A makrofágok kimerülése csökkenti a H-faktortól függő immunkomplex-mediált glomerulonephritis betegségpatológiáját

Kiegészítő tényezőA H (FH) a komplement alternatív útvonalának kulcsfontosságú szabályozója emberben és egérben. Korábban tanulmányaink kimutatták, hogy az FH hiánya miatt a C57BL6 egér fogékony leszkrónikus szérumbetegség(CSS) növekedésével együtt avese befimakrofágok lttrációjaa kontrollokhoz képest. Annak megértése, hogy a makrofágok fokozott toborzása (Mϕs) a vesére hajtott beflammációs és terjedő sérülést vizsgáltuk az effstb. Mϕ CSS-t használó FH knockout egerek klodronáttal történő kimerülése. Nyolc hetes FHKO egereket apoferritinnel (4 mg/egér) 5 hétig, majd vivőanyaggal (PBS) vagy klodronáttal (50 mg/kg ip, 3 alkalommal/hét az elmúlt 3 hétben) kezeltük. Az adminisztrációA klodronát csökkentette a monociták számát és az Mϕs a vesékbenáltal>80%. 

A vese működéseA BUN által értékelt, és az albumin közelebb maradt a normálishoz az M kimerülésekorϕs. A klodronát kezelés megakadályozta a citokinek, a TNF változását és IL-6, valamint a kötőszöveti növekedési faktor (CTGF), a TGF génexpressziójának növekedése -1, mátrix metalloproteináz-9 (MMP9),fibronektin, laminin és kollagén FHKO egerekben CSS-ben (P < 0:05). A klodronát kezelés viszonylagos védelmet eredményezett aimmunkomplex- (IC-) által közvetített betegségpatológia a CSS során, amint azt asignifierősen csökkentett glomeruláris patológia(GN) és az extracelluláris mátrix. Eredményeink arra utalnak, hogy a komplement aktiváció az egyik olyan mechanizmus, amely szabályozza a makrofág tájat és ezáltalfibrosis. A pontos mechanizmus még megfejtésre vár. Röviden, adataink azt mutatják, hogy Mϕs kritikus szerepet játszanak az FH-függő ICGN-ben és az M-benϕ kimerüléscsökkenti a betegség progresszióját.

KATTINTSON IDE, HOGY TERMÉSZETES SZERVES CISTANCHE KIVONATOT SZEREZZE MEG 25% ECHINAKOZIDOT ÉS 9% AKTEOZIDOT A VESEMŰKÖDÉSÉRT

1. Bemutatkozás

Krónikus vesebetegség(CKD) globális egészségügyi probléma; Ennek 10%-a immunkomplex (IC-) közvetített, és szérumbetegségben, fertőzésekben és autoimmun betegségekben fordul elő. [1]. Az USA Renal Data System éves jelentése szerintCKD-s egyének„egyértelműen nagy a halálozási kockázatuk”, az incidencia 10-szeresére nőtt három évtized alatt, amikor is az érintett betegek elvesztették élettartamuk 70%-át. Az NIDDK szerint a felnőtt lakosság körülbelül 14%-ánál diagnosztizáltak vesebetegséget, így ez a 9. vezető halálok [2]. A vese nagyon érzékeny a komplement által közvetített károsodásra, különösen autoimmun és gyulladásos körülmények között [3, 4].

