Az oxidatív stressz, a diszfunkcionális energia-anyagcsere és a destabilizáló neurotranszmitterek megváltoztatták az agyi anyagcsere-profilt egy patkánymodellben, amely szimulált Heliox-telítettségi merüléssel 4.0 MPa Ⅱ

Szövetkivonási eljárás

A poláris metabolitok szövetmintákból való extrakciós eljárása kisebb módosítást jelentett [18]. Az előre lemért fagyasztott szövetmintákat jégen felengedtük, majd jeges-hideg HPLC-minőségű metanol-kloroform-víz oldószerrendszerben (400 μL, 400) mechanikai homogenizálásnak vetették alá. μL, illetve 285 μL 100 mg agyszövetenként) szövethomogenizátorral (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Franciaország). A kapott homogenizátumokat 30 percig jégen tartottuk, majd 12,{12}} xg-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on. Az egyes minták felülúszóját ezután eltávolítottuk és liofilizáltuk, így poláris metabolitokat tartalmazó port kaptunk fagyasztva szárítóban (FD-1A-80, BIOCOOL, Kína). Minden pormintát ezt követően 550 μl PBS-pufferrel oldottunk fel, amely 0,1% TSP-t tartalmazott, majd az összes mintát alaposan rotációs keveréssel összekevertük, és 12,{22}} xg-vel centrifugáltuk 20 percig 4 °C-on. A felülúszó 500 μl-es aliquot részét ezután egy 5,0 mm átmérőjű NMR-csőbe (Norrel, UK) vittük át. A kéregmintában lévő fehérje extrakciós elve a korábban leírtak szerint történt, módosítások nélkül. A kéregminták pontos mennyiségét homogenizáló pufferbe öntöttük (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1% Triton X-100, aprotinin, pepsztatin A és leupeptin egyenként 10 ug/ml), és manuálisan homogenizáltuk jeges fürdőben. A keveréket 1, 000 xg-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on, és a felülúszót használtuk a mennyiségi fehérjekoncentrációk meghatározásához Bradford teszt segítségével.

Kattintson ide a Cistanche antioxidáns funkciójának megismeréséhez

Biokémiai vizsgálat

A Na-KATPáz és AChE metabolikus enzimek, valamint a DA, E, NE, 5HT és GABA neurotranszmitterek mennyiségi meghatározására egy érzékeny, kompetitív enzimhez kötött immunszorbens assayt (ELISA) alkalmaztunk assay kitekkel. Az ELISA a SOD, MDA és GPx szintjét is meghatározta a kérgi szövetben assay kittel a gyártó utasításai szerint.

NMR mérés

A szöveti metabolitok hatékony mennyiségi meghatározását egy 600 frekvencián működő, nagy érzékenységű kriogén szondával felszerelt, folyékony, nagy felbontású Bruker Avance-III NMR-spektrométeren alapuló analitikai platform segítségével érték el. 17 MHz 1 H megfigyeléshez 298 K-en. Vízelnyomásos egydimenziós 1 H ZGPR (TOPSPIN 3.0, Bruker Biospin) impulzusszekvenciát (RD-90˚-ACQ) alkalmaztunk szerezzen NMR adatokat minden egyes mintára. Négy ál-letapogatást és 128 tranzienst rögzítettünk egy 32 K adatpontból álló időtartományban 20 ppm spektrális szélességgel, 10,0 másodperces relaxációs késleltetéssel és 2,73 másodperces gyűjtési idővel. A Fourier-transzformáció előtt az összes szabad indukciós lecsengésre (FID) egy 0,3 Hz-es exponenciális vonalszélesítési függvényt és 64 K adatpontok nulla kitöltését alkalmaztuk. További kétdimenziós NMR technikákat, impulzusmező gradiens korrelációs spektroszkópiával (gCOSY) és 2D homonukleáris összkorrelációs spektroszkópiával (TOCSY) alkalmaztunk standard impulzusprogramok segítségével kiválasztott mintákon a kémiai eltolódási hozzárendelések megerősítésére. Minden spektrumfelvételnél automatizált mintaváltót használtak a folyamatos mintaszállításhoz.

Metabolit azonosítás és megerősítés

Az egyedi rezonanciák spektrumbeli elhelyezkedése alapján kapott NMR-jeleket a Chenomx NMR Suite v. 8.4 szoftvercsomagban azonosítottuk (értékelő verzió). Egyes metabolit-hozzárendelések megerősítését a kémiai eltolódások, a kapcsolási állandók és a metabolitok multiplicitási mintázatainak figyelembevételével végezték, mint az 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, nyilvános NMR-adatbázisok, például a COLMAR és a Human Metabolome skaláris kapcsolási információit. Adatbázis (HMDB) és a szakirodalom [18, 19].

Többváltozós statisztikai elemzés

Az egyes 1D 1H NMR-spektrumok előfeldolgozásához használt előfeldolgozási protokoll megegyezett az előző munkánkban [20] leírtakkal. Az 1H NMR spektrumokat MestReNova (Mestrelab Research, SL, Spanyolország) segítségével fázisra állítottuk és alapvonalra korrigáltuk, és minden metabolit spektrális régióját egy vödörbe integráltuk. A szerves oldószer jelének rezonanciáit és a maradék H2O/HOD jeltartományt eltávolítottuk az összes 1H NMR spektrumban. Minden spektrumban egy 0.{{30}}03 Hz-es vödör eljárást és a spektrális intenzitás 10000-rel szorzott összegére történő normalizálást alkalmaztuk. Csak az egyik csúcs legnagyobb vödörértékeit választottuk ki a következő lépéses elemzéshez, hogy elkerüljük a diszkrimináns metabolitok félreértelmezését az átfedő jelek miatt. Ezt követően 47 metabolitból álló integrált vödröket vontunk ki, és egyváltozós és többváltozós adatelemzésnek vetettük alá. A megkülönböztetés nélküli elemzés főkomponens-analízissel (PCA) és a diszkriminációs analízis részleges legkisebb négyzetek diszkriminancia analízisével (PLS-DA) és a látens struktúrákra ortogonális vetületekkel végzett diszkriminanciaanalízis (OPLS-DA) a SIMCA-P plus 14.0 szoftvercsomaggal (Umetrics) történt. , Umeå, Svédország) egységnyi varianciaadatokra skálázva. A PCA és PLS-DA pontdiagramokat az első és a második főkomponenssel (t[1], t[2]), míg az OPLS-DA pontdiagram t[1]-et és az ortogonális komponenst (to[1]) illusztráltuk. ]). A Q2 (cum), R2Y (cum) és R2X (cum) paramétereket a diszkriminációs modellek túlillesztés elleni robusztusságának tesztelésére számítottuk [21]. Amint azt korábban leírtuk, a Q2 � 0,4 minőségértékelési érték megbízható modellnek tekinthető. A hétszeres keresztellenőrzési stratégiát és a permutációs tesztet 200-szor az első komponenssel alkalmazták a modell túlillesztése elleni védelemre és a modellek megbízhatóságának és megbízhatóságának további érvényesítésére. Ha a Q2 regressziós egyenesnek negatív metszéspontja volt, és a bal szélső pontba illesztett Q2 értékek nagyobbak voltak, mint a jobb oldali pontok összes Q2 értéke a permutált tesztben, a létrehozott OPLS-DA modell robusztus volt [22]. Az alapértelmezett 10-hajtás keresztellenőrzési stratégiáját alkalmazták a modell túlillesztése ellen. Általánosságban elmondható, hogy a minőségértékelési statisztika (Q2) � 0,4 megbízható modellnek tekinthető, amint azt korábban leírtuk. Az OPLS-DA modellekből kinyert korrelációs koefficienseket (r) és VIP értékeket használtuk azon metabolitok azonosítására, amelyek jelentősen hozzájárultak a két csoport elválasztásához. Ezen túlmenően a metabolitok csoportok közötti változását függvény segítségével számítottuk ki. IA/IB, ahol IA és IB az A és B csoport metabolitintegráljának átlagértékeit jelenti. A hőtérképet és a dobozdiagramokat ábrázolták, hogy megkönnyítsék a metabolitok csoportok közötti eltéréseinek megértését.

A metabolit integrálok egyváltozós statisztikája

Az egyes csoportok metabolitjainak vödör átlagát átlag ± standard deviáció (SD) formájában fejezzük ki. Az egyváltozós analízist ANOVA (varianciaanalízis) segítségével is elvégeztük. A csoportok közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket a GraphPad Prism V 8.4.3 szoftverben (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA) végzett naplókonverziót követően két farok páratlan t-tesztjével értékeltük ki. A statisztikailag szignifikáns különbségeket p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Rendszerstatisztikai metabolikus korrelációs elemzés és hierarchikus klaszteranalízis

A Pearson-féle korrelációs együttható számítását és a hierarchikus klaszteranalízist a metabolitok relatív integráljai alapján végeztük az R Studio-ban (1.4.1717-es verzió) kis szkriptekkel. Minden csoportpár esetében a korrelációs mátrixot egy pixeltérképben illusztráltuk, a szakirodalomban leírtak szerint [21]. Röviden összefoglalva, egy csoport minden változója esetében a 0.05-nél kisebb p-értékkel járó korrelációkat szignifikáns statisztikai korrelációnak tekintettük, és megtartottuk a végső korrelációs hálózat felépítéséhez, amely szemlélteti a metabolitok látens kapcsolatait a metabolitokon belül. csoport és a csoportok közötti metabolikus kapcsolatok zavarai. A pirosabb négyzetek szignifikánsabb pozitív korrelációt jeleznek. A kékebb négyzetek szignifikánsabb pozitív korrelációt jeleznek. A fehér négyzetek szignifikancia nélkül jelzik a korrelációt. A HSD válaszadóiként hivatkozott legrelevánsabb agyi metabolikus útvonalak és hálózatok elemzését a MetaboAnalyst 3.0 eszközzel végeztük. Az elvégzett útvonal topológia elemzéshez a Rattus norvegicus (patkány) emlős útvonal könyvtárát választottuk ki. Ezt a megközelítést használták az útvonal hatásának, a hamis felfedezési aránynak (FDR) és a p-értékeknek a becslésére is.

Eredmények Kortikális biokémiai indexek a HSD és CON csoportból

A HSD agyszövetekre, biokémiai paraméterekre gyakorolt ​​metabolikus megváltoztató hatásainak validálása, beleértve a Na-KATP, AChE és LDH, a DA, E, NE, 5HT és GABA neurotranszmittereinek energiaanyagcserével kapcsolatos enzimatikus aktivitását, és aoxidatív stresszhez kapcsolódó fehérjéknak,-nekGYEP, MDA, és Gpx-et is meghatároztunk HSD és CON patkányok azonos oldali kéregszöveteiben (1. táblázat). A kontrollcsoporthoz képest a DA, E, NE és MDA szintjei szignifikánsan emelkedtek, míg a Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD és Gpx tartalma csökkent a HSD modellben. A jelen munkában használt tesztkészletek kimutatási határát a kiegészítő anyagok fájljában található S3 táblázat tartalmazza.

1. táblázat: A biokémiai paraméterek mennyiségi meghatározását kéregszöveti CON és HSD állatokban ELISA-val mértük az assay kittel. (átlag ± SD). statisztikai szignifikanciát jelez.

