Vizsgálat a kombinált baktériumok fermentációja során előállított mikrobiális enzimekről és biológiai aktivitásukról ⅲ

3. fejezet Az enzimek antioxidáns aktivitásának tanulmányozása

 

Bebizonyosodott, hogy sok emberi betegség kapcsolatban áll aAktív oxigén és szabad gyökök, mint példáulgyulladás, érelmeszesedés,öregedés, cukorbetegség, Rák, stb.Túlzott szabad gyökökA testben protein denaturációt, sejtkárosodást és halált, sőt a test kóros változásait is okozhatja. Ezért számos otthoni és külföldön végzett tanulmány a természetes antioxidáns összetevőkben gazdag ételeket keresi a szabad gyökök által okozott betegségek megelőzése és szabályozása érdekében. Manapság, a növekvő életszínvonal mellett, az emberek fokozatosan a saját testükre helyezik a figyelmüket, így egyre több egészségügyi termék alakul ki végtelen patakban. Ugyanakkor nem könnyű igazán hasznosnak lenni. Az enzimek egyfajta étel, amelyet önmaga készíthet az emberek életében. A költség nem túl magas, és sok előnye van.
A mikrobiális enzimek számos egészségügyi funkcióval rendelkeznek, mint például antibakteriális és gyulladásgátló, elősegítik az anyagcserét, javítják az immunitást, a fehérítést és az öregedésgátlást, a méregtelenítést és a rák elleni küzdelmet. Jelenleg viszonylag kevés tanulmány készül a mikrobiális enzimek antioxidáns tulajdonságairól otthon és külföldön, ezért azt tervezzük, hogy mélyreható kutatást végezzünk rájuk. Ez a cikk az alma enzimet veszi fel kutatási objektumként, és teljes fenoltartalmat, csökkentő teljesítményt, DPPH · szabad gyököket, · OH szabad gyökök, szuperoxid szabad gyököket és ABTS szabad gyökök megsemmisülési képességét használja az alma enzimek átfogó és szisztematikus vizsgálatának elvégzéséhez 3 hónapos fermentáció után. Megvizsgálták az antioxidáns hatóanyagok összetételét és tartalmát, és megértették annak antioxidáns aktivitását.

Új gyógynövények cisztánche sokkal több oxidációs képességgel, mint a baktériumok fermentációja

A Wecistanche-a Kína legnagyobb cistanche exportőre támogató szolgáltatása:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Anyagok és módszerek

3.1.1 Anyagok

(1) Kísérleti anyagok
Mossa meg a friss almát steril vízzel steril körülmények között, szárítsa meg természetesen egy steril műtőasztalban, hámozza meg, és szeletelje őket későbbi használatra. Adjunk hozzá fehér cukrot és almát egy sterilizált üvegedénybe, 1: 1 tömeg arányban. Aktiválja a kísérlethez szükséges baktériumokat, és oltja be őket az enzimbe az optimális séma szerint (ezt a műveleti lépést a kontrollcsoportban kihagyják), lezárja, és helyezze egy hűvös és száraz helyre. 3 hónapos szobahőmérséklet -fermentáció után vegyen be egy mintát a pépből álló teljes enzim folyadék előállításához, és szűrje azt. Vegye ki a felülúszót a kísérleti mintaként, és a mintát 10000 fordulat / perc sebességgel centrifugálja nagysebességű centrifugában, mielőtt meghatározná a releváns adatokat. Érdemes megjegyezni, hogy az enzimek készítésének folyamatában a felesleges szennyeződés elkerülése érdekében minden műveletünket steril körülmények között hajtjuk végre.

(2) Fő eszközök
Spektrofotométer: v -1100, Sanghaj aning tudományos műszergyár;
Állandó hőmérsékletű vízfürdő: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Egyéb műszerek megegyeznek a 2.1.3.

