2. rész: A cirkadián gén epigenetikai szabályozása A Per1 hozzájárul az életkorral összefüggő változásokhoz a hippocampális memóriában

Kapcsolat: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Kattintson ide az 1. részhez

A Per1 leütése hosszú távon károsítjamemóriafiatal egerekben.Ezt követően annak tesztelésére, hogy szükséges-e hosszú távon a Per1 felszabályozása a dorsalis hippocampusbanmemória48 órával az 10-perces OLM tréning előtt a Per1-et célzó siRNS-t infundáltunk fiatal egerek dorsalis hippocampusába. A Per1 siRNS infúziója a PER1 fehérje szignifikáns csökkenését eredményezte a dorsalis hippocampusban, 2 órával az utolsó teszt után mérve (4d. ábra, 5. kiegészítő ábra). A PER1 fehérje viszonylag szerény leütése (~30 százalék) súlyosan károsodottmemóriaformáció az OLM számára; A Per1 siRNS-sel infundált egerek nem mutattak szignifikáns DI-növekedést a betanítás és a tesztelés között, és szignifikánsan kevésbé preferálták a mozgó objektumot a tesztelés során, mint a kontrollegerek (4e. ábra), és ez nem volt hatással a teljes objektum-felderítésre a teszt során (4f. ábra). és nincs különbség a mozgásban az edzés előtti szoktatás során (kiegészítő 8c. ábra). Ez most először bizonyítja, hogy a központi cirkadián óra gén lokális megszakítása szelektíven a hippokampuszon belül károsíthatjamemóriaképződés.

A Per1 túlzott kifejezése javulmemóriaöregedő egerekben. Végül,annak megállapítására, hogy a Per1 túlzott expressziója a dorsalis hippocampusban elegendő-e az életkorral összefüggő betegségek enyhítésérememóriakárosodások esetén a Per1-et két egymást kiegészítő módszerrel lokálisan felszabályoztuk. Először egy vad típusú Per1-et expresszáló lentivírust használtunk v5 epitópcímkével (pLVX-v5Per1) (5a. ábra, 6a. kiegészítő ábra). Annak igazolására, hogy ez a plazmid túlzottan expresszálja a Per1-et, HT22 sejteket transzfektáltunk pLVX-v5Per1 vagy pLVX-EV-vel, és mértük a Per1 mRNS expresszióját. Mind 24, mind 48 órával a transzfekció után a Per1 mRNS szignifikánsan megnövekedett a pLVX-v5Perl-gyel transzfektált sejtekben a kontroll plazmiddal transzfektált sejtekhez képest (5b. ábra). A pLVX-v5Per1 transzfekciója a Per2 mRNS-ének jelentős növekedéséhez is vezetett (a Period clock család tagja, amely kölcsönhatásba lép a Per1-gyel) 24 órán belül (kiegészítő 6b. ábra), bár ez a növekedés jóval kisebb volt, mint a Per1 megfigyelt növekedése (az időpontban). 24 óra, Per1: 466-szeres növekedés az EV-hez képest, Per2: 1.{37}}szeres növekedés az EV-hez képest). A Per1 túlzott expressziója azonban nem befolyásolta a legközelebbi downstream gén Hes7 transzkripcióját (kiegészítő 6c ábra).

Annak megállapítására, hogy a Per1 túlzott expressziója javul-ememóriaIdősödő egereken a pLVX-v5Per1-et infundáltuk a 18-mo egerek háti hippokampuszába 2 héttel a viselkedés előtt. A pLVX-v5Per1 egerek szignifikáns javulást mutattakmemóriaaz OLM-re a teszt során a pLVX-EV (üres vektor) kontrollokhoz viszonyítva (5c. ábra). Csak a pLVX-v5Per1 egerek mutattak szignifikáns növekedést a nyugalomban lévő mozgó objektum preferenciájában a képzéshez képest, és nem figyeltek meg csoportkülönbségeket a teljes feltárásban a teszt során (5d. ábra) vagy a szoktatás alatti mozgásban (kiegészítő 8d. ábra).

A viselkedést követően az állatok egy részéből származó hippocampális szövetet RNS-szekvenálásra dolgoztuk fel, hogy igazoljuk a pLVX-EV és pLVX-v5Per1 transzkriptumok jelenlétét a megfelelő csoportokban in vivo (7a, b, f, g kiegészítő ábra).

Ennek a megközelítésnek a kiegészítésére a CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) rendszert33 is alkalmaztuk a Per1 transzkripciós aktiválásának elősegítésére a dorsalis hippocampusban. Ez a rendszer három lentivírus komponensből áll: a katalitikusaninaktív Cas9 (dCas9) egy VP64 transzkripciós aktivációs doménhez fuzionálva egy GFP címkével (dCas9-VP64-GFP), egy módosított egyvezető RNS (sgRNS), amely a Per1-et célozza meg két MS2 RNS aptamerrel, amely képes toborozza a harmadik komponenst, egy MS2- kettős transzkripciós aktivátor (MS2-p65-HSF1) fúziós fehérjét(5e. ábra). A kontroll állatok egy kontroll sgRNS-t kaptak, amelyből hiányzott a 20 nukleotidból álló szekvencia, amely ahhoz szükséges, hogy a SAM-rendszert Per1-be irányítsák (ezt ctrl sgRNS-nek nevezzük). Ezeknek a komponenseknek a Per1-promóteren való összeszerelése lehetővé teszi, hogy a három effektor domén (VP64, p65 és HSF1) irányítsa a Per1 transzkripciót. Megerősítésképpen, az 5. ábra hatékonysága, a Per1 túlzott expressziója a dorsalis hippocampusban javítja az életkorral összefüggő károsodásokat az objektum elhelyezkedésébenmemória. a lentivírus konstrukció vázlata, amelyet a Per1 (pLVX-v5Per1) címkével ellátott v{{0}} túlexpressziójára használnak az üres vektorkontrollhoz (pLVX-EV) képest. b Per1 mRNS szignifikánsan megnövekedett 24 és 48 órával a pLVX-v5Per1 transzfekciója után HT22 sejtekben az EV-vel transzfektált sejtekhez képest (kétirányú ANOVA: Group x Timepoint interakció (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" sidak="" post="" hoc="" tesztjei,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-a="" plvx-v5per1="" hippocampális="" infúziót="" kapott="" anya="" egerek="" szignifikánsan="" jobb="" memóriát="" mutattak="" az="" olm-re,="" mint="" a="" plvx-ev="" kontrollvírussal="" kezelt="" egerek="" (kétirányú="" anova:="" vírus="" x="" munkamenet="" interakció,="" (f(1,29)="" {{34)="" }},15,="" p="">< 0,05),="" sidak="" post="" hoc="" tesztjei,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" minden="" férfi).="" d="" a="" teljes="" feltárás="" hasonló="" volt="" mindkét="" csoportban="" a="" teszt="" során="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" a="" per1="" transzkripció="" irányítására="" használt="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" rendszer="" vázlata.="" felül:="" a="" sam="" egyes="" összetevői.="" alul:="" a="" per1-promóteren="" összeállított="" komponensek,="" amelyek="" a="" per1-transzkripciót="" vezetik.="" f="" per1="" mrns="" szignifikánsan="" megemelkedett="" 48="" órával="" a="" crispr-sam="" komponensek="" transzfekciója="" után="" ht22="" sejtekben="" a="" kontroll="" sgrns-sel="" transzfektált="" sejtekhez="" képest="" (kétutas="" anova:="" group="" x="" timepoint="" interaction="" (f(1,8)="14).77)" ,="" p="">< 0,01),="" sidak="" post="" hoc="" tesztjei,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" egerek,="" amelyek="" a="" crispr-sam="" rendszer="" hippocampális="" infúzióját="" kapták="" a="" per1-et="" célzó="" sgrns-sel,="" szignifikánsan="" jobb="" eredményeket="">memóriaaz OLM esetében a kontroll sgRNS-sel rendelkező EV kontroll egerekhez képest (Kétirányú ANOVA: Vírus x Session interakció (F(1,30))=5.83, p < 0.05)="" ,="" sidak="" post="" hoc="" tesztjei,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" minden="" férfi).="" h="" a="" teljes="" feltárás="" hasonló="" volt="" mindkét="" csoportban="" a="" teszt="" során="" (t(30)="0.41," p="0.68)." az="" adatokat="" a="" crispr-sam="" rendszerben="" átlag="" ±="" sem-ként="" mutatjuk="" be,="" ht22="" sejteket="" transzfektáltunk="" mindhárom="" plazmiddal,="" 24="" vagy="" 48="" órával="" később="" összegyűjtöttük="" a="" sejteket,="" és="" mértük="" a="" per1="" mrns="" expressziót.="" a="" transzfekció="" után="" 48="" órával="" a="" per1="" mrns="" szignifikánsan="" megemelkedett="" a="" per1="" sgrns-t="" kapott="" csoportban="" a="" kontrollokhoz="" képest="" (5f.="" ábra),="" ami="" megerősíti,="" hogy="" a="" crispr-sam="" rendszer="" hatékonyan="" irányítja="" a="" per1="" mrns="" expresszióját.="" nem="" észleltünk="" változást="" sem="" a="" per2="" mrns="" (kiegészítő="" 6e.="" ábra),="" sem="" a="" hes7="" mrns="" (kiegészítő="" 6f.="" ábra)="" expressziójában,="" ami="" azt="" jelzi,="" hogy="" a="" crispr-sam="" rendszer="" a="" célgén,="" a="" per1="" szelektív="" túlzott="" expresszióját="" hajtja="">

Ezután a 18-mo egereknek intra-hippocampális infúziót adtak a CRISPR-SAM lentivírusokból (kiegészítő 6d. ábra), majd 2 héttel később az OLM-ben betanították őket. Amint azt a pLVX-v5Per1 túlzott expressziónknál megfigyeltük, a CRISPR-SAM által közvetített Per1 túlzott expresszió jelentősen javultmemóriateljesítmény Per1 sgRNS-sel infundált egerekben a kontroll állatokhoz képest (5g. ábra), anélkül, hogy befolyásolná a teljes feltárást (5h. ábra) vagy a szoktatás alatti mozgást (kiegészítő 8e. ábra). Csak a Per1 sgRNS-t kapó egerek mutattak szignifikáns növekedést a nyugalomban lévő mozgó objektum preferenciájában a képzéshez képest, ami sértetlenséget jelezmemóriaaz objektumok helyére (5g. ábra). A viselkedést követően az állatok egy részéből származó hippocampális szövetet RNS-szekvenálásra dolgoztuk fel, hogy megerősítsük a CRISPR-átiratok jelenlétét a megfelelő csoportokban in vivo (kiegészítő 7c-g ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a Per1 túlzott expressziója a dorsalis hippocampusban elegendő az életkorral összefüggő károsodások enyhítésére a hosszú távú objektum-helymeghatározási memóriában. A Per1 ezért kulcsfontosságú gén, amely kritikus a hosszú távú memória kialakulásában, amelyet a HDAC3 szabályoz, és károsodik az öregedő agyban.

Vita

Eredményeink azt mutatják, hogy a HDAC3 represszív hiszton-dezacetiláz törlése vagy megszakítása javíthatja az életkorral összefüggő károsodásokat mind hosszú távon.memóriaés szinaptikus plaszticitás. Ezenkívül a HDAC3 deléciója helyreállítja a Per1 cirkadián gén tapasztalat által kiváltott expresszióját a dorzális hippocampusban. Mivel a hippokampusz PER1 expressziója kritikus a hosszú távú memória kialakulásában (4. ábra), és a Per1 túlzott expressziója a hippocampusban javítja az életkorral összefüggő memóriazavarokat (5. ábra), a PER1 egy lehetséges mechanizmus, amelyen keresztül a HDAC3 deléciója javítjamemóriaés szinaptikus plaszticitás öregedő egerekben. Tágabb értelemben a Per1 életkorral összefüggő zavara összekapcsolhatja a hosszú távú memória és a cirkadián ritmus életkorral összefüggő károsodásait, a szerkezettől függően.

A jelenlegi tanulmány egyik kulcsfontosságú megállapítása az volt, hogy a hippocampalis LTP életkorral összefüggő károsodásait HDAC3 delécióval vagy megszakítással lehet javítani. Ez összhangban van a Sajikumar laboratórium legújabb munkájával, amely azt mutatja, hogy a HDAC3 farmakológiai blokádja javíthatja az asszociatív hippocampalis LTP34 életkorral összefüggő károsodásait is. Érdekes módon azt tapasztaltuk, hogy a régi HDAC3flox/flox és HDAC3(Y298H) állatokból származó szeletek nem érik el azt a potencírozási szintet, mint a fiatal HDAC3flox/flox vagy HDAC3(Y298H) állatok szeletei (2c, f ábra), ami arra utal, hogy az öregedő agy plaszticitási plafonja alacsonyabb lehet, mint a fiatal agyaké. A potenciális különbség egyik lehetséges magyarázata az, hogy a CA122 szinaptikus kapcsolatainak életkorral összefüggő elvesztése csökkentheti a plaszticitás felső határát az öregedő hippocampusban, mivel a kevesebb elérhető szinapszis gyorsabban telítődik, mint a viszonylag bőséges szinapszisok a fiatal DH-ban. Ha ez a helyzet, a stimulációs protokoll megerősítése vagy az időközönkénti stimulációs rohamok biztosítása35 nem fokozhatja tovább az LTP-t az öregedő hippokampuszban, mivel nem állnak rendelkezésre további szinapszisok. További munkára lesz szükség a különbség mögött meghúzódó mechanizmus meghatározásához.

RNS-szekvenálási eredményeink azt mutatták, hogy a gének csak egy kis részhalmaza felel meg a HDAC3 deléció által az öregedő agyban való helyreállás kritériumainak (3e. ábra). Így ahelyett, hogy összefoglaltuk volna a fiatal agy génexpressziós profilját, a HDAC3 törlése az öregedő agyból helyreállította néhány kulcsgén, köztük a Per1 tapasztalatok által kiváltott expresszióját, amelyek kritikus fontosságúak a hosszú távú memória kialakulásához. Úgy tűnik, hogy a Per1-et közvetlenül a HDAC3 szabályozza, mivel a HDAC3 fokális deléciója helyreállította a tapasztalat által kiváltott Per1 expressziót, és a HDAC3 fizikailag eltávolítható a Per1 promoterből az OLM tréning hatására. Továbbá a Per1 kifejezés szükségesmemória, mivel a PER1 fehérje siRNS által közvetített leütése a DH-ban hosszú távon károsodottmemóriafiatal egerekben, és javult a túlzott expressziómemóriaOLM-hez öregedő egerekben. Figyelemre méltó, hogy a Per1 túlzott expressziójához használt mindkét lentivírus rendszer csak kis számú sejtet transzfektált a dorsalis hippocampus CA1b területén (kiegészítő 6a, d ábra), ezért szükségessé vált ezen konstrukciók jelenlétének RNS-szekvenálásával történő megerősítése (lásd a módszereket). ). Mivel a korábbi munkák kimutatták, hogy a dorsalis hippocampusnak ez a precíz régiója kritikus az OLM36 számára, ez azt mutatja, hogy a Per1-nek még a memória szempontjából releváns struktúrán belüli kis fokális változása is befolyásolhatja a hosszú távú memória kialakulását. Ez kiterjeszti a korábbi kutatásokat, amelyek azt mutatják, hogy a Per1 nem specifikus törlése az agyban ronthatja a memória kialakulását fiatal egerekben6, 28, 29. A Per1 abnormális HDAC{12}közvetített elnyomása az öregedő agyban ezért kulcsfontosságú esemény, amely az életkorral összefüggő károsodásokhoz vezethet mind a hosszú távú memória kialakulásában, mind a cirkadián ritmusban. Bár ez a tanulmány egyértelműen bizonyítja, hogy a Per1 egy fontos gén, amelyen keresztül a HDAC3 szabályozza a hosszú távú memóriát az öregedő agyban, más gének valószínűleg hozzájárulnak a HDAC3 deléció memóriajavító hatásaihoz. A HDAC3 szinaptikus plaszticitásra és memóriára gyakorolt ​​hatásának közvetítésére javasolt további gének az NF-κB34, az FMRP37 és a Nr4a226. A jelenlegi tanulmányban további három gént azonosítottunk (3f. ábra: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3), amelyek a Per1-hez hasonlóan károsodott expressziót mutatnak az öregedő agyban, amit a HDAC3 deléció javít. Jelenleg nem világos, hogy ezek a különböző gének egyedileg járulnak hozzá a HDAC3 deléció memóriajavító hatásaihoz. Nevezetesen, ezek a gének mindegyike érintkezik a CBP/CREB útvonallal, amely kritikus a hosszú távú memória kialakulásához38, 39, és a PER16, 28-tól felfelé és lefelé egyaránt található. Mivel a PER1 a CREB foszforilációtól felfelé található6, lehetséges, hogy a Per1 HDAC{45}}közvetített repressziója csökkenti a CREB foszforilációt, végső soron rontva a CREB által közvetített gének, például az Fmrp40,41, valamint a Nr4a Nr4a géncsalád tagjainak Nra4a1 és Nr4a4a1 transzkripcióját. A HDAC3, PER1 és más molekuláris szereplők közötti összetett dinamika megértése a jövőbeli kutatások fontos célja lesz.

A jelenlegi tanulmányban két egymást kiegészítő módszert alkalmaztunk a Per1 túlzott expressziójára az öregedő agyban: egy teljes hosszúságú Per1 cDNS konstrukció túlzott expresszióját a pLVX-v5Per1 használatával és az endogén Per1 transzkripciós aktiválását a CRISPR-SAM rendszer segítségével. Bár a pLVX által közvetített túlzott expresszió nagymértékben növelte a Per1 mRNS-t (5b. ábra), ezt a Per2, egy másik periódusos családtag növekedése kísérte (kiegészítő 6b. ábra). A downstream gén Hes7 expresszióját azonban nem változtatta meg a pLVX-v5Per1 (kiegészítő 6c ábra). A CRISPR-SAM rendszer viszont finomabb növekedést produkált a Per1 mRNS-ben, amely elkerülte a Per2 vagy a Hes7 expressziójának célzott fokozódását (kiegészítő 6e–f ábra). Mivel mindkét megközelítés hasonlóan javult hosszú távonmemóriaidősödő egerekben nem valószínű, hogy a pLVX-v5Per1-nél megfigyelt Per2-növekedés a céltól eltérő mértékben okozta volna a hosszú távú memória megfigyelt javulását.

Hosszú távú cirkadián hatásokmemóriaHagyományosan úgy gondolják, hogy az SCN-en belüli szabályozási zavarból fakadnak, amely az emlékezetképzésben szerepet játszó perifériás struktúrákban, például a dorsalis hippocampusban változásokat idéz elő. Keveset tudunk az egyes cirkadián óragének DH-ban betöltött szerepéről, annak ellenére, hogy egyértelmű kapcsolat van a cirkadián ritmus és a hosszú távú memória kialakulása között. A memória szorosan kapcsolódik a napszakhoz, mivel a plaszticitáshoz kapcsolódó génkaszkádok cirkadián oszcillációkat mutatnak3,6 ésmemóriaa cirkadián ciklus bizonyos szakaszaiban könnyebben megszerezhető. Például a kontextustól való félelem kondicionálása napközben erősebben válik be, amikor a MAPK foszforilációs szintje eléri a csúcsot3. Továbbá jól dokumentált, hogy az öregedés a cirkadián ritmusok felbomlásával jár, feltehetően a központi cirkadián óra, a suprachiasmaticus nucleus (SCN) változásai miatt (áttekintéshez1). Hogyan kapcsolódik ez a cirkadián óra zavara az életkorral összefüggő károsodásokhozmemórianyitott kérdés. Eredményeink arra utalnak, hogy a HDAC3 korlátozza a tapasztalatok által kiváltott Per1-et az öregedő hippocampusban, ami valószínűleg hozzájárul a hosszú távú memória megfigyelt károsodásához. A Per1 epigenetikai elnyomása ezért fontos interfészt jelenthet az életkorral összefüggő károsodások között mind a cirkadián ritmusban, mind a hosszú távú memória kialakulásában.

Az alapvető kanonikus cirkadián óragének közül a Per1 egyedülállóan alkalmas arra, hogy hosszú távon drámai hatással legyen a hippokampuszramemória. Úgy tűnik, hogy a Per1 túlnyomórészt részt vesz az SCN kimeneti útvonalakban, és kulcsszerepet játszik az SCN-től lefelé irányuló perifériás órákban, például a hippocampusban42. Ezenkívül a közelmúltban végzett munka azt sugallja, hogy a Per1 a CREB foszforilációjának szabályozásával "bekaphatja" a térbeli memória kialakulását a nappali/éjszakai ciklus során. Valójában a hippocampalis Per1 mRNS-upregulációját figyelték meg kontextus- vagy térbeli tanulást követően legalább három másik RNS-seq vizsgálatban, beleértve a patkányokon végzett munkát is, ami azt jelzi, hogy a Per1 jellemzően a fajok közötti tanulás után felfelé szabályozódik20, 43, 44. A jelenlegi tanulmány eredményeivel együtt ez a munka azt jelzi, hogy a PER1 expresszió kritikus fontosságú a hippocampalis hosszú távú memória kialakulásában; a PER1 éjszakai csökkenése29 vagy az öregedés során károsíthatja a hippocampustmemória. Randizni,

a Per1 inmemóriaA formáció kizárólag a globális kiütésekre támaszkodott, amelyek megzavarják a Per1 expresszióját a központi cirkadián órában és más régiókban, az olyan memóriareleváns struktúrákon kívül, mint a hippocampus6, 28, 29, 45, 46, ami lehetetlenné teszi annak meghatározását, hogy a hippokampusz PER1-re kifejezetten szükség van-e emlékképződés. Valójában a globális Per1 deléció néhány jelentésben befolyásolja a cirkadián ritmust42. Itt mutatjuk be először, hogy a PER1 expressziójának csökkentése közvetlenül a dorsalis hippocampusban károsíthatjamemóriafiatal egerekben, míg a Per1 lokális túlzott expressziója a dorsalis hippocampusban javíthatja az öregedő egerek memóriáját. Mivel a HDAC3 szelektív deléciója (amely a Per1-et szabályozza) a dorsalis hippocampusban nem volt hatással a cirkadián aktivitási mintázatokra a jelenlegi vizsgálatban (kiegészítő 4. ábra), és még a dorsalis hippocampus elektrolitikus elváltozásai sem elegendőek ahhoz, hogy befolyásolják a cirkadián ritmust, valószínűtlennek tűnik47, A Per1 manipulálása a dorsalis hippocampuson belül befolyásolja a központi cirkadián óra működését. Mindazonáltal lehetséges, hogy a Per1 tapasztalatok által kiváltott növekedése vagy a Per1 vírus által közvetített túlzott expressziója befolyásolhatja más molekuláris szereplők, például más óragének cirkadián oszcillációját a hippocampalis neuronokon belül, még akkor is, ha nem befolyásolja a cirkadián aktivitási mintákat. A jövőbeni munka célja annak megértése, hogy a Per1 hogyan változtatja meg a memória kialakulását, beleértve ezen potenciális interakciós partnerek azonosítását.

Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a Per1 központi cirkadián óra gén kulcsszerepet játszik a helyi életben.memóriastruktúrák, amelyek megváltoztatják a memória kialakulását, amely szerep független az SCN-ben betöltött funkciójától. Általánosabban, ez megkérdőjelezi azt a hagyományos hipotézist, hogy a cirkadián megváltozikmemóriaA formációt a központi cirkadián óra változásai hajtják, és ehelyett azt a hipotézist támasztja alá, hogy a cirkadián óragének autonómabb szerepet játszanak a hippocampális sejtekben, esetleg a napszak alapján kapuzzák a memória kialakulását6.

Mód

Egerek. A fiatal felnőtt egerek 2 és 4 hónap közöttiek voltak a tesztelés idején, az öregedő egerek pedig 18 és 20 hónaposak voltak. Minden egér C57BL/6J volt, vagy C57BL/6 háttéren tartották őket (HDAC3 plus/plus és HDAC3flox/flox egerek). Az egerek szabadon hozzáférhettek élelemhez és vízhez, és a fényeket 12 órás világos/sötét ciklusban tartották fenn. Minden viselkedési tesztet a fényciklus alatt végeztek. Minden kísérletet az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézetének állatgondozásra és -használatra vonatkozó iránymutatásai szerint végeztek, és a Kaliforniai Egyetem Irvine-i Intézményi Állatgondozási és Állathasználati Bizottsága jóváhagyta.

Sebészet. Az egereket izofiuránnal érzéstelenítettük (indukált, 4 százalék; fenntartva 1,5–2,5} százalék), és sztereotaxiás készülékbe helyeztük. Az injekciós tűket 0,2 mm/15 s sebességgel engedtük le a dorsalis hippocampushoz (AP, -20 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, -1,5 mm Bregmához képest ). Két perccel a célmélység elérése után 1.{15}} ul vírust vagy siRNS-t infundáltunk bilaterálisan a DH-ba 6 ul/óra sebességgel. A CRISPR-SAM lentivírus infúziókhoz a három vírus koktélját féltekénként 1,5 μl végső térfogatra infundáltuk ugyanolyan sebességgel. Az injekciós tűk az injekció beadása után két percig a helyükön maradtak, hogy lehetővé tegyék a vírus diffúzióját. Az injektorokat ezután 0,1 mm-rel megemelték, és további percig állni hagyták, mielőtt 15 másodpercenként 0,1 mm-es sebességgel eltávolították őket. A vírusinfúziókat 2 héttel a viselkedéselemzés előtt, míg az siRNS-knockdownt 2 nappal az edzés előtt végezték el13. Az összes injekciós kísérletben az állatokat véletlenszerűen besoroltuk a különböző injekciós körülményekhez (kivéve a HDAC3 plus/plus és a HDAC3flox/flox egereket, amelyek mindegyike AAV-CaMKII-Cre injekciót kapott). Minden viselkedési kísérletnél az állatokat az egyes vírusállapotokon belül véletlenszerűen besorolták az otthoni ketrecbe/edzett csoportokba, és minden körülményt (tárgyak, dobozok stb.) kiegyenlítettek a csoportok között.

AAV gyártás. AAV2.{1}}A CaMKII-Cre-t a Penn Vector Core-tól vásároltuk (titer: 1,81 × 1013 GC/ml). Az AAV2.{7}}HDAC3(Y298H)-v5 esetében vad típusú HDAC3-at amplifikáltunk a hippocampalis cDNS-ből, és a terméket egy módosított pAAV-IRES-hrGFP-be (Agilent) klónoztuk a CMV promoter és -globin intron irányítása alatt. A 3×-FLAG címkét, az IRES elemet és a hrGFP-t eltávolítottuk a vektorból, és V5 címkére cseréltük, lehetővé téve a C-terminális fúziót a HDAC3-hoz (MW91 plazmid). A pontmutáció létrehozásához megváltoztattuk a nukleotidokat, hogy a 298-as aminosavnál (MW92 plazmid) a tirozin helyett egy hisztidint kódoljanak. Az üres vektorkontroll esetében a HDAC3 kódoló szekvencia nem volt jelen, de az összes többi elem megmarad (MW87 plazmid). Az AAV-t a Penn Vector Core készítette, és a végső titereket qPCR-rel határoztuk meg (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC/ml).

Lentivírus gyártás. A CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) rendszerhez lentivírus plazmidokat vásároltunk az Addgene-től a dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) és MS2- számára. P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) konstrukciók (titerek 8 × 106 TU/ml vagy annál nagyobbak). A Per1 sgRNS-hez klónoztunk és a Per1 promoterben lévő CRE elemnek megfelelő antiszensz vezérszekvenciát (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) illesztünk be az Addgene sgRNA(MS2) klónozó gerincébe (#61427). A kontroll sgRNS azonos volt, azzal a különbséggel, hogy a plazmidba nem klónoztunk vezető szekvenciát. A Per1 sgRNS (titer: 6,8 × 107 IFU/ml) és a kontroll sgRNS (3,5 × 107 IFU/ml) lentivírusait az USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory állította elő.

A pLVX-V5Per1 túlexpressziós konstrukcióhoz az Addgene pCMV-Sport{6}}mPer1 plazmidból (#16203) származó teljes hosszúságú, vad típusú Per1-et amplifikáltunk, és a terméket egy módosított pLVX-EF1 -IRES-mCherry plazmidba klónoztuk. gerinc (Takara, #631987). Az IRES és mCherry elemeket eltávolítottuk, és V5 címkére cseréltük, lehetővé téve az N-terminális fúziót a PER1-gyel (MW206 plazmid). Az üres vektor (EV) kontrollnál a PER1 kódoló szekvencia nem volt jelen, de az összes többi elem megmaradt (MW93 plazmid). A pLVX-v5Per1 (titer: 1,3 × 108 IFU/ml) és a pLVX-EV (titer: 1,5 × 108 IFU/ml) lentivírusokat az USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory állította elő. Az összes lentivírus konstrukciót az EF1 promoter alatt fejeztük ki.

Sejtkultúra A pLVX-v5Per1 és CRISPR-SAM ellenőrzése. Annak ellenőrzésére, hogy a pLVX-v5Per1 termeli-e a Per1 mRNS túlzott expresszióját, egér HT22 sejteket (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) pLVX-v5Per1-gyel vagy pLVX-EV-vel (5a. ábra) transzfektáltunk Lipofectaine LTX (Invitrogen) alkalmazásával. Hasonlóképpen, annak ellenőrzésére, hogy a CRISPR-SAM rendszer hatékonyan képes-e irányítani a Per1 transzkripciót, a HT22 sejteket dCas9-VP64-gyel transzfektáltuk (lenti MS2-P65_HSF1_Blast ajándék Feng Zhang Addgene plazmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast ajándéka Feng Zhang, Addgene plazmid #61426), és vagy A Per1 sgRNS (Per1 sgRNS) vagy a nem célzó kontroll sgRNS (ctrl sgRNS) (lenti sgRNA (MS2)_ zeo gerinc Feng Zhang, Addgene plazmid #61427) ajándéka Lipofectamine LTX (Invitrogen) felhasználásával. A sejteket 24 vagy 48 óra elteltével összegyűjtöttük, lizáltuk, és mRNS-t izoláltunk a fent leírtak szerint. A qRT-PCR-t a fent leírtak szerint hajtottuk végre az S4 táblázatban felsorolt ​​Per1, Per2 és Hes7 primerek és próbák felhasználásával.

siRNS. A Per1 leütési kísérlethez a Per1-et célzó Accell SMARTpool kis interferáló RNS-eket (siRNS-ek; Dharmacon, GE) 10 μM végső összkoncentrációra hígítottuk ddH20-ban, és infundáltuk a DH-ba (1,0 ul/oldal). Az Accell nem célzott pool siRNS-t használtuk kontrollként (teljes koncentráció, 10 μM), és ugyanilyen módon infundáltuk. Az siRNS-kísérletek során az egereket a fent leírtak szerint kezeltük és hozzászoktuk, és a műtétet a szoktatás utolsó napját követő napon végeztük. Az egereknek egy teljes napos gyógyulást kaptak a műtét után, és a következő napon (a műtét után kb. 48 órával) betanították őket, hogy biztosítsák a maximális célpont leütést. A leütés biztosítására az egereket a teszt után kb. 1 órával leöltük, és a dorsalis hippocampusból származó ütéseket Western blottal dolgoztuk fel, hogy biztosítsuk a PER1 fehérje leütését.

Objektum helye és objektum felismerésememóriafeladatokat. A tárgyhelymeghatározási és tárgyfelismerési memóriafeladatokhoz az egereket 4 napon keresztül napi 2 percig kezeltük, majd hat egymást követő napon keresztül, tárgyak hiányában napi 5 percig hozzászoktuk a kontextushoz. A kiképzés során az egereket két azonos tárgynak (100 ml-es főzőpohár, fűszertartó vagy üveg gyertyatartó) tettük ki, és 10 percig hagytuk felfedezni. A retenciós teszt alatt (24 órával később, hosszú távonmemóriavagy 60 méterrel később a rövid távú memória miatt), az egereket 5 percig hagytuk felfedezni. Az objektum helyérememória, a két ismerős tárgy egyike új helyre került. Tárgyfelismeréshezmemória, az objektumok helyei állandóak maradtak, de az egyik objektumot új elemre cserélték. Az objektumfelismerő memória megszokása legalább egy héttel az OLM-teszt befejezése után megkezdődött, és új környezetet és ismeretlen objektumokat használtak48. A feltárást akkor értékelték, amikor az egérfej a tárgy felé fordult, és 1 cm-en belül volt, vagy amikor az orr hozzáért a tárgyhoz. Feljegyezték a teljes felfedezési időt (t), és az új elem iránti preferenciát diszkriminációs indexként fejezték ki (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 százalék ). A képzési alkalmakkor a teszteléskor mozgatandó objektumot használták új objektumként, hogy lehetővé tegyék a képzési és tesztelési DI közvetlen összehasonlítását. Azokat az egereket, amelyek mindkét objektumot 2 másodpercnél rövidebb ideig fedezték fel a tesztelés során vagy 3 másodpercnél a képzés során, eltávolították a további elemzésből. Azokat az egereket is eltávolítottuk, amelyek a tréning során egy tárgyat preferáltak (DI > ±20). A szoktatási üléseket (a megtett távolság és sebesség meghatározásához) ANY-labirintus viselkedéselemző szoftverrel (Stoelting Co) elemeztük. Minden szoktatást, betanítást, tesztelést és pontozást a kísérleti csoportoktól elvakult kísérletezők végeztek.

A félelem és a feltétel összefüggése. A kontextuális félelem kondicionálására az egereket először 5 napig kezelték. A felvétel során az egereket 2 percre és 28 másodpercre kitettük a kontextus hatásának, majd 2 másodperces (0,75 mA) sokkot kapott, amely protokoll jellemzően robusztus, hosszú távú memóriát eredményez12,20. Az egerek további 30 másodpercig a kontextusban maradtak, mielőtt eltávolították őket. Az egereket 60 méterrel a tréning után feláldozták, az otthoni ketrec kontrolljaival együtt, amelyeket kezeltek, de nem képeztek ki. A fagyási viselkedést Ethovision 11 szoftverrel (Noldus)12 mértük.

Emelt plusz labirintus. A plusz-labirintusban a kísérleti csoportokra vak kísérletező került sor. Egy héttel az ORM befejezése után az egerek egy részét tesztelték a plusz labirintuson. A labirintus két karja nyitott volt (30 × 5 cm), két karja pedig zárt (30 × 5 × 15 cm), amelyeket egy központi platform (5 × 5 cm) kötött össze. A labirintus 40 cm-rel a padló fölé emelkedett. Az egereket 5 percig teszteltük a készüléken, amely abból állt, hogy mindegyik egeret a központi platformra helyeztük, és az egyik nyitott karral szemben állt. Az alanyok között a labirintust 70 százalékos etanollal tisztították meg. A zárt és nyitott karban eltöltött idő százalékos arányát ANY-labirintus szoftverrel értékeltük.

A cirkadián ritmus elemzése. Fiatal ({0}}hónap) és idősödő (18-hó) HDAC3 plus/plus és HDAC3flox/flox egereket tenyésztettünk és tartottunk 12 órás világos/sötét (LD) ciklus alatt. Két héttel az AAV-CaMKII-Cre infúzió után (fent leírtuk) az egereket egy izolált 12 órás LD-elvezető helyiségbe helyeztük át 7 napra. Az egereket ezután egy fényvédett aktivitáselemző helyiségbe vittük át, ahol a mozgásszervi aktivitást optikai nyalábos mozgásérzékelőkkel (Philips Respironics) elemezték. Az aktivitást az LD-ciklus 2 hetes bevonása alatt figyeltük meg a fénytől védett szobában, mielőtt az egereket állandó sötétségre (DD) kapcsolták volna további 3 hétig. Az aktivitás monitorozása a DD fázis alatt is folytatódott annak megállapítására, hogy a HDAC3 deléció a DH-ban befolyásolja-e az endogén cirkadián ritmust. Az adatokat a Minimitter VitalView 5.0 segítségével gyűjtöttük, és a Clocklab szoftvert (Actimetrics) használtuk a szabad tevékenység kezdetének meghatározásához. A Tau értékeket úgy számítottuk ki, hogy megkaptuk ennek a kezdetnek a meredekségét, és kiszámítottuk a legkisebb négyzetek illeszkedését a Clocklab szoftverrel49,50.

Immunhisztokémia. A viselkedés befejezése után az egereket nyaki diszlokációval elaltattuk, agyukat eltávolítottuk, és jéghideg izopentánban gyorsfagyasztottuk. Húsz mikrométeres szeleteket gyűjtöttünk össze a dorsalis hip-kampuszban, olvadáskor tárgylemezekre helyeztük, és –80 fokon tároltuk. A tárgylemezeket 4 százalékos paraformaldehiddel (10-perc) rögzítettük, amely 0-ben volt permeabilizálva.01 százalék Triton X-100 0,1 M PBS-ben (5-perc) és 1 órán át blokkolva 8 százalékos normál kecskeszérummal (Jackson). A tárgylemezeket egy éjszakán át (4 fok) inkubáltuk HDAC3 (1:250, Abcam, Y415 klón, ab32369) vagy V5 (1:1000, Abcam, ab9116) vagy GFP elleni csirke antitestben (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Másnap a tárgylemezeket mostuk és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk kecske antinyúl Alexa 488 (HDAC3 és V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) vagy kecske anti-csirke Alexa 488 (GFP) segítségével. ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) sötétben. A tárgylemezeket ezután PBST-vel mostuk, és 50 percig NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482) fluoreszcens nissl-festékben inkubáltuk. A nem specifikus autofluoreszcencia kioltására51 a szeleteket 0,01 százalékos Tritont tartalmazó PBS-ben mostuk, vízzel öblítettük, és 10-percig inkubáltuk 50 mM ammónium-acetát pufferben készült 10 mM CuSO4-ben. A szeleteket ismét vízzel öblítettük, PBS-ben mostuk, és VectaShield Antifade rögzítőközeggel (Vector Laboratories) fedtük le.

Az összes képet 20-szoros apokromatikus objektívvel (0,75 numerikus apertúra) felszerelt Olympus Scanner VS110 szkennerrel készítettük, VS110 szkenner szoftverrel. Az összes kezelt csoportot mindegyik tárgylemezen ábrázoltuk, és a tárgylemezen lévő összes képet azonos expozíciós idővel, nem telítetlen körülmények között rögzítettük. Az immunjelölés intenzitását az ImageJ segítségével számszerűsítettük úgy, hogy a CA1 sejtréteg optikai sűrűségéből vettünk mintát, és kivontunk egy mintát a háttér fluoreszcenciájából ugyanazon a képen. Az összes AAV-kísérletben kizárták az elemzésből azokat az állatokat, amelyek nem fejezték ki a vírust a dorsalis hippocampus CA1 területén. A képalkotást és a kvantifikációt a kísérleti körülményekre vak kísérletezők végezték.

