikákkal (Uristix, Siemens Healthcare). A vesebetegség IACUC által jóváhagyott humán végpontja ebben a modellben a proteinuria volt, amely elérte a 4 plusz értéket a mérőpálcán. Egyetlen állat sem érte el ezt a humánus végpontot az előre meghatározott vizsgálati végpont előtt, mivel ebben a vizsgálatban a veseműködési zavar korai szakaszára volt szükség (proteinuria a mérőpálcán 2 plusz 3 plusz)vesemég szűrésre és reabszorpcióra képes volt. Valamennyi állat megőrizte normál súlyát, tipikus ápolási és aktivitási szintet mutatott, és a vizsgálat során nem éreztek fájdalmat vagy szorongást. Az összes állatot hetente kétszer ellenőrizték olyan állatorvosok, akik nem érintettek ebben a vizsgálatban az általános egészségi állapot és jólét érdekében, és egyetlen állatnak sem volt szüksége fájdalomcsillapításra vagy egyéb támogató ellátásra. Mindegyik BAC-APOL1 transzgénikus egérvonalat keresztezték a HIVAN4 egérmodellel, és 8 éves korában leölték őket. 10 hetes korban, amikor vesebetegségük 2 plusz proteinuria-szintre haladt a vizeletmérő pálca hatására (G0 n=15, G1 n=11, G2 n=9). A végső vizelet-, vér- és szövetgyűjtést mély izoflurán érzéstelenítésben végezték, majd azonnal (még altatásban) eutanáziát végeztek nyaki diszlokációval. Az albuminuriákat 1 ul vizelet poliakrilamid gélelektroforézisével, majd Coomassies-festéssel határoztuk meg. Az emberi szövetek felhasználását a Cleveland Clinic IRB (IRB-06-050) felülvizsgálta és jóváhagyta. A tájékoztatáson alapuló beleegyezéstől eltekintettek, mert a szövetet eldobottnak tekintették, és azonosíthatatlan adatokat gyűjtöttek. Minden állatkísérletet felülvizsgáltak és jóváhagytak a Cleveland Clinic és a Case Western ReserveUniversity (IACUC-2430) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottságai.
A szövetek immunfluoreszcenciája
Formalinnal fixált, paraffinba ágyazottveseA szövetmetszeteket antigenretrieval-nak vetettük alá a korábban leírtak szerint [8]. Ebben a cikkben az APOL1 expressziójának vizsgálatára használt antitestek egy nyúl anti-humán APOL1 (Sigma, HPA018885, E105260 tétel, 1:400 hígítás). Számos tételt ebből a Sigma nyúl poliklonálisból más kereskedelmi monoklonális testek mellett értékeltek, és az eredményeket összefoglalták. az 1A 1C kiegészítő táblázatban és az S1 adatok 1. kiegészítő ábrájában. Megjegyzendő, hogy ezek közül a poliklonális antitestek közül sok már kimerült, és már nem kapható a Sigmától. Egyéb elsődleges antitestek közé tartozik a nyúl anti-egér APOA1 (ThermoFisher, 1:500 hígítás), a kecske anti-egér CD31 (R&D Systems, 1:200 hígítás), a tengerimalac anti-nefrin (USB, 1:200) és az egér anti-GLEPP1 ( Roger Wiggins ajándéka, 1:50). A jelöléshez FITC-vel jelölt Lotus tetragonolobus lektint (VectorLabs) használtak.proximális tubulusa korábban leírtak szerint [8]. A humán APOL1 elleni kereskedelmi antitestek teszteléséhez a veseszöveteket különféle módszerekkel fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk az immunhisztokémiához különféle antigénvisszanyerési módszerekkel. Az egyes feldolgozási módszerek részleteit az S1 adatok Kiegészítő részletes módszerei című részben találja.
APOL1 gén és fehérje expressziója
A plazma APOL1 fehérje koncentrációját a Meso Scale Discovery elektrokemilumineszcens immunoassay segítségével határoztuk meg, a korábban leírtak szerint [5]. A koncentrációt egy ismert folyadékkromatográfiás tömegspektrometriával kalibrált humán nagy sűrűségű lipoprotein oldathoz viszonyítva határoztuk meg. A szérum APOL1 és APOA1 fehérjeszinteket Westernblot módszerrel hasonlítottuk össze a korábban leírtak szerint [20].
mRNS in situ hibridizáció
Az APOL1 gén expresszióját egérben és emberben vizsgáltákveseés májszövet mRNS in situ hibridizációt alkalmazva. A kézi RNAScope in situ hibridizációs készletet (ACDBio) formalinban rögzített, paraffinba ágyazott szövetekhez használták, követve az egypróbás vagy kettős szondás detektálásra vonatkozó készlet utasításait. A próbák közé tartozott a humán APOL1 (katalógusszám 439871), az egér nefrin (Nphs1, katalógusszám: 433571) és az egér CD31 (Pecam1, katalógusszám: 316721). Az előkezelések 15 perces forralásból és 30-perces proteázemésztésből álltak. Az in situhibridizációs jel pontok formájában jelenik meg; tíz cellánként egy pont a várt háttér.
Eredmények
Számos kereskedelmi forgalomban lévő anti-humán APOL1 antitestet (az S1 adatok 1A kiegészítő táblázata) megvizsgáltak humán APOL1-re való specifitásra, emberből és egérből származó szövet- vagy fehérjekivonatok felhasználásával.veseés sejtek. Mivel az egerek nem rendelkeznek a humán APOL1 ortológjával, az egérsejtek és szövetek nem lehetnek immunreaktívak a humán APOL1 elleni antitestekkel szemben. A Western-blot során a legtöbb kereskedelmi forgalomban lévő monoklonális és poliklonális antitest képes volt kimutatni az APOL1-et, bár több gyengén detektált APOL1-et a nem specifikus fehérjék erősebb kimutatásával (az APOL1 molekulatömegével nem egybeeső gélsávok, az S1 adatok 1B kiegészítő táblázata). A legtöbb antitest további nem specifikus fehérjéket mutatott ki, amelyek a fehérjekivonatok forrásától függően különböztek (az S1 adatok 1B kiegészítő táblázata). Ezen nem specifikus gélsávok némelyike a fehérjekivonatok degglikozilező enzimekkel történő előkezelésével eltávolítható (nincs ábrázolva), ami arra utal, hogy az epitópfelismerés glikánoktól függ. Az immunhisztokémiai vizsgálatok során a negatív kontrollként használt vad típusú egérvesét APOL1 transzgenikus egérvesével hasonlították össze (az S1 adatok 1C kiegészítő táblázata). Sok anti-APOL1 antitest tévesen detektált fehérjéket vad típusú egérben.vese, beleértve a nagyon erős immunfestést a tubulusokban (kiegészítő 1. ábra az S1 adatokban). Ezen validációs vizsgálatok alapján kiválasztottunk egy Sigma poliklonális antitest tételt korlátozott off-target kimutatással az APOL1 expressziós mintázatainak vizsgálatára.
Az emberbenvese, az APOL1 fehérjét immunfluoreszcenciával detektáltuk glomerulusokban, de nem tubulusokban (1A. ábra). Hasonló expressziós mintázatokat figyeltek meg humán vesékben mRNS in situ hibridizációval. Az APOL1 mRNS jelen volt a glomerulusokban, a peritubuláris kapillárisokban és a vese nagyobb ereiben, de egyetlen tubulusszegmensben sem (1B. ábra). Egy korábbi, humán májátültetett betegeken végzett tanulmány megállapította, hogy a keringő APOL1 fehérjét nagyrészt a máj termeli [21]. A humán májban az APOL1 fehérje és az mRNS expressziós mintázata hasonló volt, az expressziót hepatocitákban és vaszkuláris endotéliumban detektáltuk. Egerekben az APOL1 expressziója minőségileg alacsonyabb volt az 1. és 2. zóna hepatocitáiban, mint a 3. zóna hepatocitáiban, míg emberben a hepatociták mindhárom zónában hasonlóak voltak az expressziós szinten (2. kiegészítő ábra az S1 adatokban). Az egerek májszövetei egészséges felnőttektől származtak, míg az emberi májszövetek a rákos reszekciók normális szegélyei voltak, amelyek szintén szövettani bizonyítékot mutattak a steatosisról, ami potenciálisan hozzájárult ehhez a különbséghez.
Cistanche-veseelégtelenség tünetei
A humán szövetben megfigyelt expressziós mintázatot három olyan transzgenikus egérvonalban igazolták, amelyek humán BAC-t expresszálnak, amelyek a teljes APOL1 genomiális régiót felölelik a G0, G1 vagy G2 allélek tekintetében [17, 18]. Az APOL1 fehérje bőséges volt a podocitákban, és jelen volt a glomeruláris kapillárisok endotélsejtjeiben, a peritubuláris kapillárisokban és a nagyobb erek endotéliumában is (2A. ábra). Nem volt kimutatható APOL1 fehérje aproximális tubulusvagy bármely más csőszegmens (2B. ábra). Az emberhez hasonlóan a BAC-APOL1 transzgenikus egerek is bőségesen tartalmaztak APOL1-et a vérben (3. ábra), és APOL1 fehérjét és mRNS-t expresszáltak a máj hepatocitáiban (2. kiegészítő ábra az S1 adatokban). Ban,-benvese, ez a keringő APOL1 fehérje a vaszkuláris terekben rekedt vérben is kimutatható (2B. ábra). Nem volt különbség az APOL1 expressziós mintázatában az APOL1-G0, -G1 vagy -G2 expresszáló egerek között (2B. ábra), és ez összhangban van a különböző APOL1-ben szenvedő betegek humán biopsziáján végzett korábbi tanulmányokkal. genotípusok [8, 10, 22]. Az APOL1 fehérje expressziós mintázatait mRNS in situhibridizációval is megerősítettük (4. ábra). Mindhárom APOL1 genotípust megvizsgáltuk, de az APOL1 genotípus alapján nem volt különbség. Összhangban az emberrelvese(1. ábra), az APOL1 expresszálódott inpodocitákban (a sejttípust Nphs1 ökocímkével igazolták) és vaszkuláris endothelben (a sejttípust Pecam1 ökocímkézéssel igazolták), beleértve a glomeruláris kapillárisokat, peritubuláris kapillárisokat és nagyobb ereket. APOL1 expressziót nem észleltünk a következőbenproximális tubulusokvagy bármely más cső alakú szegmens.
1. ábra: APOL1 fehérje és mRNS expressziója emberbenvese. A. APOL1 fehérje expressziója immunfluoreszcens mikroszkóppal validált anti-APOL1 antitestek felhasználásával, GLEPP1-gyel együttes immunfestéssel a podociták és a DAPI mint nukleáris folt azonosítása. B. APOL1 mRNS expresszió in situ hibridizációval. Az expresszió nyilvánvaló volt a podocitákban ("P") és a glomeruláris kapillárisok ("E"), a peritubuláris kapillárisok ("1", nyilak) és a nagyobb erek ("2") epitéliumában, de a tubuláris epitéliumban nem. Skálasáv=40μm
Cisztanche-vese
A BAC-APOL1 egerek egyikében sem alakult ki spontán proteinuria, ami összhangban van ezen egérmodellek eredeti leírásával [17, 18], de súlyos proteinuria alakult ki, amikor keresztezték a HIV-vel összefüggő nephropathia modelljével (5. ábra). Immunfluoreszcenciával nem specifikus anti-APOL1 antitest immunfestést figyeltek meg vad típusú és HIVAN egérbenvese, főleg a Bowman kapszulában (6A. ábra). A keresztezett proteinuriában szenvedő egerekben az APOL1 fehérje nyilvánvaló volt a glomerulusokban, de nem volt kimutatható APOL1 fehérje infiltrátum vagy belül.proximális tubulusok(6B. ábra). Western-blottal az APOL1 nem volt kimutatható proteinurikus egerek ürített vizeletében (az adatokat nem mutatjuk be). Nem volt különbség az APOL1 expresszió mintázatában semproteinurikusAPOL{{0}}G0, -G1 vagy -G2 expresszáló egerek. Ugyanezeket az egérveséket immunfestéssel festették meg APOA1-re, és apolipoproteint szűrtek, pozitív kontrollként az érrendszeri eloszlás ésproximális tubulusreabszorpciós minták. Az APOL1-hez hasonlóan a plazmában az APOA1 könnyen kimutatható volt a glomeruláris kapilláris lumenekben. Mivel azonban az APOA1 szűrve van, jelen volt a proximális tubulus kefe határán lévő fehérje-visszaszívású cseppekben is (6C. ábra). A proteinuria esetén az APOA1-tartalmú reabszorpciós cseppek száma és mérete nőttproximális tubuluskefeszegély. A proximális tubulusban hasonló mintázatot nem figyeltek meg az APOL1 esetében.