3.1.2 Módszerek

(1) Az összes fenoltartalom meghatározása [53]
① A standard görbe előkészítése:
Pontosan súlya {{0}}. Vegyünk 8 tiszta 1 {{1 0}} ml térfogat lombikokat, adjunk hozzá 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 és 1,4 ml gallsav -standard oldatot, a hőre hígítsuk a fehurnát, adjunk hozzá 1 ml -t a Folin reagenshez és 2 ml -hez, 20% naco -tól, mindegyikhez 20% -os naco 3 -ig, a hőre, adjunk hozzá 1 ml -t, adjunk 1 ml -t, a Folin, a Folin -reagenshez, és 2 ml -t 20% -os naco -tól, a hőre, adjunk hozzá 1 ml -t a Folin reagenshez, és 2 ml -t 20% naco -tól, a hőre, adjunk hozzá 1 ml -t a Folin reagenshez és 2 ml -t 20% naco -tól, és hígítsák a 20% -ot. Min, hűtsük és hígítsuk 20 ml -re, és szobahőmérsékleten helyezzük 30 percig. Használjon spektrofotométert az A abszorbancia mérésére 650 nm hullámhosszon, és rajzoljon egy standard görbét A abszorpcióval, mint a vízszintes tengely, és a minta koncentrációját a függőleges tengelyként. ② felismerés
Add distilled water to 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL sample solutions to 46mL, then add 1mL of Folin-phenol reagent, mix evenly, react for 3min, then add 3mL of 20% NaCO3, shake in a 25 degree constant temperature water bath for 2h, use distilled water as blank control, and measure its absorbance A at a wavelength of 760nm spektrofotométerrel. A teljes fenoltartalmat gallinsav -ekvivalensként fejezzük ki, és az összes fenoltartalmat a standard görbe egyenlet szerint számítják ki.

(2) Redukciós vizsgálat [54]
Add 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL of sample to 2.5mL of phosphate buffer with a concentration of 0.2mol/L and a pH value of 6.6, then add 2.5mL of potassium ferricyanide (w/v) with a mass concentration of 1%, and react at 50 fok 30 percig. Ezután adjunk hozzá 2,5 ml triklór-ecetsavat (tömeg/térfogat) 10%-os tömegkoncentrációval, és centrifugáljuk 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig nagysebességű centrifugában. Közvetlenül a kivétel után vegyen be 2,5 ml felülúszót egy térfogati lombikba, adjon hozzá 2,5 ml desztillált vizet és 0,5 ml vas -kloridot (tömeg/térfogat), tömegkoncentrációval 0,1%. Használjon desztillált vizet üres kontrollként, és mérje meg az A abszorbanciát 700 nm hullámhosszon spektrofotométerrel. A csökkentő teljesítmény szilárdságát az abszorbancia érték alapján lehet megítélni. Minél magasabb az abszorbancia érték, annál erősebb a redukáló teljesítmény.

 

(3) A szuperoxid -anion szabad gyökök megsemmisítő hatásának meghatározása [55]

Vegyünk 4,5 ml 0. Adjunk hozzá 1 ml enzimminta -oldatot 10%, 20%, 30%, 40%és 50%és 0,4 ml 25 mmol/L pirogallol oldat koncentrációjával. Keverje össze alaposan és reagáljon egy 25 fokos vízfürdőben 5 percig. Adjon hozzá 1,0 ml 8 mol/l sósavat a reakció befejezéséhez. Használja a Tris-HCl puffert referenciaként, és spektrofotométert használjon az A abszorbancia 299 nm hullámhosszon történő mérésére a kioldási sebesség kiszámításához. Az üres kontrollcsoporthoz a minta helyett 1 ml oldószert használtunk. Az O 2- oldási sebességet a 3.1 képlet szerint számítottuk: o 2- Scavenging Rate (%)=(A {1- a2)/A1 × 100 (3.1), ahol: A1 az üres cső abszorbancációja; Az A2 a minta abszorbanciája.

(4) A sípoló hatás meghatározása a hidroxilgyökökre [56]

100μL, 200μL, 300μL, 400μL, 500μL sample solution was added with water to 2mL, then added to 1.4mL of hydrogen peroxide with a molar mass concentration of 6mmol/L, then added with 0.6mL of sodium salicylate with a molar mass concentration of 20mmol/L and 2mL of ferrous sulfate with a molar mass concentration of 1,5 mmol/L, és állandó hőmérsékletű vízfürdőben melegítjük 37 fokos 1 órán át. Állítsa be a nullára desztillált vízzel, és mérje meg az A abszorpciósát 562 nm hullámhosszon spektrofotométer segítségével. Végezzen el 3 ismétlést minden egyes kezeléshez. Számítsa ki a hidroxil -gyökök megsemmisülési sebességét a 3.2 képlet szerint: hidroxil -gyökök megsemmisülési sebessége (%)=[(a 1-} a2)/a1] × 100 (3.2), ahol: A1 az üres átlagos abszorpciója; Az A2 a mintaoldat átlagos abszorbanciája. (5) A DPPH szabad gyökök megsemmisítő hatásának meghatározása [57]

Új gyógynövények cisztánche sokkal több oxidációs képességgel, mint a baktériumok fermentációja

 

Pontosan pipetta 2 ml enzimminta -oldat 1 0%, 20%, 30%, 40%és 50%koncentrációval egy 10 ml -es térfogati lombikba, majd adjon hozzá 2 ml 80%DPPH etanol vizes oldatot a térfogati lombikhoz. A moláris tömegkoncentráció 2 × 10-4 mol/l. Keverés után hagyja, hogy szobahőmérsékleten álljon 30 percig. A 80% -os etanol oldat felhasználásával referenciaként mérje meg a minta abszorbanciáját 517 nm hullámhosszon, amelyet A1 -ként rögzítenek. Keverje össze 2 ml DPPH -oldatot és 2 ml etanol -oldatot 80% -os tömegkoncentrációval, és mérje meg abszorbanciáját ugyanolyan hullámhosszon, amelyet A0 -ként rögzítünk. Keverje össze 2 ml enzimoldatot és 2 ml etanol -oldatot 80% -os tömegkoncentrációval, és mérje meg abszorbanciáját ugyanazon a hullámhosszon, amelyet A2 -ként rögzítünk. Számítsa ki a DPPH szabad radikális megsemmisülési sebességét a 3.3 képlet szerint:
A DPPH szabad gyökös kiszivárgási sebessége (%) {{0}} [1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3), ahol: A1: A1 a 2 ml DPPH 80% -os etanol -Aqueous oldat és 2 ml -enzyme oldat abszorpciója; Az A2 a 2 ml -es enzim oldat vegyes oldatának és 2 ml 80% -os etanolnak a tömegkoncentrációval történő abszorbanciája; Az A0 a 2 ml -es DPPH oldat vegyes oldatának és a tömegkoncentrációval 2 ml 80% -os etanol abszorbanciája.

(6) ABTS szabad gyökök megsemmisülési képessége [58]
Adjon hozzá egy bizonyos mennyiségű kálium -szulfátot 7 mmol/L ABTS oldathoz, amíg a vegyes oldat végső koncentrációja 2,45 mmol/L. Helyezze a vegyes oldatot hűvös és száraz helyre szobahőmérsékleten 12-16 órán át. 1 μl, 3 μl, 5 μl, 7 μl és 9 μl mintavételi oldatot kiegészítettünk 10 μl -re 5 mmol/L pH7,4 foszfátpufferrel, majd egyenletesen keverjük össze a fenti kálium -szulfát 10 ml -es és az ABT -k vegyes oldatával, és hagytuk reagálni 30 fokos reakcióhőmérsékleten és 5MIN reakcióidőjével. Nulla desztillált vízzel, és mérje meg az A abszorbanciát 734 nm hullámhosszon spektrofotométerrel. Számítsa ki az ABT -k szabad gyökös megsemmisülési sebességét a 3.4 képlet szerint:
ABTS szabad gyökök megsemmisülési sebessége (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4), ahol: A1 az üres kontrollcsoport abszorbanciája; A2 a kísérleti csoport abszorbanciája

 

3.2 Eredmények és elemzés

3.2.1 Összes fenoltartalom

(1) Standard görbe
A teljes fenoltartalom standard görbéjét az gallinsav koncentrációjával, mint a vízszintes tengelyként és az A abszorbancia értéke, mint a függőleges tengely, a 3.1. Ábra szerint.

 

3.1. Ábra Az összes fenoltartalom standard görbéje

A 3.1. Ábrán láthatjuk, hogy a standard görbe egyenlet y =11.

