1. rész A krónikus vesebetegség és az öregedés eltérően csökkenti a csontanyagot és a mikroarchitektúrát C57Bl/6 egerekben

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

A krónikus vesebetegség és az öregedés eltérően csökkenti a csontanyagot és a mikroarchitektúrát C57Bl/6 egerekben

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Bate Lauman5, Ted , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1 Gépészmérnöki Tanszék, Colorado Egyetem, Boulder, CO

2 Ortopédiai Sebészeti Osztály, Kaliforniai Egyetem, San Francisco, CA

3 Gépészmérnöki Tanszék, Utah Egyetem, Salt Lake City, UT

4 Orvosbiológiai Mérnöki Tanszék, Észak-Karolinai Egyetem, Chapel Hill, NC

5 Orvosbiológiai Mérnöki Tanszék, The College of New Jersey, Ewing, NJ

6 Advanced Light Source, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA

7 Anyagtudományi és Mérnöki Tanszék, Cornell Egyetem, Ithaca, NY

8 Biomérnöki Tanszék, Colorado Egyetem, Denver, CO

9 Gépészmérnöki Tanszék, Colorado Egyetem, Denver, CO

10 Biokémiai és Molekuláris és Sejtbiológiai Tanszék, Georgetown Egyetem, Washington DC

11 Ortopédiai Tanszék, Colorado Egyetem Orvostudományi Kar, Aurora, CO *Kaliforniai Berkeley Egyetem – Kaliforniai Egyetem, San Francisco Biomérnöki Graduate Program, San Francisco, CA

# Kutatási osztály, Speciális Sebészeti Kórház, New York, NY

A Cistanche segíthet a vesebetegségben

Absztrakt

A krónikus vesebetegség (CKD) az öregedéssel járó gyakori betegség, és önmagában az előrehaladott kor felett növeli a törések kockázatát. Az öregedés és a CKD eltérően rontja a csontcserét és a mineralizációt. Feltételezzük tehát, hogy a csontminőség romlása az idős kor és a CKD kombinációja esetén lenne a legnagyobb. Fiatal felnőtt (6 hónapos), középkorú (18 hónapos) és idős (24 hónapos) hím C57Bl/6 egerek csontjait értékeltük három hónappal az 5/6. nephrectómia után, hogy CKD-t vagy ál-eljárást váltsunk ki. A CKD súlyosbította az öregedéssel összefüggő kérgi és trabekuláris mikroarchitektúra elvesztését. Az öregedés és a CKD vékonyabb, porózusabb kéregeket és kevesebb és vékonyabb trabekulát eredményezett. A csontanyag minősége szintén csökkent a CKD miatt, és ezek a csontanyagban bekövetkezett változások különböztek az életkorból adódó változásoktól. Az öregedés csökkentette a teljes csont hajlítószilárdságát és modulusát, a mikrométeres méretű nanobenyomódási modulust, valamint a nanométeres léptékű szövet- és kollagéntörzseket (kis szögű röntgenszórás (SAXS)). Ezzel szemben a CKD csökkentette a munkát a törésig, valamint a csontszövet modulusának és összetételének változását (Raman-spektroszkópia), és növelte a kollagén törzs százalékos arányát. A megnövekedett kollagén törzsterhelés a CKD-ben a szívósság elvesztésével járt. Ezenkívül a Sham egereknél az oszteocita hiányosságok kisebbek, ritkábbak és rendezetlenebbek lettek az életkor előrehaladtával, de ezek az életkorral összefüggő változások nem voltak egyértelműen megfigyelhetők CKD-ben. A CKD esetében azonban a nagyobb hiányosságok pozitívan korreláltak a megnövekedett szérum foszfátszinttel, ami arra utal, hogy az oszteociták szerepet játszanak a szisztémás ásványi anyagok homeosztázisában. Ez a munka azt mutatja, hogy a CKD csökkenti a csont minőségét, beleértve a mikroarchitektúrát és a csontanyag tulajdonságait, és hogy a csontminőség romlása az életkorral együtt jár a CKD-vel. Ezek az eredmények segíthetnek abban, hogy összeegyeztessék azt, hogy a csonttömeg miért nem jósolja meg következetesen a törést a CKD-populációban, valamint azt, hogy az idősebb CKD-ben szenvedő egyének miért vannak kitéve a törékenység kockázatának.