2. ábra: APOL1 fehérje expressziója BAC-APOL1 transzgenikus egérbenvese. A. Immunfluoreszcens festés APOL1-re, nephrinre (podociták azonosítására) és CD31-re (endothelsejtek azonosítására) a BAC-APOL1 transzgenikus egérvesében (a G1 egér látható). B. Az APOL1 expressziós mintázatainak összehasonlítása mindhárom APOL1 transzgenikus vonalban.Proximális tubulusokfluoreszcens Lotus tetragonolobus (LT) lektinnel történő jelöléssel azonosították. Az APOL1 jelen volt a vaszkuláris endotéliumban (nyílhegyek), a podocitákban (nyilak), és a vaszkuláris terekben (�) beszorult, de a tubuláris epitéliumban nem. Skála=40μm
3. ábra: APOL1 fehérje keringésben a BAC-APOL1 transzgenikus egérmodellekben. A plazma APOL1 fehérjeszintjét immunoassay-vel mérték transzgenikus egerekben, összehasonlítva az életkorban egyező vad típusú (WT) alomtársakkal (WT,n=10; G0, n=6; G1, n { {11}}; G2, n=10; minden állat hím volt, körülbelül 21 hetes). Az APOL1 expressziós szintjei mindegyik transzgenikus vonalban szignifikánsan különböztek a WT-től (P<0.0001). data="" are="" mean±sd,="" one="" measurement="" per="" animal,="" with="" significance="" determined="" by="" one-way="">
Vita
Az antitest-specifitás az egyik legjelentősebb kihívás, amely a reprodukálható kutatást befolyásolja [23]. Mi és mások eredetileg arról számoltunk be, hogy az APOL1 fehérje jelen vanproximális tubulusoknormál és beteg alanyok esetében [8, 9]. Más anti-APOL1 antitestekkel végzett folyamatos munkánk és mRNS in situ hibridizáció alkalmazása azonban azt mutatta, hogy az APOL1 nem expresszálódott proximális tubulusokban [10]. A fennmaradó lehetőség az, hogy az APOL1 proteinin vért kiszűrik és újra felszívják, ami az APOL1 fehérje megjelenését eredményeziproximaltubulusok. Az antitestekre nem támaszkodó in situ módszerekkel, valamint az újonnan elérhető humán BAC-APOL1 transzgenikus egerekkel együtt sem APOL1 fehérjét, sem APOL1 mRNS-t nem lehetett kimutatni a tubuláris epitéliumban. A proteinuria esetén az APOL1-et sem szűrtük ki. A mi kezünkben a Sigma nyúl poliklonális antitest következetesen felismeri a humán APOL1-et, de sok-sok különbséget más fehérjék felismerésével. Az itt végzett vizsgálatokban használt Sigma nyúl poliklonális tétel nem replikálja az erősetproximális tubulusaz azonos katalógusszám alatt értékesített korábbi tételekben megfigyelt festődés. Bár a monoklonális antitestek kiküszöbölnék a poliklonális ellenanyag-termelési tételekben rejlő variációt, a tesztelt kereskedelmi monoklonális antitestek jelentős nem specifikusak vagy gyenge érzékenységgel rendelkeztek APOL1-re. Egy közelmúltban készült jelentés, amely nagyszámú humán APOL1 elleni monoklonális antitest kifejlesztését és validálását írja le, szintén nem azonosította a proximális tubulusfestődést az emberben.vese[24].
Bizonyítékok elleneproximális tubulusAz APOL1 expressziója, vagy a proximális tubulus szerepe az APOL1-asszociált CKD-kben, több más csoportból is felhalmozódik. Egy hasonló, foszmidokkal létrehozott humanizált APOL1 transzgenikus egérmodellel végzett vizsgálat szintén nem talált APOL1 expressziót a proximális tubulusban sem fehérje, sem mRNS kimutatási módszerekkel [25]. Az indukálható APOL1 expresszióval rendelkező transzgenikus modellek alkalmazása, amelyek az expressziót akár podocitákra vagy tubulusokra korlátozzák, proteinuria és vesepatológia csak akkor fordul elő, ha az APOL1 podocitákban expresszálódik, a tubulusban nem [6]. Megerősítő bizonyítékként az emberi vizelet proteomját vizsgáló számos tanulmány [26–30] nem azonosította az APOL1 fehérjét a vizeletben, és azt is jelzi, hogy az APOL1 nem szűrhető ki kimutatható mennyiségben.
Vizsgálataink nem zárják ki, hogy kis mennyiségű APOL1 kerüljön a podociták primer szűrletébe akár szekréció útján, akár passzív felszabadulás útján, amikor a podocita elpusztul és lizál. A hepatociták által expresszált és szekretált APOL1-től eltérően a fő APOL1 transzkriptin podociták nem rendelkeznek teljes szignálpeptiddel [15], és nincs meggyőző bizonyíték arra, hogy a podociták szekretálják az APOL1-et. Alternatív megoldásként egyes tanulmányok azt figyelték meg, hogy az APOL1 betegség által kiváltott magas szintje ritka, alternatív splicing izoformákat is termelhet, különböző szignálpeptid szekvenciákkal, amelyek lehetővé teszik a szekréciót [24, 31–33]. Az APOL1 infiltrátum ezen lehetséges alternatív forrásai a kimutathatósági határok alatt maradtak volna az általunk és más kutatók által a vizsgálat során alkalmazott vizsgálatokban.veseszövetben és vizeletben, és valószínűtlen magyarázata lenne a korábban a proximális tubulusokban leírt, robusztus APOL1 expressziónak. Ezen túlmenően nem világos, hogy a podocita eredetű APOL1 infiltrátumnak ez a potenciálisan alacsony szintje fiziológiai jelentőséggel bír-e, figyelembe véve, hogy emberben az APOL1 expressziójának alapszintje nem kapcsolódik a CKD-hez. Vizsgálataink nem zárják ki az APOL1 expressziójának lehetséges különbségeit az emberek és a BAC-APOL1 transzgenikus egerek között. A podociták működése ésproximaltubulusokA vér szűrése és reabszorpciója alapvetően hasonló az emberek és az egerek esetében, azonban az egerek alkalmazásának elismert korlátai vannak az emberi glomeruláris vesebetegségek replikációja tekintetében [34].
4. ábra: APOL1 mRNS expresszió a BAC-APOL1 transzgenikus egérmodellekben. Duplex mRNS in situ hibridizáció (AD)APOL1 és nephrin (Nphs1) génexpresszió és (EK) APOL1 és CD31 (Pecam1) expressziója azonosított podociták orendoteliális sejtekhez. Az APOL1 expressziót peritubuláris kapillárisokban ("1" nyilak), arteriolákban ("2" nyilak), glomeruláris kapillárisokban ("3" nyilak), podocitákban ("4" nyilak) és nagyobb (interlobuláris) artériákban ("5") észlelték. és erek ("6"), de nemproximális tubulusok("PT") vagy bármely más cső alakú szegmens. A megjelenített képek BAC-APOL1-G0 és BAC-APOL1-G1 egerekből származnak.
5. ábra: A BAC-APOL1 transzgenikus egérmodellek hasonló proteinuriát fejlesztettek ki, amikor keresztezték őket a HIVANmouse modellel. A. Példa proteinuriára egyszeres és kettős transzgenikus egerekben, vizelet gélelektroforézisével értékelve (Coomassie-festés). A nyílhegy az albumint jelöli, és a további kis molekulatömegű vizeletfehérjék (csillag) abnormális eredmények egerekben. B. Egérszérum Western-blot-vizsgálata ugyanazon egy- és kettős transzgenikus egereken, amelyek a szérum APOL1 fehérje magas szintjének fenntartását mutatják proteinuria hátterében. Az APOA1 Western blot a közös szérumfehérje kontrollfórumaként, amely szabadon szűrhető. A reprezentatív blot látható; az egyes genotípus-csoportokban vizsgált állatok száma: vadtípus, n=3; HIVAN4, n=6; G0 x HIVAN4, n=6; G1 x HIVAN4, n=3; G2 x HIVAN4,n=4
Az itt bemutatott munka és más publikált tanulmányok jelentős hasonlóságokat mutattak ki az emberek [8–10, 24] és a transzgenikus egér APOL1 expressziós mintázatai között [17, 18, 24]. Ezekből a kombinált vizsgálatokból előállítható és következetes megfigyelés az APOL1 expressziója a podocitákban és a glomeruláris kapillárisok, a peritubuláris kapillárisok és a nagyobb erek endothel sejtjeiben. Ezen túlmenően a megfigyelések közvetve alátámasztják a korábbi vizsgálatokból származó következtetéseket [4, 5], miszerint a keringő APOL1 fehérje valószínűleg nem járul hozzávesebetegség patogenezisében, mivel nem ez a vese-lokalizált APOL1 forrása. A podocita és endoteliálisan expresszált APOL1 hozzájárulásának értékelése logikus fókusz a jövőbeni tanulmányokhoz, amelyek az APOL1 kockázati variánsok CKD patogeneziséhez való hozzájárulásának mechanizmusát vizsgálják.