A komplementrendszer részt vesz a veleszületett és adaptív immunválaszokban, és biztosítja az első védelmi vonalat a mikroorganizmusok ellen [5, 6]. Három aktiválási útvonalból áll, amelyek egyedi módon indulnak el, és több mint 30 plazma- és sejtasszociált fehérjéből állnak [7]. Az alternatív útvonal folyamatosan készenlétben van, és olyan fehérjék szabályozzák, mint a komplement H-faktor (FH). Az FH egy keringő fehérje, amelyet többnyire a máj szintetizál [8]. Az apoferritinnel kezelt FH-hiányos (fh-/-) egerekben krónikus szérumbetegség (CSS) alakul ki, ami diffúz proliferatív glomerulonephritishez (GN) vezet a kezelést követő 5 héten belül, míg az alomtárs C57BL/6 egereknél, amelyeknek elegendő a H (FH) faktora. glomeruláris gyulladás [9]. Az F4/80+ makrofág-infiltráció a vesében fordul elő, és az IC-lerakódások körül figyelhető meg az fh-/- egerekben. A komplement aktiválása anafilatoxinokat, C3a-t és C5a-t termel, amelyek részt vesznek a Mϕs gyulladás helyére történő szállításában. A C5a/C5aR1 jelátvitel gátlása csökkentette az Mϕs-t a vesében [10]. Ebben a beállításbanvese sérülésa vese beszűrődésével jár, hanem az előidézésében szerepet játszó mechanizmusokvesekárosodásismeretlenek maradnak.

1. ábra: Az FH megváltoztatja a makrofág marker géneket FH-függő ICGN-vel rendelkező egerek veséjében. Valós idejű kvantitatív PCR CD204 és CD206 esetén a vesékből izolált mRNS felhasználásával 5 hét sóoldat vagy apoferritin után. A kifejezés GAPDH-ra van normalizálva (n=6/csoport). ∗P < 0:01. A grafikonok az apoferritinnel kezelt fh-/- egerekben (n=6) a gének redős változását mutatják be, összehasonlítva a sóoldattal kezelt fh-/- egerekkel (n=6).

A hematopoietikus sejtek [11] által termelt monociták (Mo) az endotéliumon keresztül a szövetekbe vándorolnak, ahol Mϕs-vé differenciálódnak. Az olyan markerek, mint az F4/80, CD11b, CD68 és Fc receptorok képesek azonosítani az Mϕs-t. Az Mϕ-k kritikus szerepet játszanak a vesekárosodásban, a helyreállításban és a fibrózisban a vesebetegség különböző kísérleti modelljeiben [12, 13]. Nemrég tanulmányaink kimutatták, hogy az FH-függő ICGN-ben a vesekárosodás az Mϕs vese infiltrációjával jár. Ezenkívül korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a vese Mϕ infiltrációjának gátlása csökkenti az artériás nyomást, és megakadályozza a glomeruláris sérülést és a fibrózist a nephropathia különböző állatmodelljeiben [14, 15]. Tudomásunk szerint azonban az FH-függő ICGN-hez kapcsolódó vesekárosodás során az Mϕ-kiürülés hatását nem vizsgálták. Ezért a jelen tanulmány az Mϕs szerepét az FH-függő ICGN-hez kapcsolódó vesekárosodásban liposzóma klodronát segítségével vizsgálta. A klodronát (klodronsav) egy biszfoszfonát, amely nem hidrolizálható ATP-analóggá metabolizálódik [16]. Kísérleteink azt mutatják, hogy az Mϕ-k kulcsszerepet játszanak a vesefunkció elvesztésében, szabályozatlan komplementaktiváció esetén. Ezért az Mϕ-k csökkentése vagy az Mϕ-k javítási fenotípus feltételezésére utasítása csökkentheti a betegség patológiáját, és terápiásan hasznosítható.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérleti állatok.

Az fh−/− egér törzset Drs. Matthew Pickering és Marina Botto (Imperial College of London), és folyamatosan visszakeresztezték a C57BL/6 törzset laboratóriumunkban több mint 10 generáción keresztül. Az alomtárs FH-re elegendő egerek szolgáltak kontrollként (n=8/csoport) A genotipizálást PCR-alapú megközelítéssel végeztük. Az egereket 20-22 °C hőmérsékleten tartottuk 12 órás világos-12 órás sötét megvilágítási ciklusban, steril, szellőztetett ketrecekben, táplálékkal és vízzel ad lib. A Chicagói Egyetem és a Buffalo Egyetem Állatgondozási és -használati intézményi bizottsága jóváhagyott minden tanulmányt.