Az agyszövetminták 1 H NMR spektrumában azonosított metabolitok

A 3. ábra három reprezentatív 1H NMR spektrumot mutat be HSD patkány kéregéből (3A. ábra), hippocampusából (3B. ábra) és striatumából (3C. ábra). Az agyszövetminták 1 H NMR adatai alapján a kiemelkedő metabolitok széles skáláját azonosították, ezek szerves sav anionok (laktát (Lac), malonát (Maln), szukcinát (Suc), malát (Mal), fumarát (FMA). ), 2-hidroxi-butirát (2-HB), acetát (Ace), formiát (For), taurin (Tau), aszkorbát (Asc), 2-hidroxi-butirát (2HIB)), aminosavak (leucin (Leu), izoleucin (Ile), valin (Val), alanin (Ala), glicin (Gly), tirozin (Tyr), fenilalanin (Phe), aszpartát (Asp), glutamin (Gln), glutamát (Glu) , treonin (Thr), szerin (Ser), lizin (Lys), aszparagin (Asn)), neurotranszmitterek ( -aminobutirát (GABA)), energiával kapcsolatos metabolitok (kreatin (Cre), adenozin-trifoszfát (ATP), adenozin-monofoszfát ( AMP)), foszfolipiddel kapcsolatos metabolitok (Ofoszfoetanol-amin (PEA), O-foszfokolin (Pcho), sn-glicero-3-foszfokolin (GPC)) és mások (mio-inozitol (MI), nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD plus) ), nikotinsav (Nic), N-acetil-aszpartát (NAA), nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP plus), UDP-N-galaktóz (UDPGa), uridin (Uri), uracil (Ura), cisztidin (Cyt) , uridin 5'-monofoszfát (UMP), inozin 5'-monofoszfát (IMP), inozin (Ino), kolin (Cho), autó nitin (Car), glutation (GSH). Az S1 táblázat részletes információkat tartalmaz a metabolitok hozzárendeléséről.

Metabolikus analízissel kimutatott metabolikus profilváltozások

A PCA-t, a különböző agyi régiókból származó összes agykivonat 1H-NMR-spektrumának feltáró és torzításmentes elemzési megközelítését először azért készítették el, hogy feltárják a fő anyagcsere-trendeket, amelyeket a 4{25}}0 msw-os hiperbár expozíció okoz. heliox telítettségi környezet. A PCA-ból (S1A–S1C ábra) az integrált vödör adatokból nyert PC1 vs. PC2 szóródiagram bizonyos diszkriminációt mutatott ki, némi átfedéssel a két osztályozás között. A PLS-DA (S1A'–S1C' ábra) és OPLS-DA (4A–4C. ábra) modellek felügyelt vizsgálatai egyértelmű osztálybeli megkülönböztetést mutattak a csoportok közötti metabolikus profilok között. A 4. ábra az OPLS-DA modell pontdiagramjait mutatja a kéregrégióra (A), a hippocampus régióra (B) és a striatum régióra (C), egyértelmű megkülönböztetést mutatva a HSD csoportok és a kontrollok között. Az R2X és Q2 (S1A'–S1C' ábra, 4A–4C ábra) és a permutációs teszt diagramok (4'-4C'A ábra) értékei által tükrözött nagy magyarázott variáció és a jóslat jósága azt jelezte, hogy a generált felügyelt modellek robusztussága. Az S-vonal görbéiből kinyert korrelációs együtthatót (r), a változó fontosságot a vetítésben (VIP) és a p-értéket a nem-paraméteres egyváltozós tesztekből gyűjtöttük össze, hogy felmérjük azokat a szignifikáns metabolitokat, amelyek felelősek az osztályt megkülönböztető mintákért. Ezért a három kritérium bármelyikének megfelelve (r abszolút értéke nagyobb, mint 0,50, VIP értéke 1,0-nál nagyobb, valamint p érték kisebb, mint 0,05) statisztikailag szignifikáns metabolitokból álló panelt választottunk. (1. táblázat) felelős a CON és a HSD csoportok elválasztásáért. Az 1. táblázatban az 1-nél nagyobb szorzási értékek a HSD csoportban megnövekedett szintet, míg az 1-nél kisebb szorzási értékek a HSD csoportban csökkent szintet jeleznek. A megkülönböztető metabolitok átlagos SD értékeit az S2 táblázat tartalmazza. A metabolitok hierarchikus klaszteranalízisével és az átlagos kapcsolódási módszerrel a generált hőtérkép (5A–5C. ábra) dendrogramokkal lehetővé teszi három agyi régió metabolikus változásának jobb megjelenítését, amelyet a hélium oxigénnel telített környezetben okozott hiperbár expozíció okoz.

A HSD patkányok különböző agyi régióiban megfigyelt anyagcserezavarok

A fent említett többváltozós elemzés és egyváltozós analízis a különböző csoportok metabolitjainak vödörmagasságának felhasználásával nagyszerű munkacsövet biztosított a megkülönböztető metabolitok azonosításához, amelyek feltárják a HSD eseményekhez kapcsolódó lehetséges neurológiai metabolikus változásokat. Emelkedett AMP, FMA, Nic és Phe, valamint Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura és Uri csökkenést találtak a HSD kéregszövetében. a CON csoporthoz képest (5A. ábra, 1. táblázat). Eközben a hippocampusban az Ala, a GSH, a Lac, az Uri, a Cyt, a GABA, a Tyr és az Ura szintje is csökkent, és az AMP nőtt a HSD csoportban, akárcsak a kéregben. Ezenkívül a felfelé szabályozott Thr és a csökkentett Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc és DMA a HSD-csoport hippokampusz-kivonataiban expresszálódott a kontrollokhoz képest (5B., 5D. ábra, 1. táblázat). A CONS csoporthoz képest a Cyt, GABA, Ura, Cho és Thr tartalma is csökkent, ahogyan a kéregben és a hippocampusban is. Ezenkívül megemelkedett az elágazó láncú aminosavak (BCAA-k, beleértve a Leu, Ile, Val) és Lys szintje, valamint csökkent a Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, az ATP, Tau, IMP metabolitok sorozata, és a Suc-t, amely szintén csökkent a hippocampusban, valamint további két metabolitot, az Ino-t és a Pcho-t, amelyek szintén csökkentek a kéregben, a HSD csoportba tartozó patkányok striatum szöveteiben (5C., 5D. ábra, 1. táblázat). Az ilyen sok metabolit mindig összetett és változatos molekuláris útvonalakat jelez. A diszkrimináns metabolitok integrál vödör értékeit számszerűsítettük, és koncentrációjuk statisztikailag szignifikáns változásait a heliox-telítettség-hiperbár expozíciós csoport és a kontrollcsoport között az S2 táblázatban és a 2. táblázatban foglaltuk össze a három agyi régióra vonatkozóan.

4. ábra: Ortogonális részleges legkisebb négyzetek diszkriminancia analízis (OPLS-DA) pontdiagramjai és permutációs tesztdiagramjai, amelyek megkülönböztetik a 400 msw heliox-telítettség hatását az 1H NMR spektrumokra a kéreg kontrollcsoportjaitól (CONC, n=8, HSDC, n=8, A és A') (R2X=0.38; Q2=0.46), hippocampus (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B és B') (R2X=0.37; Q2=0.43) és striatum (CONS, n=8, HSDS, n=8, C és C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Az OPLS-DA pontdiagramokon a Q2 paraméter értékei, amelyek egyenlőek vagy nagyobbak voltak 0,40-nél, a permutált modellek bal szélső pontjának Q2 értékeivel párosítva nagyobbak voltak, mint a jobb oldali pontok összes illesztett Q2 értéke (permutáció teszt 80-szor), jelezve, hogy a megállapított OPLS-DA modellek érvényesek.

A Pcho-t, amely a kéregben is csökkent, a HSD csoportba tartozó patkányok striatum szöveteiben figyelték meg (5C., 5D. ábra, 1. táblázat). Az ilyen sok metabolit mindig összetett és változatos molekuláris útvonalakat jelez. A diszkrimináns metabolitok integrál vödör értékeit számszerűsítettük, és koncentrációjuk statisztikailag szignifikáns változásait a heliox-telítettség-hiperbár expozíciós csoport és a kontrollcsoport között az S2 táblázatban és a 2. táblázatban foglaltuk össze a három agyi régióra vonatkozóan.

5. ábra: Hőtérkép és statisztikai korrelációs diagramok a kéregből (A, A', HSDC minták a felső panelen, a CONC pedig az alsó panelen), a hippocampusból (B, B', HSDH) származó diszkriminatív metabolitok vödörértékeiből származnak. csoport a felső panelen, a CONH pedig az alsó panelen található, a striatum (C, C', HSDS minták a felső panelen, a CONS pedig az alsó panelen találhatók) HSD és CON patkányok szövetei. A hőtérképen szereplő metabolitokat hierarchikus klaszterezéssel szervezik a szintminták általános hasonlósága alapján. Venn-diagram (D), amely szemlélteti a metabolitok átfedését a HSDC-CONC, a HSDH-CONH és a HSDS-CONS összehasonlítások között.

Metabolit korrelációs elemzés

Az 5A'-5C' ábrán a metabolitok közötti kapcsolat olyan összetett volt. Az energia-metabolitok esetében a pozitív korreláció a Lac vs Ala között HSDC-ben, AMP vs IMP a HSDH-ban, ATP vs Pcho a HSDS-ben, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA a HSDS-ben, valamint a Lac vs Thr és GSH vs negatív korrelációja Suc a HSDH-ban, Suc vs Val a HSDS-ben jelen volt a metabolit korrelációs diagramokon. A neurotranszmitterek esetében a GABA vs Car HSDC-ben, GABA vs Cho CONH-ban és GABA vs Suc/Ino/Gln HSDS-ben pozitív korrelációi jelen voltak a metabolit korrelációs görbéken. A GABA vs FMA negatív korrelációja a CONC-ban és GABA vs NAA/Ura/NADP plus a CONS-ben jelen volt a metabolit korrelációs görbéken. A kapcsolódó metabolitokhozoxidatív stressz, apozitív összefüggésekGSH vs Asn a HSDC-ben és CONC, Tau vs Lac a HSDH-ban, Tau vs Suc/Ala a CONH-ban, a GSH vs Suc a HSDH-ban, Tau vs Thr a HSDH-ban negatív korrelációi jelen voltak a metabolit korrelációban telkek.

Metabolizmus útelemzés

A kvantitatív útvonal-elemzés, amely az útvonal-dúsítási elemzésből és az útvonal topológiájából származó útvonal-hatásokból állt, statisztikailag szignifikánsan szignifikáns HSD-indukált modulációkat tárt fel egy sor metabolikus útvonalon. Az útvonal hatáspontszámait, a hamis felfedezési rátával (FDR) és p-értékekkel együtt a 6. ábra írja le. Az útvonalakat szignifikánsan gazdagodottnak tekintettük, ha a p-értékek alacsonyabbak voltak, mint 0.05; a profilozott metabolitok (találatok) az útvonal összes metabolitjához viszonyítva (egyezési állapot) magasabbak voltak, mint 1; és az impakt pontszámok (amelyek a szignifikánsan érintett metabolitok hatását jelzik az útvonalon a relatív közötti központosság hálózati topológiai mérőszáma alapján) magasabbak voltak, mint 0. A legnagyobb metabolikus hatásértékkel rendelkező kéregben lévő útvonalak (6A.fenilalanin, tirozin, éstriptofán bioszintézis>fenilalanin metabolizmus> pirimidin metabolizmus > alanin, aszpartát és glutamát anyagcsere. A legnagyobb metabolikus hatással a hippocampusban (6B. ábra) a fenilalanin, tirozin és triptofán bioszintézis > glutation metabolizmus > glicin, szerin és treonin metabolizmus > purin anyagcsere > pirimidin anyagcsere > alanin, aszpartát és glutamát anyagcsere > butanoát voltak. . A striatumban (6C. ábra) a legnagyobb metabolikus hatás az alanin-, aszpartát- és glutamát-anyagcsere> nikotinát- és nikotinamid-anyagcsere> purin-metabolizmus volt.

Kérdezz többet:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plusz 86 15292862950