6. ábra. Az APOL1 nem jelenik meg a proximális tubulusokbanproteinurikusBAC-APOL1 transzgenikus egerek. A. Kontroll immunfestés nem transzgenikus (vad típusú) és proteinurikus HIVAN4 egerekben az APOL1-re, valamint a fluoreszcens Lotustetragonolobus ("LT") lektin kötődése aproximális tubuluskefeszegély. Mivel a vad típusú és HIVAN4 egerekben nincs APOL1, a parietális sejtekben megfigyelt festődés (nyilak) műtermék. B. Az APOL1 immunfestése inproteinurikusAz egyes APOL1 genotípusok BAC-transzgénikus egerei (reprezentatív képek láthatók, az egyes genotípus-csoportokban vizsgált állatok száma megegyezett az 5. ábrával). A képek mutatjákproximális tubulusokaz átmenetnél Bowman kapszulával. A bekeretezett terület az egyes panelek alatt fel van nagyítva, a fekete-fehérben látható elszigetelt fluoreszcens csatornákkal együtt. C. Pozitív kontroll immunfestés szűrt lipoprotein, APOA1 és fluoreszcensen jelölt Lotus tetragonolobus ("LT") lektin esetében. Egy APOL1-G0egér és egy proteinuriás APOL1-G0 x HIVAN4 kettős transzgenikus egér látható; az egyes színpanelek alatt az LT lektin vagy az APOA1 bekeretezett régiójának egyedi fluoreszcens csatornái (fekete-fehérben) láthatók. A fehér nyilak a kapilláris lumenében keringő APOA1 fehérjét tartalmazó glomeruláris kapillárisokat jelölik, a piros nyilak pedig az APOA1-et jelölik a proximális tubulusok kefeszegélyén lévő proteinreabszorpciós cseppekben. Skálasáv=40μm.
Segítő információ
S1 adatok. Kiegészítő ábrák és táblázatok. (PDF)
S1 Nyers képek. Eredeti, vágatlan zselés képek. (PDF)
Köszönetnyilvánítás
Köszönetet mondunk William Baldwinnak és Nina Dvorinának az antitest-validálási vizsgálatokban nyújtott segítségükért
Szerzői hozzájárulások
Koncepció: Sethu M. Madhavan, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, JohnF. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Az adatok gondozása: Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin, Leslie A. Bruggeman. Formai elemzés: Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin ,Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Finanszírozás megszerzése: John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Vizsgálat: Natalya A. Blessing, Zhenzhen Wu , Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Leslie A. Bruggeman. Módszertan: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, LeslieA. Bruggeman.Projekt adminisztráció: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Források: Myung K. Shin. Felügyelet: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Érvényesítés: Myung K. Shin. Írás – eredeti vázlat: Natalya A. Blessing, Leslie A. Bruggeman. Írás – áttekintés és szerkesztés: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, MichelleChen, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman.
Hivatkozások
1. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI és mások. A tripán litikus ApoL1 variánsok asszociációja avesebetegség az afroamerikaiaknál. Tudomány. 2010; 329(5993):841–5.https://doi.org/10.1126/science.1193032 PMID: 20647424
2. Genovese G, Tonna SJ, Knob AU, Appel GB, Katz A, Bernhardy AJ és mások. Az afro-amerikaiak fokális szegmentális glomerulosclerosisának kockázati allélja az APOL1-et és a MYH9-et tartalmazó régióban található. Kidney Int. 2010; 78(7):698–704. https://doi.org/10.1038/ki.2010.251 PMID: 20668430
3. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A et al. Az APOL1 génben előforduló missense mutációk nagymértékben összefüggenek a korábban a MYH9 génnek tulajdonított végstádiumú vesebetegség kockázatával. Hum Genet. 2010; 128(3):345–50. https://doi.org/10.1007/s00439-010-0861-0 PMID:20635188
4. Bruggeman LA, O'Toole JF, Ross MD, Madhavan SM, Smurzynski M, Wu K és társai. A plazma apolipoprotein L1 szintje nem korrelál a CKD-vel. J. Am. Soc. Nephrol. 2014; 25(3):634–44. https://doi.org/10.1681/ASN.2013070700 PMID: 24231663
5. Kozlitina J, Zhou H, Brown PN, Rohm RJ, Pan Y, Ayanoglu G és munkatársai. Az APOL1 kockázati változat plazmaszintjei nem társulnak vesebetegséghez egy populációalapú kohorszban. J. Am. Soc. Nephrol.2016; 27(10):3204–19. https://doi.org/10.1681/ASN.2015101121 PMID: 27005919
6. Beckerman P, Bi-Karchin J, Park AS, Qiu C, Dummer PD, Soomro I és társai. A humán APOL1 kockázati variánsok transzgénikus expressziója podocitákban indukáljavesebetegség egerekben. Nat. Med. 2017; 23(4):429–38. https://doi.org/10.1038/nm.4287 PMID: 28218918
7. Weckerle A, Snipes JA, Cheng D, Gebre AK, Reisz JA, Mura M, et al. A keringő APOL1 fehérje komplexek jellemzése afroamerikaiakban. J Lipid Res. 2016; 57. (1):120–30. https://doi.org/10.1194/jlr.M063453 PMID: 26586272
8. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Ganesan S, Bruggeman LA, Sedor JR. APOL1 lokalizáció normál vese- és nem cukorbeteg vesebetegségben. J. Am. Soc. Nephrol. 2011; 22(11):2119–28.https://doi.org/10.1681/ASN.2011010069 PMID: 21997392
9. Ma L, Shelness GS, Snipes JA, Mura M, Antinozzi PA, Cheng D, et al. Az APOL1 fehérje és mRNS lokalizációja emberbenvese: nem beteg szövet, elsődleges sejtek és halhatatlanná vált sejtvonalak. J. Am. Soc. Nephrol. 2015; 26(2):339–48. https://doi.org/10.1681/ASN.2013091017 PMID: 25012173
10. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Barisoni L, Thomas DB, Ganesan S és mások. Az APOL1 variánsok megváltoztatják a C-terminális konformációs dinamikát és a SNARE VAMP8 fehérjéhez való kötődést. JCI Insight.2017; 2(14):e92581. https://doi.org/10.1172/jci.insight.92581 PMID: 28724794
11. Raper J, Fung R, Ghiso J, Nussenzweig V, Tomlinson S. Characterization of a novel trypanosome lyticfactor from human serum. Fertőzés Immunitás. 1999; 67(4):1910–6. https://doi.org/10.1128/IAI.67.4.{10}}.1999 PMID: 10085035
12. Smith AB, Esko JD, Hajduk SL. A tripanoszómák elpusztítása a humán haptoglobinhoz kapcsolódó fehérje által. Tudomány. 1995; 268(5208):284–6. https://doi.org/10.1126/science.7716520 PMID: 7716520
13. Vanhamme L, Paturiaux-Hanocq F, Poelvoorde P, Nolan DP, Lins L, Van Den Abbeele J és társai. Az apolipoprotein LI a humán szérum tripanoszóma lítikus faktora. Természet. 2003; 422(6927):83–7. https://doi.org/10.1038/nature01461 PMID: 12621437
14. Gutierrez OM, Judd SE, Irvin MR, Zhi D, Limdi N, Palmer ND és mások. Az APOL1 nefropátia kockázati változatai az afro-amerikaiak megváltozott nagy sűrűségű lipoprotein profiljához kapcsolódnak. Nephrol Dialízis Transzplantáció. 2016; 31. (4):602–8. https://doi.org/10.1093/ndt/gfv229 PMID: 26152403
15. Duchateau PN, Pullinger CR, Cho MH, Eng C, Kane JP. Apolipoprotein L géncsalád: szövetspecifikus expresszió, splicing, promoter régiók; új gén felfedezése. J Lipid Res. 2001; 42(4):620–30.PMID: 11290834
16. Yang H, Fogo AB, Kon V. Vesék: a nagy sűrűségű lipoprotein szintjének és funkciójának kulcsfontosságú modulátorai. CurrOpin Nephrol Hypertens. 2016; 25. (3):174–9. https://doi.org/10.1097/MNH.0000000000000217 PMID:27008596
17. Okamoto K, Rausch JW, Wakashin H, Fu Y, Chung JY, Dummer PD és mások. Az APOL1 kockázati allél RNS hozzájárul a vesetoxicitáshoz az R proteinkináz aktiválásával. Comm. Biol. 2018; 1:188. https://doi.org/10.1038/s42003-018-0188-2 PMID: 30417125
18. Ryu JH, Ge M, Mescher S, Rosenberg AZ, Descente M, Roshanravan H, et al. Az APOL1 vese kockázati változatai elősegítik a koleszterin felhalmozódását az APOL1 transzgenikus egerek szöveteiben és tenyésztett makrofágjaiban. PLoS One. 2019; 14(4):e0211559. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211559 PMID:30998685
19. Prakash S, Papeta N, Sterken R, Zheng Z, Thomas RL, Wu Z és mások. A HIVAN4 nephropathia-érzékenységi lókusz azonosítása. J. Am. Soc. Nephrol. 2011; 22(8):1497–504. https://doi.org/10.1681/ASN.2011020209 PMID: 21784893
20. Bruggeman LA, Wu Z, Luo L, Madhavan SM, Konieczkowski M, Drawz PE és mások. Az APOL1-G0 vagy APOL1-G2 transzgenikus modellek preeclampsiát okoznak, de nemVeseBetegség. J. Am. Soc. Nephrol. 2016; 27(12):3600–10. https://doi.org/10.1681/ASN.2015111220 PMID: 27026370
21. Shukha K, Mueller JL, Chung RT, Curry MP, Friedman DJ, Pollak MR és mások. A legtöbb ApoL1-et a máj választja ki. J. Am. Soc. Nephrol. 2017; 28(4):1079–83. https://doi.org/10.1681/ASN.2016040441 PMID:27932478
22. Sampson MG, Robertson CC, Martini S, Mariani LH, Lemley KV, Gillies CE és társai. Az Integrative Genomics Új asszociációkat azonosít az APOL1 kockázati genotípusokkal a fekete NEPTUNE alanyokban. J. Am. Soc. Nephrol. 2016 március; 27(3):814–23. https://doi.org/10.1681/ASN.2014111131 PMID: 26150607
23. Bradbury A, Pluckthun A. Reprodukálhatóság: A kutatásban használt antitestek szabványosítása. Természet. 2015; 518(7537):27–9. https://doi.org/10.1038/518027a PMID: 25652980
24. Scales SJ, Gupta N, De Mazière AM, Posthuma G, Chiu CP, Pierce AA, et al. Az apolipoprotein L1-specifikus antitestek endogén APOL1-et mutatnak ki az endoplazmatikus retikulumon belül és a podociták plazmamembránján. J. Am. Soc. Nephrol. 2020; 31(9):2044–64. https://doi.org/10.1681/ASN.2019080829 PMID: 32764142
25. Aghajan M, Booten SL, Althage M, Hart CE, Ericsson A, Maxvall I, et al. Az antiszensz oligonukleotid kezelés javítja az IFN-gamma által kiváltott proteinuriát APOL1-transzgénikus egerekben. JCI Insight. 2019; 4(12).https://doi.org/10.1172/jci.insight.126124 PMID: 31217349
26. Adachi J, Kumar C, Zhang Y, Olsen JV, Mann M. Az emberi vizelet proteomja több mint 1500 fehérjét tartalmaz, beleértve a membránfehérjék nagy részét. Genome Biol. 2006; 7(9):R80. HTTPS://doi.org/10.1186/gb-2006-7-9-R80 PMID: 16948836
27. Li QR, Fan XK, Li RX, Dai J, Wu CC, Zhao SL és mások. Átfogó és nem előfrakcionált fehérjeszintű megközelítés az emberi vizeletproteomhoz: a vizelet foszforilációjának érintése. Rapid CommMass Spectrom. 2010; 24(6):823–32. https://doi.org/10.1002/rcm.4441 PMID: 20187088
28. Marimuthu A, O'Meally RN, Chaerkady R, Subbannayya Y, Nanjappa V, Kumar P és társai. Az emberi vizelet proteomjának átfogó térképe. J Proteome Res. 2011; 10(6):2734–43. https://doi.org/10.1021/pr2003038 PMID: 21500864
29. Santucci L, Candiano G, Petretto A, Bruschi M, Lavarello C, Inglese E és mások. Százaktól ezrekig: A normál emberi vizelet kiszélesítése. Adatok rövid. 2014; 1:25–8. https://doi.org/10.1016/j.dib.2014.08.006 PMID: 26217681
30. Zhao M, Li M, Yang Y, Guo Z, Sun Y, Shao C és mások. Az emberi normál vizeletproteom átfogó elemzése és megjegyzése. Tudományos Jelentések. 2017; 7(1):3024. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03226-6 PMID: 28596590
31. Cheatham AM, Davis SE, Khatua AK, Popik W. A 4. exon 5' splice helyének blokkolása morfolinooligomerrel APOL1 fehérje izoforma váltást vált ki. Tudományos Jelentések. 2018; 8(1):8739. https://doi.org/10.1038/s41598-018-27104-x PMID: 29880816
32. Khatua AK, Cheatham AM, Kruzel ED, Singhal PC, Skorecki K, Popik W. Az Exon 4-kódolt szekvencia az apolipoprotein L1 citotoxicitásának fő meghatározója. Am J Physiol Cell Physiol. 2015; 309. (1):C22–37. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00384.2014 PMID: 25924622
33. Nichols B, Jog P, Lee JH, Blackler D, Wilmot M, D'Agati V és társai. A veleszületett immunitási útvonalak szabályozzák az Apolipoprotein L1 nefropátiás gént.VeseInt. 2015; 87(2):332–42. https://doi.org/10.1038/ki.2014.270 PMID: 25100047
34. Pippin JW, Brinkkoetter PT, Cormack-Aboud FC, Durvasula RV, Hauser PV, Kowalewska J és munkatársai. Szerzett podocita betegségek indukálható rágcsálómodellei. Am J. Physiol Renal Physiol. 2009; 296(2):F213–29. https://doi.org/10.1152/ajprenal.90421.2008 PMID: 18784259