2.2. Krónikus szérumbetegség protokoll.

A CSS-t 6-8 hetes fH-/- vagy vad típusú egerekben 4 mg lólép-apoferritin (Calzyme Laboratories) intraperitoneális adagolásával indukáltuk adjuváns nélkül [10, 17, 18] 5 héten keresztül. Az alomtárs kontrollok egyidejűleg intraperitoneális sóoldat-injekciót kaptak

2.3. Vesefunkció értékelések.

A vér karbamid-nitrogén (BUN) koncentrációját Beckman Autoanalyzer készülékkel (Beckman Coulter, Fullerton, CA) határoztuk meg. A vizelet albuminkoncentrációját egér albumin ELISA kittel (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) mértük, és a vizelet kreatininre normalizáltuk, kolorimetriásan mérve (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) a korábban leírtak szerint [19].

2. ábra: A klodronát egyre inkább csökkenti a vese makrofágjait FH-függő ICGN-nel rendelkező egerekben. Adott az F4/80+ monociták/Mϕs áramlási citometriai profilja a 0., 2., 4. és 7. napon, reprezentatív módon. Az F4/80+ sejtek expresszióját áramlási citometriával határoztuk meg. Az adatokat FlowJo V10 szoftverrel elemeztük. Az F4/80+ cellák minden időpontban jelentősen lecsökkennek, és a 7. napon kevesebb mint 10%-ot érnek el. Minden n időpontban=6.

2.4. Szövettan.

A veséket paraffinba ágyazták és malin-fixáltuk, és négy mikrométeres metszeteket készítettek. A metszeteket Periodic Acid-Schiff-fel megfestettük, és vesepatológus (AC) vakon megvizsgálta. Minden tárgylemez esetében a proliferatív glomerulonephritist és a glomerulo-sclerosist 0-ról 4-re osztályozták a korábban leírtak szerint [20]. Az immunfluoreszcenciás mikroszkópiához a veseszövetet szárazjégben előhűtött 2-metil-butánban pillanatok alatt lefagyasztottuk. A négy mikronos kriosztát metszeteket immunfluoreszcens (IF) festéshez dolgoztuk fel. A metszeteket 4%-os paraformaldehidben fixáltuk, és Alexa{12}}konjugált anti-egér C3-mal (Cappel) és Alexa 555 egér elleni IgG-vel festettük. A festődés intenzitásának és eloszlásának 0-tól 4-ig terjedő félkvantitatív pontszámát vak módszerrel adtuk meg, a korábban leírtak szerint [19].

2.5. qRT-PCR.

A veséket összegyűjtöttük, és a teljes RNS-t TRIzol reagenssel extraháltuk a szövetekből a gyártó utasításai szerint (Invitrogen, USA). A cDNS-t SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) segítségével szintetizáltuk. A qRT-PCR-t Power SYBR Green PCR Master mix segítségével hajtottuk végre az ABI 7700 szekvenciadetektoron (Applied Biosystems). A PCR-amplifikációt 25 ul össztérfogatban végeztük, amely 12,5 ul 2x TaqMan Universal PCR Master Mix-et (Applied Biosystems), 6,25 ul nukleázmentes vizet, 5 ul cDNS-t és 1,25 ul megfelelő primert (IDT) tartalmazott. Az összes qPCR primert (1. táblázat) a Primer3 szoftverrel (Whitehead Institute for Biomedical Research) tervezték a specifitás és érzékenység biztosítása érdekében. Az mRNS szintjének számszerűsítésére normalizáltuk a célgének expresszióját gliceraldehid-3--foszfát-dehidrogenázra. A relatív mRNS expressziós szinteket a 2 − ΔΔCt módszerrel számítottuk ki, és a GAPDH expressziós szintjére normalizáltuk.

2.6. Statisztika.

Minden eredmény átlag ± SD legalább {{0}} egértől minden csoportban. A GraphPad Prism 5 két csoport összehasonlítására vagy egy párosítatlan kétoldali tesztet (normál eloszlású adatok), vagy a Mann–Whitney U tesztet (normál eloszlás nélküli adatok) használtunk a két csoport összehasonlítására.0. A statisztikai szignifikancia a következőképpen fejezhető ki: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; és ns: nem szignifikáns.

Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb cisztanche exportőre:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Vásároljon további specifikációkért:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop