1. rész: A 6-bróm-indirubin-3 ′-oxim (6-BIO) antifibrotikus hatása az aktivátor fehérje-1 (AP-1) szabályozásán keresztül És a specifikus fehérje-1 (SP-1) transzkripciós faktorai a vesesejtekben
Mar 14, 2022
A 6-bróm-indirubin-3 ′-oxim (6-BIO) antifibrotikus hatása az aktivátor fehérje-1 (AP-1) és a specificitás fehérje szabályozásán keresztül -1 (SP-1) transzkripciós faktorok vesesejtekben
További információ:ali.ma@wecistanche.com
Kulcsszavak:vese, Fibrózis,SMAD,Anti-fibrotikus
ABSZTRAKT
A PAI-1 és a CTGF túlzottan kifejeződikvesebetegségekés okozzafibrózisa tüdő, a máj ésvese. Az unilaterális ureterelzáródás (UUO) patkánymodelljét alkalmaztuk annak vizsgálatára, hogy vajon6-BIO, egy glikogén-szintáz kináz-3 inhibitor, legyengítettfibrózisa PAI-1 és a CTGF in vivo gátlásával. Ezenkívül a TGF-indukált sejtesfibrózisemberen in vitro megfigyeltékveseproximális tubuláris epiteliális sejtek (HK{0}}) és patkány intersticiális fibroblasztjai (NRK49F). Kifejezésefibróziskapcsolódó fehérjék és jelátviteli molekulák, mint például PAI-1, CTGF, TGF, SMA,SMADés a MAPK-t HK{0}} és NRK49F sejtekben immunblot segítségével határoztuk meg. A PAI-1 és a CTGF expresszióját szabályozó transzkripciós faktorok azonosítása érdekében az AP-1 és SP-1 promóteraktivitását luciferáz esszékkel elemeztük. Konfokális mikroszkóppal figyeltük meg az AP-1 és SP-1 PAI-1 és CTGF együttes lokalizációját. A PAI-1, CTGF, TGF és -SMA expressziója nőtt az UUO modellben, valamint a TGF-fel kezelt HK-2 és NRK49F sejtekben. Továbbá az UUO és a TGF kezelés a P-aktivációt indukálta.SMAD2/3, SMAD4, P-ERK 1/2, P-P38 és P-JNK MAPK jelátviteli útvonalak. A PAI-1, a CTGF, az AP-1 és az SP-1 promóterek aktivitása nőtt a TGF-kezelés hatására. Azonban a kezelés a6-BIOcsökkentette a fehérjék expresszióját és a kapcsolódó jelátviteli útvonalakatfibrózisUUO modellben, valamint TGF-el kezelt HK-2 és NRK49F sejtekben. Ezenkívül a 6-BIO-kezelés gyengítette a PAI-1 és a CTGF expresszióját, valamint az AP-1 és SP-1 promóteraktivitását, ezáltal szabályozva aSMADés MAPK jelátviteli útvonalakat, és ezt követően erőtanti-fibrotikushatások rávesesejteket.
Kattintson a Cistanche herba vesebetegségre
1. Bemutatkozás
Vesea fibrózist különböző tényezők okozzák, beleértve a cukorbetegséget, a magas vérnyomást, a glomerulonephritist és az életkorral összefüggő krónikusvesebetegség [1–3]. Glomeruli szklerózis és tubulointerstitialisfibrózisvégső kóros jellemzőivesebetegségek [4,5]. Az extracelluláris mátrix (ECM) fehérjék túlzott termelése és lerakódása szerkezeti és funkcionális károsodást okoz avese, ami funkciójának fokozatos elvesztését eredményezi, ami a végstádiumban tetőzikvesebetegség [5]. Azveseösszetett szerkezettel rendelkeznek, amely glomerulusokra, tubulointersticiálisra és érrendszerre oszlik; minden rekeszben más-más típusú extracelluláris mátrix található, és hatással lehet rájukfibrózis[6,7]. Az intersticiális tubuláris sejtek ECM-je különféle komponenseket tartalmaz, beleértve a kollagént, a glikozaminoglikánt, az elasztint, a laminint és a glikoproteineket. Az aktivált proximális tubuláris sejtek aktiválhatják a tubulointersticiálist [6–10]. A glikogén szintáz kináz (GSK3) elősegítivesefibrózisa TGF-jelátvitel aktiválásával proximális tubuláris és tubulointersticiális sejtekben [11]. Ebben a vizsgálatban a GSK3 gátló hatásának meghatározását tűztük ki célul.6-BIO, a proximális tubuláris és intersticiális fibroblaszt sejteken a plazminogén aktivátor inhibitor-1 (PAI-1) és a kötőszöveti növekedési faktor (CTGF) megcélzásával, amelyek kulcsszerepet játszanak a progresszív folyamatokban.vesekárosodás és tubulointersticiálisfibrózis.