(2) A minták meghatározása

Az Apple enzimek teljes fenoltartalom -meghatározásának eredményeit a kontrollcsoportban és a kísérleti csoportot különböző koncentrációban a 3.2. Ábra mutatja.

 

 

 

3. ábra: A teljes fenoltartalom görbéje

Amint a 3.2. Ábrán látható, az Apple enzimek mind a kontrollcsoportban, mind a kísérleti csoportban nagy teljes fenoltartalmúak, és mindkettő növekszik a hozzáadott mintavételi oldat mennyiségének növekedésével. Ugyanebben a koncentráció -gradiensben az Apple enzim teljes fenoltartalma a kontrollcsoportban 0. A kísérleti csoport teljes fenoltartalma sokkal magasabb, mint a kontrollcsoporté, és a felfelé mutató trend nyilvánvalóbb. A teljes fenoltartalom szerint a kísérleti csoport általános antioxidáns aktivitása nagyobb, mint a kontrollcsoporté.

 

3.2.2 A teljesítmény csökkentése

Az Apple enzimek teljesítményének meghatározásának eredményeit a kontrollcsoportban és a kísérleti csoportban különböző koncentrációban a 3.3. Ábra mutatja.

 

Amint az a 3.3. Ábrán látható, az alma enzimek redukáló teljesítményének változó tendenciája hasonló a teljes fenoltartalom változó trendjéhez. A kísérleti csoport redukáló teljesítménye magasabb, mint a kontrollcsoporté, és függetlenül attól, hogy a kísérleti vagy a kontrollcsoport a kísérletben bemutatott koncentrációs tartományon belül, a redukáló teljesítmény növekvő tendenciát mutat a hozzáadott mintaoldat mennyiségének növekedésével. A kísérleti adatok azt is megerősítették, hogy a teljesítmény csökkentése szempontjából a kísérleti csoport antioxidáns aktivitása nagyobb, mint a kontrollcsoporté.

 

 

3.2.3 szuperoxid anion szabad gyökök megsemmisülési képessége

Az Apple enzimek szuperoxid anion szabad gyökök megsemmisítő képességének eredményeit a kontrollcsoportban és a kísérleti csoport különböző koncentrációban a 3.4. Ábra mutatja.

Amint az a 3.4. Ábrán látható, nagy különbség van a szuperoxid anion szabad gyökök megsemmisítési képességében a kísérleti csoport és a kontrollcsoport között. A kísérletben bemutatott koncentrációtartományon belül a kísérleti csoport szuperoxid anion szabad gyökök megsemmisülési képessége a legfontosabb, ha a minta koncentrációja 10%-ról 20%, és a változás nem egyértelmű, miután a koncentráció meghaladja a 20%-ot; Ha a koncentráció 50%, akkor a szuperoxid anion szabad gyökök megsemmisülési képessége akár 85,4%. A kontrollcsoport által mutatott szuperoxid -szabad gyökök megsemmisülési képessége egyértelműen látható a trenddiagramból. Ahogy az enzimkoncentráció növekszik, ez a szabad gyökök megsemmisülési képessége is növekszik, lassan változik, és fokozatosan stabil állapotban van. A megsemmisítési képesség legfeljebb 42,6%-ot ér el. A kísérleti csoport majdnem kétszer olyan magas, mint a kontrollcsoport.

 

 

3.2.4 Hidroxil -szabad radikális megsemmisítő képesség

A kontrollcsoportban és a kísérleti csoportban a különböző koncentrációkban a kísérleti csoportban a 3.5. Ábra mutatja az Apple enzimek és a kísérleti csoport hidroxil -szabad gyökök -megsemmisítő képességének változásait.

 

 

3. ábra

 

A 3.5. Ábrán látható, hogy a kísérletben bemutatott koncentrációs tartományon belül az enzimek hidroxil -szabad gyökös kiszivárgási képessége a kísérleti csoportban és a kontrollcsoport növekedett a hozzáadott mennyiség növekedésével. A kísérleti csoport hidroxil -szabad gyökök megsemmisülési képessége alacsonyabb volt, mint a kontrollcsoporté, és alacsony koncentrációban nagyon rosszul teljesített. Magas koncentrációk esetén a hidroxil -szabad gyökök megsemmisülési képessége jelentősen megnőtt. Ennek oka lehet, hogy a fermentációs folyamat során a kísérleti csoportban és a kontrollcsoportban a mikroorganizmusok típusai és tartalma eltérő volt, és az egyes termékek által termelt szekunder metabolitok és alkotóelemek tartalma eltérő volt, tehát az antioxidáns kapacitás eltérő volt.

 

3.2.5 DPPH · Szabad radikális megsemmisítő képesség

Más detektálási módszerekkel összehasonlítva a DPPH · A szabad gyökök megsemmisülési képességét széles körben használják az antioxidáns aktivitás rövid idő alatt történő értékelésére [59]. A DPPH · A szabad gyökök megsemmisülési képességét különböző koncentrációban ábrázoltuk a kontrollcsoport és az Apple enzimek kísérleti csoportjának eredményei szerint, a 3.6. Ábra szerint.

Amint az a 3.6. Ábrán látható, amikor a kontrollcsoport koncentrációja az Apple enzim kevesebb volt, mint 30%, a DPPH · A szabad gyökök megsemmisülési képessége kevesebb, mint 50%volt, de a kísérleti csoport almás enzimje is magasabb DPPH · szabad gyökök scavenging képességét mutatta alacsony koncentrációban. A kísérleti eredmények azt mutatják, hogy az Aspergillus oryzae, az élesztő, a termofil streptococcus és a bolgár Lactobacillus hozzáadása előnyös az enzim DPPH · szabad gyökök megsemmisítő képességéhez. Ha az enzimkoncentráció 50%, ez a képesség akár 91,4%-ot is, ami jóval magasabb, mint a kontrollcsoport 69,8%-a azonos koncentrációban.

 

3.2.6 ABTS radikális megsemmisítő képesség

Az Apple enzimek ABTS radikális megsemmisítő képességének eredményeit a kontrollcsoportban és a kísérleti csoport különböző koncentrációban a 3.7. Ábra mutatja.

3. ábra
A 3.7. Ábrán látható, hogy az alma enzimek kiszélesedési sebessége a kísérleti csoportban nagyobb, ha az enzim hozzáadási mennyisége nagyobb, mint 5 μl. Erel et al. kimutatták, hogy az ABTS radikálisok megsemmisítő képessége nagymértékben függ a fenolos anyagok magasabb koncentrációjától [60]. A teljes fenoltartalom meghatározásának eredményei azt mutatták, hogy a kísérleti csoport teljes fenoltartalma magasabb volt, mint a kontrollcsoporté. A 3.7. Ábrán látható kísérleti eredmények igazolják, hogy az ABTS radikálisok megsemmisítő képessége nagyobb, mint a kontrollcsoporté.

 

3.3 E fejezet összefoglalása

Ez a fejezet a négy kiválasztott alma törzs, az enzimminták koncentrációja, valamint az antioxidáns aktív komponensek és a szabad gyökök megsemmisítő képességének összehasonlításának és a kontrollcsoportnak a szabad gyökök -megsemmisítő képességének összehasonlítását vizsgálja az almaszinták és a kontrollcsoport közötti összehasonlítás. A kísérleti eredmények azt mutatják, hogy az Apple enzim teljes fenoltartalma a kontrollcsoportban alacsonyabb, mint a kísérleti csoportban, és redukáló teljesítménye, szuperoxid -anion szabad gyökök, DPPH szabad gyökök és ABTS szabad gyökös kiszélesedési képessége jobb, mint a kontrollcsoportban; A kontrollcsoportban található enzim különösen jó megsemmisítő képességgel rendelkezik a hidroxil -szabad gyökök számára.
Általában a kísérleti csoport magasabb antioxidáns aktivitást mutatott, ami tovább erősítette a törzsek mesterséges hozzáadásának megvalósíthatóságát a mikrobiális enzimek előállításához. Ilyen módon a mikrobiális enzim ételek több anyaggal rendelkeznek az emberi egészségre, az eredeti természetes fermentáció alapján, és jobban fejlődhetnek az emberek által várható irányban.