Kulcsszavak: CKD; öregedés; csont minősége; csont törékenysége; kollagén

1. Bemutatkozás

A krónikus vesebetegség (CKD) a becslések szerint az idősek 23-36 százalékát érinti, és a csonttörések és a törésekkel összefüggő halálozás fokozott kockázatával jár (1,2). Bár a csonttömeg csökkenése (kétenergiás röntgenabszorpciós méréssel mérve) a CKD minden szakaszában előrevetíti a jövőbeli törést, az alacsony csonttömegű és CKD-vel rendelkező idősebb egyének nagyobb valószínűséggel törnek, mint az alacsony csonttömegű és egészséges vesék. funkció (3). A csonttörés kockázata általában megnő a krónikus vesebetegség esetén, mint az öregedés önmagában okozott hatásainál (4,5). Például egy hároméves vizsgálatban a 40–65 év közötti, közepesen vagy végső stádiumú CKD-ben szenvedő egyéneknél 1,7–5,1-szeresére nőtt a törések gyakorisága az életkornak megfelelő kontrollokhoz képest, míg a 65 év felettieknél a CKD továbbra is növelte az előfordulási gyakoriságot. a törés 1,8-4,3-szorosa a kontrollokhoz képest (4).

trabekuláris csont mikroarchitektúra (10, 13), míg mások nem számoltak be változásról a kontrollhoz képest (9). Bár ezek a vizsgálatok különböznek a rágcsálók faja és törzse, a CKD kiváltásának módszere és a mért eredmények tekintetében, ezek a korábbi munkák jelentős bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a CKD megváltoztatja a csontminőséget.

Számos kulcsfontosságú kérdés maradt még azzal kapcsolatban, hogy a CKD hogyan rontja a csontminőséget, hogy a csontminőség mennyiben tudható be az ásványi vagy szerves fázis hibáiból, valamint arról, hogy a csontminőség változásai hogyan befolyásolják a csontszövet szívósságának csökkenését. Nevezetesen, bár néhány tanulmány változást azonosított a kollagén keresztkötéseiben és a szövet érettségében (azaz a csontképződés óta eltelt idő) CKD-ben, nem ismert, hogy a CKD megváltoztatja-e a kollagénrostok nanoméretű kölcsönhatásait a mechanikai terhelés során, és hogy ezek a nanomechanikai változások befolyásolják-e az egészet. -csontok szívóssága (11, 12). Tágabb értelemben még nem számoltak be a CKD-re adott válaszként a csontminőségben és a mechanikában bekövetkezett változásokról a nano- és a teljes csonthosszú skálákról.

Az oszteocita szerepe a CKD és az öregedés csontminőségének befolyásolásában szintén bizonytalan. Ezek a sejtek abnormálisan viselkednek azáltal, hogy a CKD progressziójának korai szakaszában jelentősen megnövelik az FGF23 expressziót (7, 14). Az oszteocita nélkülözhetetlen a csontanyag minőségének fenntartásához és a csonttörésekkel szembeni ellenállás szabályozásához (15–17). Az oszteociták egészségét részben a lacunáris morfológia jelzi. Az oszteocita lacunáris morfológiája megváltozik, ha az oszteocita részt vesz az ásványi homeosztázisban, például a laktációban (18, 19) és az x-kapcsolt hipofoszfatémiában (20). A lakunáris geometriák kisebbé, ritkábbá és rendezetlenebbé válhatnak mind az öregedés, mind a használaton kívüliek következtében (21–23). Az osteocyta lacunáris morfológiájában a CKD-vel kapcsolatos változások befolyásolhatják a csontszövet törzseit, a szerkezeti integritást és az oszteociták mechanoszenzitivitását (24). Egyelőre nem ismert, hogy a CKD befolyásolja-e az oszteocita lacunáris morfológiáját, és hogy ez a kapcsolat változhat-e az öregedéssel.

Bár a leggyakoribb CKD-populációk közé tartoznak az idősebb felnőttek, az öregedés és a CKD együttes hatásait a csontminőségre még nem vizsgálták. Korábbi kutatások kimutatták, hogy az öregedés csökkenti az egész csont modulusát, szilárdságát és a hajlításkor bekövetkező töréseket (25), a törési szívósságot (26), a kérgi és trabekuláris csont mikroarchitektúráját (27–29), valamint növeli az ásványianyag-tartalmat és az érettséget (30, 31). A csontban az öregedéssel járó változások zavaróak, és több hosszúságú skálán fordulnak elő, az egész csont mechanikáját a csontszövet anyagában és szerkezetében bekövetkező változások befolyásolják. A csontanyag és a csonttérfogat életkorral összefüggő változásait részben a csökkent csontszövet-forgalom (azaz magasabb szöveti érettség) és a csont többsejtű egységében kialakuló negatív egyensúly befolyásolja (30,32). Az ilyen életkorral összefüggő változások ellentétben állnak a CKD esetén gyakran előforduló abnormális csontforgalommal és mineralizációval. A mikroarchitektúra elvesztése negatív egyenleggel függ össze, ami az öregedéssel várható, és előfordulhat CKD-ben (9, 10, 13). A szövetek érettsége azonban növekszik az öregedéssel, és csökken a nagy forgalmú CKD összefüggésében. Jelentős hiányosságok vannak a CKD-ben előforduló csonttörékenység alapjainak megértésében, valamint abban, hogy az öregedés és a CKD kombinálva hogyan csökkenti a csontminőséget és a törésekkel szembeni ellenállást. Az öregedés és a CKD csontminőségre gyakorolt ​​együttes hatásainak tisztázása pótolná ezeket a tudásbeli hiányosságokat.

Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja az öregedés és a CKD együttes hatását a csontminőségre, nano- és egész csonthosszú skálákon keresztül, a CKD sebészeti modelljében idősödő egerekben. Feltételeztük, hogy a CKD és az öregedés egyaránt csökkenti a csontminőséget, de ez a két tényező eltérően és negatívan befolyásolja a csontszövet anyagi tulajdonságait. Feltételeztük továbbá, hogy az idős kor és a CKD együttes hatásai a leginkább károsak a csontminőségre. E hipotézisek kiértékeléséhez fiatal felnőtteknél felmértük a csontminőséget, beleértve a kortikális és trabekuláris mikroarchitektúrát és a kortikális csontanyag tulajdonságait, 5/6-os nephrectómia (5/6 Nx) vagy színlelt műtétek által kiváltott CKD-ben szenvedő idős egereken keresztül.

Cisztancháról

2. Módszerek

2.1 Állatmodell és minta-előkészítés

A hím C57Bl/6 egereket a National Institute on Aging teleptől szereztük be 3, 15 és 21 hónapos korukban. Az egereket 12-h világos / 12-h sötét ciklusban tartottuk, külön-külön polikarbonát ketrecekben tartottuk standard ágyneművel, Harlan Teklad 2920X táppal etették, és szabad hozzáférést biztosítottunk a vízhez. Mindhárom életkorban az egereket véletlenszerűen CKD vagy Sham csoportokba soroltuk. A CKD csoportban kétlépcsős nephrectomia történt. Ezeket az eljárásokat korábban leírták (33). Röviden, a bal veséhez egy középvonali bemetszésen keresztül fértek hozzá, dekapszulázták, hogy elkerüljék az ureter és a mellékvese károsodását, majd eltávolították. Egy héttel később a jobb vesét dekapszuláztuk, és a felső és alsó pólust részben reszekáltuk, hogy a vese térfogatát 2/3-ra csökkentsék. A kontrollcsoport ál-eljárásokat (vagyis középvonali metszést, vesekárosodás nélkül) kapott ugyanezen időkereten belül. Az egereket 1,5 százalékos izofluránnal érzéstelenítettük az eljárások során. A posztoperatív adag buprenorfint (0,5 mg/ttkg) adták be ezen eljárások után és a gyógyulás előtt, valamint 12 óránként a következő két napon. Az egereket három hónap múlva CO2-vel és nyaki diszlokációval elaltatták. A vizsgálat végpontjában az egerek 6 (fiatal felnőtt; ál: n=6, CKD: n=7), 18 (középkorúak; Ál: n=8; CKD: n { {25}}), és 24 (régi; álságos: n=8; CKD: n=8) hónapos. Az összes állatkísérletet jóváhagyta a Colorado Denveri Egyetem Állathasználati és Gondozási Intézményi Bizottsága.

A bal combcsontot, a sípcsontot, a felkarcsontot, a sugárcsontot és a singcsontot a csontminőség elemzésére tartottuk fenn. A bal sípcsontot 70 százalékos etanolban 4 °C-on konzerváltuk. Az összes többi csontot foszfáttal nedvesített gézzel tekertük, és –20 °C-on tároltuk az elemzésig.

2.2 A szérum és a vizelet kémiája

A vizsgálat végpontján gyűjtött véren és vizeleten szérum biokémiai elemzéseket végeztek. A szérum- és vizelet-karbamidot, valamint a szérum foszfát-, kalcium- és PTH-koncentrációkat a gyártó utasításai szerint mértük (BioAssays Systems, illetve Immunotropics).