6-BIOegy indirubin analóg, a 6-bro-indirubin sejtpermeábilis származéka, amelyet tengeri puhatestűekből izolálnak, és nagy specificitással és szelektivitással rendelkezik a GSK-3 iránt [12,13].6-BIOaz ATP kompetitív inhibitora, és hasonlóságot mutat a tumorellenes aktivitást szabályozó ciklin-dependens protein kináz (CDK) ATP-kötő doménjével [14–16]. Az abnormális GSK3 aktivitás számos emberi betegséggel jár együtt, beleértve a cukorbetegséget, gyulladást, neurodegeneratív betegségeket és pszichózist [17,18]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a GSK3 inhibitorok képesek helyreállítani a sérült tubulusokat és csökkenteni a gyulladásos válaszokat, a TGF 1 jelátvitelhez kapcsolódó epiteliális-mezenchimális átmenetet (EMT), valamint a fibronektin felhalmozódását tenyésztett glomeruláris intermedier sejtekben [11,19–21]. Továbbá,6-BIOA gyulladás, az oxidatív stressz, a sejtek túlélése, valamint a proliferáció és a sejthalál szabályozása révén számos betegségben fejthet ki potenciális terápiás hatást, beleértve a cukorbetegséget, a neurodegeneratív rendellenességeket és a rákot [22–24]. Azonban a lehetséges terápiás hatások6-BIOtovábbvesefibrózisA proximális tubuláris és tubuláris interstitialis károsodással kapcsolatos kórképek még nem ismertek.
PAI-1, egy multifunkcionális glikoprotein avese, egy szerin proteáz inhibitor, amely gátolja az urokináz plazminogén aktivátort (uPA) és a szöveti plazminogén aktivátort (tPA), amely a plazminogént plazminná bontja [25,26]. A PAI-1 túlzott expressziója gátolja a fibrinolízist és az ECM lebomlását, ezáltal fokozza az ECM felhalmozódását [27]. Ezenkívül a PAI-1 fokozza a MAPK (mitogén által aktivált protein kinázok) működését,SMADés a RhoA/ROCK (Rho-asszociált protein kináz) jelátviteli útvonalak cukorbetegségben és krónikusvesebetegség [28–30]. Átírási tényezők, például AP-1, SP-1,SMAD3/4, USF2 (upstream transzkripciós faktor 2) és CTF/NF (helyspecifikus DNS-kötő család
fehérjék), a MAPK is aktiválja ésSMADjelzés [30,31]. Ezen jelátviteli utak és transzkripciós faktorok együttes aktiválása növeli a PAI-1 expresszióját, és az ECM felhalmozódásához vezet. A CTGF egy ECM-hez kapcsolódó heparinkötő fehérje, és olyan doméneket foglal magában, mint például az inzulinszerű növekedési faktor kötő fehérje (IGFBP), a von Willebrand C típusú ismétlődések (VWC), a trombospondin 1-es típusú ismétlődései (TSR) és egy C-terminális. domén (CT) cisztein csomó motívummal. E négy domén közül a CT domén kölcsönhatásba lép a TGF szupercsaláddal, a fibronektinnel és a perlecannal [32–34]. Következésképpen a CTGF növeli a MAPK-t,SMAD, PI3K és YAP jelátvitel a TGF indukálásával, és ezek a jelátviteli utak aktiválják az olyan transzkripciós faktorokat, mint az AP-1, SP-1, NF-kB ésSMAD2/3. Így a CTGF fokozott szabályozása a sejtek migrációját, proliferációját és gyulladását idézi elő, ezáltal ECM-felhalmozódást okoz [35–37].
A korábbi vizsgálatok ezen eredményei alapján feltételeztük, hogy a MAPK illSMADjelátvitel, valamint AP-1 és SP-1 transzkripciós faktorok, talán a PAI-1 és a CTGF-indukálta ECM-felhalmozódás közötti közös kapcsolat a progresszív betegségbenvesebetegség és tubulointersticiálisfibrózis. Így megvizsgáltuk, hogy vajon6-BIOmegelőzheti a krónikus progressziótvesea PAI{0}} és a CTGF szabályozása révén.
2. Anyag és módszer
2.1. Antitestek és reagensek
Az elsődlegesen használt antitestek a PAI-1 (11907), TGF (3711), foszforilált nyúl elleni antitestek voltak.SMAD2/3 (8828), SMAD4 (38454), foszforilált ERK (P-ERK) (9101), foszforilált P38 (P-P38) (4631), foszforilált JNK (P-JNK) (9251), foszforilált C-JUN (PC-JUN) (3270) , foszforilált C-FOS (PC-FOS) (5348) és hiszton H3 (9715), amelyek mindegyike a Cell Signaling Technology cégtől származik. CTGF (sc-365970), SP-1 (sc-17824),SMAD6 (sc-25321) a Santa Cruz Biotechnology cégtől szereztük be. Egér-aktin antitestek (a5316) és (2'Z,3'E)-6-bróm-irubin-3-oxim (6-BIO) (B1686) a Sigma-Aldrich cégtől szereztük be.
2.2. Állatkísérletek
Az összes állatkísérletet a vonatkozó irányelvek és előírások szerint végezték. A kísérleti protokollt a Chonnam National University Medical School (CNUH IACUC-18010, 2019. április 19.) Animal Care Regulations (ACR) bizottsága hagyta jóvá. A kísérleteket hím Sprague-Dawley patkányokkal (180–200 g, Samtako, Korea) végezték [38]. A patkányokat szabályozott hőmérsékleten (21 ± 2 ◦ C) tartottuk 12 órás világos-sötét ciklusban. A patkányokat három csoportra osztották: kontroll (n=6), egyoldali ureterelzáródás (UUO, n=6) és UUO6-BIOkezelés (n=6).6-BIO({0}},2 mg/ttkg/nap) intraperitoneálisan (ip) injekciózva 6 napig. Az obstruktív nephropathia patkánymodelljének kidolgozása érdekében a műtétet a következőképpen végeztük: UUO-t a bal ureter hét napig tartó lekötésével indukáltuk. A hasüreget kinyitottuk, és a bal proximális ureterre 2–0 selyemkötést helyeztünk. A kontrollcsoport hét napig ugyanazt a kezelést kapta, kivéve a lekötést. A patkányok szabadon hozzáférhettek a standard patkánytáphoz és csapvízhez, és a műtét utáni 7. napon leölték őket. Azvesegyorsan eltávolították és feldolgozták immunhisztokémiára és Western-blot vizsgálatra.
2.3. Szövettan
VeseA szöveteket 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, és 5 µm vastag metszetekre vágtuk. A szövettani morfológia értékelésére hematoxilin és eozin (H&E), periodic acid-Schiff (PAS), Sirius red és Masson-féle trikróm (MT) festési eljárásokat végeztünk. A H&E, PAS, Sirius vörös festést a gyártó utasításai szerint végeztük. Az MT festéshez xilollal történő paraffinmentesítést követően a metszeteket Bouin-oldattal kezeltük 56 ◦ C-on 30 percig, majd folyó csapvíz alatt mostuk, amíg a metszetek kitisztultak. A metszeteket ezt követően Weigert-féle hematoxilinnel (A:B=1:1) festettük, majd 10 percig Biebrich Scarlet/Acid Fuchsin oldattal festettük, majd desztillált vízzel mostuk. A metszeteket foszfovolfrámsav/foszfomolibdénsav oldattal inkubáltuk 10 percig, majd anilin kék oldattal kezeltük 15 percig. A metszeteket ezt követően ecetsavval 1 percig inkubáltuk, majd etanollal és xilollal dehidratáltuk. A kollagénlerakódások, a magok és az izomrostok kékre, feketére és vörösre festettek. A festett metszet kvantitatív elemzését ImageJ szoftverrel végeztük.
2.4. Western blot analízis
A sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), újraszuszpendáltuk lízispufferben, és rövid ideig ultrahanggal kezeltük. A fehérje extrakciós puffer 50 mM Tris-HCl-t (pH 7,2), 5 mM EDTA-t, 150 mM NaCl-t, 1% Nonidet P-40-t, 0,1% SDS-t, proteázgátló koktélt (GenDEPOT, P3100–) tartalmazott. 001) és foszfatáz inhibitor koktél
(GenDEPOT, P3200–001). Centrifugálás után a fehérjekivonatokat tartalmazó felülúszót összegyűjtöttük, és a fehérjekoncentrációkat Pierce® BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) segítségével mértük. A fehérjéket 12%-os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélen választottuk el, és nitrocellulóz membránokra vittük át. A blotokat szobahőmérsékleten 1 órán át blokkoltuk 0,1 százalék Tween{8}}-t (PBST) tartalmazó 5 százalékos sovány tejjel PBS-ben. A foltot ezután egy éjszakán át inkubáltuk az elsődleges antitesttel (1;2000) 4 °C-on, majd inkubáltuk a másodlagos antitesttel (1:2500), végül anti-nyúl torma-peroxidázzal konjugált antitestekkel, a korábban leírtak szerint [39 ]. A specifikus fehérjesávokat fokozott kemilumineszcens rendszerrel tettük láthatóvá. Kvantitatív elemzése
A sávintenzitást ImageJ szoftverrel (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) végeztük.
2.5. siRNA leütés
Az SP-1, az SP-1 siRNS-t (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-29487) és a kontroll siRNS-t (Santa Cruz, sc-37007) transzfektáltuk az SP-1 leütéséhez 24 órán át HK-2 és NRK49F sejtekbe 60 százalékos összefolyás mellett Dhar-maFECT 1 transzfekciós reagenssel (Dharmacon, T-2001–02) 30 nM végső koncentrációban. A sejteket szérummentes tápközegben inkubáltuk egy napig 37 °C-on◦ C inkubátorban, párásított 5 százalékos CO 2 atmoszférában, 6-BIO-val előkezelve 1 órán át, és TGF-vel stimulálva 24 órán át. A knockdown hatékonyságát Western blot analízissel határoztuk meg.
2.6. A plazmid és a riporter konstrukció átmeneti transzfekciója
A sejteket 60-70 százalékos összefolyásig növesztettük, DMEM-F-12 (HK-2 sejtek) vagy DMEM (NRK49F sejtek) tápközeggel mostuk, majd 24 órán át inkubáltuk a megfelelő tápközegben szérum és antibiotikum nélkül. . A sejteket ezután domináns-negatív C-JUN konstrukcióval, valamint pGL3 vektort hordozó PAI-1, CTGF, AP-1 és SP-1 riporterrel transzfektáltuk FuGene HD reagens segítségével. A tranziens transzfekcióhoz használt riporter plazmid koncentrációja 2 μg (1 μg/μL) volt. A riporterrel transzfektált sejteket 6-BIO-val előkezeltük 1 órán át, majd 16 órán át 10 ng/ml TGF-fel inkubáltuk.
2.7. Promotor riporter vizsgálat
A PAI-1 és a CTGF riporterkonstrukciókat a BIO FACT (Yuseong-gu, Daejeon, Koreai Köztársaság) készítette. A pGL3-AP-1 és pGL3-SP-1 riporterkonstrukciókat Young Do Jung professzor (Chonnam National University) biztosította. A PAI-1, CTGF, AP-1 és SP-1 transzkripciós szabályozását a megfelelő pGL3 promoter-luciferáz riporter konstrukcióik átmeneti transzfekciójával vizsgáltuk. HK-2 és NRK49F sejteket (5 × 10 5 ) beoltottunk, és addig szaporítottuk, amíg a 60-70 százalékos összefolyást el nem érték. Ezután a promoterkonstrukciókat és a pGL{17}}üres vektorokat FuGene HD segítségével transzfektáltuk a sejtekbe, a gyártó protokollja szerint. A Renilla luciferázt kódoló pRL-null plazmidot minden mintába beépítettük a transzfekció hatékonyságának nyomon követésére. A transzfekció után 24 órával a szentjánosbogár és a renilla luciferáz aktivitás szintjét egymás után mértük egyetlen mintából a Dual-Glo Luciferase assay rendszer (Promega) segítségével. A szentjánosbogár luciferáz aktivitását a Renilla aktivitásra és a kezeletlen sejtekben a luciferáz aktivitás relatív mennyiségére normalizáltuk.
2.8. Konfokális lézermikroszkópia
Patkányvesea mintákat 4 százalékos paraformaldehidben fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, és 3- μ m vastagságú metszetekre vágtuk.Vesea metszeteket paraffinmentesítettük és rehidratáltuk, blokkoltuk, PBS-sel mostuk, és anti-PAI-1, anti-CTGF, anti-PC-JUN, anti-PC-FOS, anti-SP{10}} és anti-AQP1 antitestek blokkoló pufferben hígítva, 24 órán át
4 ◦C. Mosás után a metszeteket Alexa Fluor 488 (zöld fluoreszcens) kecske antinyúl (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), Cy3 (vörös fluoreszcencia) kecske antiegér vagy kecske antinyúl (Invitrogen) segítségével inkubáltuk. , Oregon) antitestek 2 órán át. A HK-2 és NRK49F sejteket (3 ×10 5 ) {{10}}lyukkamrákba oltottuk, és 24 órán keresztül 37 ◦ C-on inkubáltuk. A sejteket 5 µM-tal előkezeltük. 6-BIO 1 órán át, majd 10 ng/ml TGF hatásának 16 órán át. 1X PBS-sel történő mosás után a sejteket 4 százalékos paraformaldehiddel szobahőmérsékleten 15 percig fixáltuk, majd 2 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk 1 százalék BSA-t és 0,2 százalék Triton X-et tartalmazó 1X PBS-sel. A sejteket ezután PAI-1, CTGF, PC-JUN, PC-FOS és SP-1 elleni nyúl vagy egér monoklonális antitestekkel inkubáltuk (blokkoló pufferben 1:200 arányban hígítva) 4 fokon 24 °C-on. h. Mosás után a sejteket a megfelelő másodlagos antitestekkel (Cy3 kecske anti-nyúl és anti-egér antitestek, Alexa Fluor 488 kecske anti-nyúl és anti-egér antitestek, 1:200 arányban hígítva) inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. Mosás után a fedőlemezeket mikrolemezekre szerelték fel ProLong Gold Antifade Reagent és DAPI (Life Technologies Corporation) segítségével. A képeket a Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Németország) konfokális lézer-pásztázó mikroszkóp alatt elemeztük.
2.9. Statisztikai analízis
Az eredményeket átlag ± SEM formában fejeztük ki. A csoportok közötti többszörös összehasonlítást egyutas ANOVA és Tukey őszintén szignifikáns különbség (HSD) post hoc teszt segítségével végeztük. A p < 0,05="" eredményeket="" statisztikailag="" szignifikánsnak="">
3. Eredmények
3.1. 6-A BIO gyengíti a morfológiai változásokat és a fibrózissal összefüggő markerek expresszióját az UUO patkánymodellben
Kiértékeltük a 6-BIO hatását a következőre:fibrózisban,-benveseegy UUO patkánymodellről. Amint az 1A. ábrán látható, az UUO modell jelentősen növekedettvesetubulointerstitialis károsodás, glomeruláris szklerózis, mononukleáris sejtek intersticiális infiltrációja, intersticiális kollagén lerakódása, ésfibrózisa kontrollokhoz képest, amint azt H&E, PAS, Sirius Red és MT festéssel határoztuk meg. Ezenkívül az EMT-vel rokon fehérjék, amelyek indukáljákvesefibrózisvalamint az ECM-felhalmozódást növelő kollagén I és -IV szintje megemelkedett az UUO-ban a kontrollokhoz képest (S1A és C ábra). Ezeket a változásokat azonban a 6-BIO-kezelés tompította. Az 1B. ábra azt mutatja, hogy 7 napos obstrukció után a PAI-1, CTGF, -SMA és TGF fehérjék expressziója megnövekedett UUO modellpatkányok veséjében a kontrollokhoz képest, és ezt a növekedést az kezelés 6-BIO-val. A kifejezésfibrotikusmarkerek jelentősen növekedtek UUO-ban a kontrollokhoz képest, amit ellensúlyozott a6-BIOkezelés (1C. ábra). Az immunfluoreszcens festés (1D. ábra) azt mutatta, hogy a PAI-1 és a CTGF (vörös fluoreszcencia) expressziója megnövekedett az elzáródott betegekben.vesenapon -7 a kontrollokhoz képest. A PAI-1 és a CTGF expressziója azonban csökkent a 6-BIO-kezelés hatására (1D. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a 6-BIO a PAI-1 és a CTGF expresszió gátlásával gyengíti a tubulointerstitialis károsodást.