2,3 mikroCT

A mikroarchitektúrát a combcsont középső részének kérgi csontjára és a proximális sípcsont trabekuláris csontjára microCT-vel értékelték minden vizsgált egérnél (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Svájc). A combcsontokat egy éjszakán át 4 °C-on leolvasztották a szkennelés előtt. A szkennelést 10 µm-es voxelmérettel végeztük, a korábban ismertetett adatgyűjtési és elemzési módszereket követve (10). A kérgi paraméterek a következők voltak: csonttérfogat / teljes térfogat (BV/TV), csontterület / teljes terület (BA/TA), kortikális porozitás (Ct. Po), kérgi vastagság (Ct. Th), teljes ásványi sűrűség (TMD), egy pillanat A tehetetlenség a mediális laterális tengely körül (IML), a centroid és a csontfelszín közötti távolság elülső-hátul irányban (C), valamint a poláris tehetetlenségi nyomaték (pMOI) (34). A trabekuláris paraméterek közé tartozott a trabekuláris szám (Tb.N), a trabekuláris távolság (Tb.Sp), a trabekuláris vastagság (Tb.Th), a csonttérfogat (BV), a teljes térfogat (TV), a csonttérfogat / teljes térfogat (BV/TV), volumetrikus csont ásványi sűrűség (vBMD) és kapcsolódási sűrűség (Conn.D). A microCT-t követően a combcsontokat ismét foszfáttal nedvesített gézbe csomagoltuk, és –20 °C-on tároltuk a későbbi teljes csont mechanikai jellemzéséhez.

2.4 Az egész csont mechanikai és anyagi tulajdonságai

A microCT-t követően a bal combcsont hárompontos meghajlításon esett át (Insight II Material Testing System, 250 N mérőcella, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). A combcsontokat foszfáttal pufferolt sóoldattal nedvesített gézről eltávolítottuk, és 5 mm/perc elhajlási sebességgel, 8 mm-es fesztávolságú egyedi üllőn teszteltük. A terhelés-elmozdulás görbéit elemezték a mechanikai tulajdonságok szempontjából, beleértve a merevséget, a maximális terhelést, az elmozdulást maximális terhelésnél, az energiát a maximális terhelésnél, a terhelést a hozamnál, az elmozdulást a folyásnál, az energiát a hozamnál, a hozam utáni elmozdulást, a töréskori terhelést, a töréskori elmozdulást, és a törési energia. A folyáshatár a kezdeti érintőmerevséghez képest 10 százalékos lejtéssel megrajzolt metszésvonal és a terhelés-elmozdulás görbe metszéspontjaként lett meghatározva. A µCT-ből származó IML és C segítségével megbecsültük az anyag tulajdonságait, beleértve a hajlítási modulust, a folyási feszültséget, a végső feszültséget és a szívósságot a hárompontos hajlítási adatokból, szabványos sugárhajlítási egyenletekkel, amelyeket az egér combcsontjára alkalmaztunk (35).

2.5 A proximális sípcsont merevségének végeselemes elemzése

A csont mechanikai viselkedésének vizsgálatához számítási végeselem (FE) modellezést alkalmaztunk a proximális sípcsont tengelyirányú összenyomódásának szimulálására minden modellben. A proximális sípcsontot azért választottuk, mert a sípcsont egerekben teherhordó szerkezet, és a csontok tulajdonságainak mikroCT használatával végzett elemzésének gyakori helye. A proximális sípcsont (kortikális és trabekuláris csont) mikroCT-képadatait 16-bites DICOM-képszeletekként exportálták a tárgyspecifikus végeselem-modellek további szegmentálása és felépítése céljából. A DICOM képadatokat a Mimics Innovation Suite 18-ba (Materialise, Leuven Belgium) importáltuk képfeldolgozás és szegmentálás céljából, hogy megfelelő FE-modellt hozzanak létre a microCT-vel elemzett csont ugyanazon proximális sípcsont-régiójához. A csontszövetet a képen látható többi szövettől 313 mg/cm3 (36,37) szegmentációs küszöb alkalmazásával választottuk el. Miután a csontrégiót szegmentáltuk, az alany-specifikus FE hálót exportáltuk, amely mind a kortikális, mind a trabekuláris kompartmentet tartalmazta. Az FE modell hatszögletű FE hálót használt, 10 µm izotróp elemmérettel.

A Mimics-ből exportált FE hálókat az ABAQUS CAE 6.9-be importáltam az anyagtulajdonságok hozzárendeléséhez, a peremfeltételek alkalmazásához és az axiális mechanikai terhelés szimulációjához. A csont anyagi tulajdonságait homogénnek, izotrópnak és lineárisan rugalmasnak határozták meg (Young-féle modulus, E= 10 GPa és Poisson-arány, v= 0.3). Az axiális kompresszió szimulálásához rögzített határfeltételt alkalmaztunk a csont alsó felületén lévő csomópontokra, és 5 μm-es lefelé elmozdulást (0,5 százalék a csontszegmens magasságának) alkalmaztunk a csomópontokra a csont felső felülete. A csont szerkezeti merevségét az alkalmazott elmozdulás alatti reakcióerő (N) alapján számítottuk ki.

2.6 Kis szögű röntgenszórás

A kollagénrostok deformációját a kombinált ulnae és sugarak egytengelyű feszültségtesztje során szinkrotron kisszögű röntgenszórás (SAXS) segítségével mérték a 7.3.3 sugárvonalnál az Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA)-nál (38). A csontokat ragasztóval és csiszolópapírral rögzítettük a disztális és proximális végükön lévő bilincsek között. Az érzéketlenségi vizsgálatokat a TST35{11}} szakítószilárdsági teszttel (Linkam Scientific Inc.) végeztük hidratált mintákon, 2,5 µm/s elmozdulási sebességgel. A vizsgálat során a csontdiafízist 10 keV-os röntgensugárzásnak tették ki 0,1 másodpercig 5 másodpercenként. A teljes sugárzást 30 kGy-ra korlátozták, hogy csökkentsék a mechanikai teljesítményre gyakorolt ​​hatásokat (39). A kollagén d-távolsága, amely a kollagén szuperstruktúrán belüli ismétlődő résrégiókat reprezentálja, kiemelkedő Bragg-diffrakciós csúcsként jelenik meg a SAXS mintában. A kollagén-specifikus deformációt a szakítóvizsgálat során a Bragg-csúcsok növekvő terhelés melletti eltolódásának követésével mértük. Egy egyedi LabVIEW program segítségével a szórási mintázatban bekövetkezett progresszív változást kollagénrostok törzsté alakították át, a d-távolságra normalizálva nulla terhelésnél, amint azt korábban tárgyaltuk (40). A szöveti stresszt a tesztelési szakaszban felvett erők és a vizsgált csontok keresztmetszeti terület mérésének hányadosa alapján számítottuk ki. Az ulna és a sugár összegzett keresztmetszeti területeit az ulna hosszának középpontjától fényes térvisszaverő képalkotással (Leica DM, 20x objektív) mértük, és ImageJ-vel (41) számszerűsítettük. A teljes csontszövet törzseit egy egyedi Digital Image Correlation (DIC) MATLAB csomaggal nyertük, amely a vizsgálat során követte és mérte a távolságokat a csontmintán elhelyezett pontrács között. A kapott DIC-törzseket szöveti szintű feszültségekkel kombináltuk, hogy standard feszültség-nyúlás görbéket hozzunk létre. Ezekből a görbékből kivontuk a lineáris rugalmassági modulust, valamint a folyási feszültséget és a folyási alakváltozást a 0,2 százalékos eltolási folyáshatár által meghatározottak szerint. A szöveti törzset a SAXS kollagén törzseihez időzítettük hozam és maximális feszültség mellett, hogy összehasonlíthassuk a feszültséget hordozó komponenseket a csonttal a deformáció során.

Az ulna/radius kompozit ellenőrzött analízisét a szakítóteszt során úgy végeztük, hogy a digitális fényképezőgép képeiből származó szöveti szintű feszültséget a röntgenszórási mintázatokból számított feszültségekkel párosították. A digitális videókat két képzett megfigyelő egymástól függetlenül felülvizsgálta törés és szövetelcsúszás (pl. az ulna és a sugár közötti elcsúszás) szempontjából. Ezeket az eseményeket azután a deformációs görbékhez igazítottuk, és az összes feszültség-nyúlás adatot az első töréshez csonkoltuk. Az elemzés során csak az első törésig tartó adatokat vettük figyelembe. A mintákat kizártuk, ha a húzómarkolat és a csontok között csúszás volt, vagy ha az első törés előtt bekövetkezett sugár között elcsúszott. A mintákat is kizártuk, ha a szöveti és a SAXS deformációs görbék között gyenge volt az egyezés, ami azt jelzi, hogy a nyalábfolt az ulnára fókuszált, de a törzs nagy része átkerült a sugárba.

2.7 A csontszövet összetételének és modulusának mikroméretű, helyszín szerinti értékelése

Hárompontos hajlítást követően a combcsontokat szövettanilag dehidratáltuk etanol fokozatos sorozatában, acetonban tisztítottuk, és PMMA-ba ágyaztuk. A beágyazott csontokat a combcsont középső tengelyénél kis sebességű gyémántfűrésszel (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL) metszették. A mintákat nedves szilícium-karbid papírral (60{{10}} és 1200 szemcseméretű) csiszoltuk, majd alumínium-oxid pasztákkal (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 µm) políroztuk. és Rayon finom ruhákat (South Bay Technologies, San Clemente, CA) 0,05 µm-es végső felületre. A mintákat ultrahanggal kezeltük az egyes polírozási lépések között.

A Raman-spektroszkópiát a kérgi vastagságra kiterjedő térképeken végezték el egy egyedi rendszerrel: egy Renishaw inVia konfokális mikroszkópos rendszerrel (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, Egyesült Királyság) 785 nm hullámhosszú lézerfénnyel, amelyet száloptikai kábeleken keresztül vezettek egy 5{ {4}}x objektív (NA 0,75) nanoindenteres Z-fokozatra szerelve (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Minden helyhez 10 10-másodperces expozíció halmozódott fel. A három, egymástól 15 µm távolságra lévő bemélyedésből álló sorok 10 µm-enként haladtak át a kérgi vastagságon.

A fluoreszcens alapvonalat 11. rendű polinomillesztéssel kivontuk, és a kozmikus sugarakat a Renishaw WIRE szoftverrel távolítottuk el. Minden pontból kivontunk egy referencia PMMA spektrumot egyéni MATLAB kóddal. Ezeket a korrigált spektrumokat ezután prolinra (855 cm-1), ν1-foszfátra (961 cm-1) és ν1-karbonátra (1071 cm-1) elemeztük. Ezután kiszámították az ásványianyag: mátrix (foszfát: prolin) területarányait,

karbonát: foszfát és kristályosság (a v1 foszfátcsúcs teljes maximális magasságánál a félszélesség fordítottja).

Ezután a Raman-spektroszkópiával értékelt helyekhez illeszkedő helyeken nanoindentációt végeztünk. Egy 5 µm-es gömb alakú hegy 30 nm/s sebességgel mélyítette a csontot, amíg a maximális 500 nm mélységet nem kaptuk. Ezt a mélységet 120 másodpercig tartottuk, hogy lehetővé tegyük a viszkoelasztikus energia disszipációját. A redukált modulust (Er) Oliver-Pharr analízissel számítottuk ki, figyelembe véve a tehermentesítési görbe első 45 százalékát (42,43).

2.8 Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia

A humerust az összes lágyszövetből kimetszették, és a csontvelőt vízzel eltávolították. A Humeri-t C, majd centrifugáltuk a feleslegben lévő HCl elpárologtatására. A szűrt mintákat 1:5 arányban hígítottuk 10 százalékos acetonitrilben és 0.05 százalékos heptafluorvajsavban (HFBA), fordított fázisú Gemini-NX C{{7} } oszlopban (Phenomenex, Torrance, CA), és a hidroxi-lizil-piridinolin (HP), lizil-piridinolin (LP) és pentozidin térhálósítására elemezték, összhangban a Bank és munkatársai által leírt módszerekkel (44). A HPLC-rendszer részleteit (126-os modell, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) részletesen ismerteti Oren és munkatársai (45). A kollagén keresztkötések szétválasztása a következő protokoll szerint történt: 15 perc. 24% metanolt és 0,15% HFBA-t tartalmazó oldószerből 10 perc. 40% metanolt és 0,05% HFBA-t tartalmazó oldószert és 10 percet. 75% acetonitrilt és 0,1% HFBA-t tartalmazó oldószert. Az oszlopot 24% metanolban és 0,15% HFBA-ban ekvilibráltuk legalább 10 percig. mintafuttatások között. A kollagén keresztkötési csúcsait fluoreszcens detektorral (FP1520, JASCO; Easton, ML) mértük. A gerjesztési és emissziós hullámhossz 295 nm, illetve 400 nm volt a HP és LP esetében. A pentosidint 328 nm-es gerjesztéssel és 378 nm-es emisszióval detektáltuk. A kalibrációs görbéket egy tisztított HP-t és LP-t (Quidel Corporation) és pentozidint (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) tartalmazó kalibrátor öt hígításának mért intenzitásából állítottuk elő.

A keresztkötési koncentrációkat ezután a kollagén koncentrációjára normalizáltuk. A kollagént a keresztkötések szempontjából elemzett mintán belüli hidroxiprolin-koncentráció alapján becsültük meg. A keresztkötések szempontjából elemzett minta egy alikvot részét 1:50 arányban hígítottuk, és 9-fluoronil-metil-kloroformiáttal (46) derivatizáltuk. A következő oldatokat használtuk az aminosav protokollhoz (1) 20 mM citromsav, 5 mM tetrametil-ammónium-klorid és 0,01% nátrium-azid, pH 2,85; (2) 20 mM nátrium-acetát, 5 mM tetrametilammónium-klorid és 0,01 % nátrium-azid, pH 4,5, és (3) 100 % acetonitril. A gradiens elúciós profil a következő: 0-11,5 perc. gradiens 75 százalék (1) / 25 százalék (3) 60 százalék (1)/40 százalék (3), 13 percnél. váltás 64 százalékra (2) / 36 százalékra (1), 13,1 -18 percről. 64 százalék (2) / 36 százalék (3) gradiens 62 százalék (2) / 38 százalék (3), majd 18 percnél. 25 százalék (2) / 75 százalék (3) váltás a 23 perces futtatás végéig. Az oszlopot legalább 10 percig 75 százalék (1) / 25 százalék (3) egyensúlyba hoztuk. mintafuttatások között. Az aminosavcsúcsokat 254 nm-es gerjesztésnél és 630 nm-es emissziónál követtük. Kalibrációs görbét állítottunk elő egy kollagén-hidrolizátumból előállított aminosavstandard öt hígításából (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). A kollagénben állandó a hidroxiprolin koncentráció, így a hidroxiprolin koncentrációja kollagénkoncentrációvá alakult át (285 mol hidroxiprolin per mol kollagén).

2.9 Fluoreszcens AGE-k mérése

A fluoreszcens AGE értékeket minden mintában fluorometriás vizsgálattal határoztuk meg, amely a csontszövet tömeges endogén fluoreszcenciáját hasonlítja össze egy kinin standarddal. A HPLC-hez belső standarddal újraszuszpendált hidrolizált csont alikvot részét ionmentes vízzel hígítottuk 1,6 ug csont/ml oldat koncentrációra. A hígított hidrolizátum és a sorozatban hígított kinin törzsoldat (törzs: 10 ug kinin/ml 0,1 N H2SO4) fluoreszcenciáját egy 96-lyukú lemezen (3370. számú termék, Corning) mértük. többmódusú mikrolemez-olvasó (Synergy H1, BioTek) 360 nm-es gerjesztésnél és 460 nm-es emissziónál.

A tömeges fluoreszcens AGE-ket a csontszövet kollagéntartalmára normalizáltuk hidroxiprolin kolorimetriás vizsgálattal. Röviden, a hidrolizátumot tovább hígítottuk a μ/ed hidroxiprolin törzsoldathoz (200 µg L-hidroxiprolin/ml 0,001 N HCl). A hígított hidrolizátumhoz klór-T-t adtunk a reakció megindítására, és az oldatokat 20 percig inkubáltuk. szobahőmérsékleten. A reakciót 3,15 M perklórsav hozzáadásával állítottuk le, és 5-perc elteltével. Az inkubálást szobahőmérsékleten p-dimetil-amino-benzaldehidet adtunk hozzá. Ezután az oldatot 60 fokos vízfürdőben 20 percig inkubáltuk, majd hideg vízben sötétben szobahőmérsékletre hűtöttük. A minták és a standardok abszorbanciáját 570 nm hullámhosszon mértük mikrolemez-leolvasóval. A fluoreszcens AGE-kat ng kinin fluoreszcencia/mg kollagén egységekben adták meg.

2.10 3D osteocyta lacunar geometria

A bal sípcsontot szövettanilag dehidratáltuk etanol fokozatos sorozatában, és 1 százalékos bázikus fukszinnal festettük (47). A sípcsontokat ezután acetonnal megtisztítottuk, és poli(metil)metakrilátba (PMMA) ágyaztuk. A beágyazott mintákat kis sebességű fűrésszel (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL) keresztirányban metszettük 1 mm-re a sípcsont-fibula találkozástól proximálisan. A disztális szakaszból 200 um megcélzott vastagságú köszörült szakaszt készítettünk (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

A talajszelvények leképezését átvitel közben Zeiss LSM 710 konfokális lézeres pásztázó mikroszkóppal, 555 nm-es gerjesztéssel, 568–1000 nm-es sávszűrővel és 40-szeres olajimmerziós objektívvel végeztük. A felbontás x, y és z irányban 0,447 és 0,493 µm volt. Függőleges z-halmazokat kaptunk az oszteocita lacunák látható tartományán keresztül (50–100 µm képalkotási mélység). Az oszteocita lacunák 3D-s képeit készítettük és elemeztük a lacunáris geometriákat a nyílt forráskódú 3D Osteocyte Lacunae Analysis program és a MATLAB v17 segítségével (21). ). Röviden, a z-veremen belüli minden 2D kép automatikusan szegmentálva lett, hogy meghatározza a hézagokat, amelyeket azután 3D-ben rekonstruáltak. A legjobban illeszkedő ellipszoidok alapján a réseket a térfogat, a felület, a legközelebbi tömegközéppont, a gömbölyűség (a legkisebb és a legnagyobb lacunáris sugarak aránya, ahol 1=gömb), a théta szélessége (az eltérés különbségének abszolút értéke) alapján elemeztük. 3D vektor, amely leírja a főtengely irányát az összes rés átlagos irányából, az ellapultságot (−1=tökéletesen prolate, 1=tökéletesen lapított) és a lacunáris számsűrűséget (oszteociták száma/képtérfogat).

2.11 Adatelemzés

Az adatokat az átlag ± az átlag standard hibájaként adjuk meg. A Raman-spektroszkópiából és a nanoindentációból származó minden egyes tömb esetében úgy átlagoltuk, hogy minden csontnak egy értéke legyen minden mikroméretű méréshez. Hasonlóképpen, minden egyes tömbre standard deviációt számítottunk, hogy megbecsüljük a mikroméretű csontszövet térbeli variabilitását. Az öregedés és a CKD hatásait, valamint ezek kölcsönhatását minden paraméterre kétutas ANOVA-val teszteltük. A függő változókat szükség esetén transzformáltuk, hogy kielégítsük a maradék normalitásra és homoszkedaszticitásra vonatkozó feltételezéseket. A fő hatások szignifikanciáját apriori p < 0.05-re="" állítottuk="" be.="" az="" életkor="" és="" a="" ckd="" közötti="" szignifikáns="" kölcsönhatás="" esetén="" post-hoc="" tesztet="" végeztünk="" a="" ckd="" hatásának="" vizsgálatára="" az="" egyes="" életkorokon="" belül.="" ezeknél="" az="" utólagos="" elemzéseknél="" a="" bonferroni-korrigált="" alfa="" segítségével="" egy="" családi="" hibát="" sikerült="" kivédeni,="" ami="" 0.05="" 3="0.017" kritikus="" alfa-értéket="" eredményezett.="" azokat="" az="" eredményeket,="" ahol="" az="" egyszerű="" hatás-összehasonlítások="" p-értéke="" 0,017="" és="" 0,05="" között="" volt,="" nem="" szignifikánsnak="">

Lineáris regressziót végeztünk annak tesztelésére, hogy a nano-mikroméretű csontminőségi mérések előrejelzik-e a teljes csont mechanikai szívósságát. Mivel az egész csont mechanikai tulajdonságai erős korfüggőséget mutatnak, ez a lineáris regresszió az életkort mint kovariánst tartalmazta. A Spearman-korrelációkat az oszteociták lacunáris geometriájára és a szérum- és vizeletkémiai mérésekre, valamint a PTH-ra és a mikroméretű csontminőség mérésére is értékelték. A lineáris regressziók és korrelációk szignifikancia értéke p < 0,05.="" minden="" elemzéshez="" a="" minitab-ot="" (v17)="">

A kiugró értékeket Grubbs-teszttel azonosítottuk (szignifikancia szint=0.05). Számos kiugró értéket kizártak a szérumkalcium- és karbamidelemzésekből. A 24-month Sham és a CKD egy-egy kiugró értéket kizártunk minden kortikális és trabekuláris mikroarchitektúra elemzésből, valamint a FEA elemzésből. Egy kiugró értéket kizártak a 24-hónapos CKD-csoportból az LP-elemzésnél, egy kiugró értéket pedig a 24-hónapos Sham-csoportból a szívósság, a töréstől a törésig és a termés utáni elmozdulásig. Egy külön 24-hónapos Sham outliert találtak a nanobenyomódási modulus szórására és a kristályosság szórására.