3.2. 6-A BIO gyengíti a PC-JUN, PC-FOS, SP-1 expresszióját, és gátolja a fibrózissal összefüggő jelátviteli útvonalakat az UUO patkánymodellben
Ezután eldöntöttük, hogy vajon6-BIOkapcsolatos jelátviteli utakat érintivesefibrózis. Először is megerősítettük ezt6-BIO, amely a GSK3 ismert inhibitora, gátolja a GSK3 foszforilációját. Az S1A és B ábra a GSK3 6-BIO-val való csökkentését mutatja. A 2A. ábra a TGF/SMADjelzőútvonal. Western blot analízis kimutatta, hogy az expresszió foszforiláltSMAD2/3 ésSMAD4 fehérje nőtt UUO-banvese, amelyet a 6-BIO-kezelés gyengített (2A. ábra). Azonban,SMAD6, amely gátolja az SMAD 2 foszforilációját és aktivitásátSMAD4 [40] ellentétes eredménnyel járt. Ezenkívül a MAPK jelzés kulcsszerepet játszikvesefibrózis [41,42]. Western blot analízist végeztünk annak megállapítására, hogy a 6-BIO befolyásolja-e a MAPK jelátvitelét. A foszforilált ERK, JNK és P38 szintje emelkedett az UUO-banvesea kontroll alatt állókhoz képestvese(2B. ábra). A foszforilált ERK és JNK expresszióját szignifikánsan csökkentette a 6-BIO kezelés, míg a foszforilált p38 szint csökkenése elhanyagolható volt (2B. ábra).SMADés a MAPK jelátviteli útvonalak az UUO csoportban felfelé szabályozottak, amit a6-BIOkezelés (2C. ábra). Számos transzkripciós faktor vesz résztvesefibrózisés kulcsszerepet játszanak a downstream génexpresszió szabályozásában. A 2D. ábra azt mutatja, hogy 7 napos obstrukció után a PC-JUN, PC-FOS és SP-1 fehérjék expressziója megnövekedett aveseUUO-ban szenvedő patkányok esetében a kontrollokhoz képest, és ezt a növekedést a 6-BIO-kezelés csökkentette. Hasonlóképpen, az AP-1 és SP-1 kifejeződése, a fontos transzkripciós faktorokvesefibrózissal kapcsolatos gének, jelentősen megnőttveseUUO-ban szenvedő patkányok esetében, de a 6-BIO-val végzett kezelés gyengítette (2E. ábra). A 2F. ábra a PC-JUN, PC-FOS immunfluoreszcens festését mutatja. és SP-1. A PC-JUN, PC-FOS és SP-1 festődés vörös fluoreszcenciája szignifikánsan megnőtt az akadályozottvese, a kontrollokhoz képest, és csökkent a 6-BIO kezelés. Ezek az eredmények megerősítik, hogy az AP-1 és SP-1 fontos transzkripciós tényezőkvesefibrózis, és6-BIOcsökkenhetvesefibrózist a transzkripciós aktivitásuk gyengítésével.
A 2. részhez kattintson a gombraitt.