Western blot. A PER1 leütésének igazolására a Per1 siRNS-t és a kontroll siRNS egereket 2 órával a tesztelés után feláldoztuk, és az agyakat gyorsfagyasztjuk. Az agyakat koronálisan metszették, és 500 μm-es szeletekből 1 mm-es DH-lyukakat gyűjtöttünk. A lyukasztásokat T-PER pufferben (Thermo Fisher) Halt proteázzal és foszfatáz inhibitorral (Thermo Fisher) Dounce homogenizátorral homogenizáltuk. A fehérjelizátumokat módosított Bradford-vizsgálattal (BioRad) határoztuk meg, és 5{31}} ug összfehérje-lizátumot töltöttünk a 7,5%-os NuPAGE Bis-Tris gél (Thermo Fisher) mindegyik sávjába. A géleket 50 percig 200 V-on futtattuk, és a blotokat egy éjszakán át 15 V-on 4 fokos hőmérsékleten nitrocellulóz membránokra vittük (Novexi, LC2001). A következő napon a membránokat blokkoló pufferben 1 órán át inkubáltuk (5% zsírmentes tej Tris-pufferelt sóoldatban 0,01% Tween 20-ban), mostuk (0,1% Tween 20 TBS-ben), majd elsődleges antitestben (1:500, nyúl anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) elsődleges antitestpufferben (3% BSA TBS-ben 0,1% Tweennel) egy éjszakán át 4 °C-on. A membránokat ezután mostuk, és nyúl elleni HRP-konjugált egérantitestben (1:10, 000, Jackson Laboratories, könnyűlánc-specifikus, #211-032-171) 1 órán át inkubáltuk. A membránokat mostuk és Pierce SuperSignal West Pico kemilumineszcens szubsztrátum (Pierce, 34077) alkalmazásával előhívtuk. A linearitás ellenőrzésére több filmfelvételt használtak. A blotokat 10 percig mostuk és sztrippeltük Restore Western Blot csíkozópufferrel (Thermo Fisher #21059), újra mostuk, majd egy éjszakán át (4 fok) újra szondáztuk GAPDH elleni nyúl antitesttel (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778). ). A teljes hosszúságú PER1 és GAPDH blotokat az 5. kiegészítő ábra mutatja. A relatív optikai sűrűséget a szkennelt filmből az ImageJ (US National Institutes of Health) segítségével számította ki a kísérleti körülményekre vak kísérletező. Minden értéket GAPDH expressziós szintre normalizáltunk.

qRT-PCR. A szöveteket DH lyukasztókból gyűjtöttük össze (fent leírtuk), és –80 fokon fagyasztottuk le a feldolgozásig. Az RNS-t RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) segítségével izoláltuk, a cDNS-t pedig a Transcriptor First Strand cDNS Synthesis kit (Roche, 04379012001) segítségével állítottuk elő. A primerek és szondák a Roche Universal ProbeLibrary-ból származnak (S4 táblázat), és multiplexelésre a Roche Light-Cycle 480 II gépben (Roche) használták. Minden értéket Gapdh-ra normalizáltunk. Az elemzések és statisztikák a Roche szabadalmaztatott algoritmusaival és a Pfaff-módszeren alapuló REST 2009 szoftverrel készültek52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 szerepelt elemzésünkben. Az egyes csoportokhoz tartozó cDNS-könyvtárakat a TruSeq RNS Sample Preparation Guide (Illumina) szerint készítettük el. Minden egérből kétszázötven nanogramm teljes RNS-t megtisztítottunk poli-T oligohoz kapcsolt mágneses gyöngyökkel, és hővel fragmentáltuk. Az első és második szálú cDNS-t ezután szintetizálták és megtisztították. A végek tompítása után a 3′ végét adenileztük, hogy megakadályozzuk a templát összefűzését az adapter ligálása során. Mindegyik csoporthoz egy egyedi adapterkészletet adtunk a cDNS végeihez, és a könyvtárakat PCR-rel amplifikáltuk. A könyvtár minőségét Bioanalyzer-rel értékeltük, és qRT-PCR-rel kvantifikáltuk egy kereskedelmi szekvenálási könyvtárból (Illumina) készített standard görbével. A mintákat multiplexeltük, minden viselkedési csoportot a szekvenszer minden egyes áramlási cellájában képviselve. Mindegyik könyvtárból 10 nM-t gyűjtöttünk össze négy multiplex könyvtárban, és egy Illumina HiSeq 2500 készüléken szekvenáltuk egy egyszeri leolvasású, 50 bp-os szekvenálás során, amelyet a Kaliforniai Egyetem Irvine-i Genomic High-Troughput Facilityje futtatott. Az egyes könyvtárak eredményül kapott szekvenálási adatait utólag feldolgoztuk a FastQ fájlok előállításához. Az adatokat ezután demultiplexeltük és szűrtük Illumina CASAVA 1.8.2 szoftverrel, valamint házon belüli szoftverrel. A rossz minőségű leolvasásokat (az Illumina szabványos minőségi tesztjeit sikertelenül) és a PhiX kontrollgenomhoz sikeresen igazított kontrollokat eltávolítottuk az elemzésekből. A fennmaradó szekvenciák minőségét tovább értékeltük PHRED minőségi pontszámokkal, amelyeket valós időben állítottak elő a szekvenálási futtatás alaphívási lépése során (3a. kiegészítő ábra).

Igazítás a referenciagenomhoz és a transzkriptomhoz. Az egyes kísérletekből származó leolvasásokat külön-külön igazítottuk a referenciagenomhoz és a megfelelő transzkriptomhoz az ELAND v2e (Illumina) és a Bowtie24 rövid leolvasású illesztőprogramjaival. A két eszköz által egyedileg igazított leolvasásokat az ismert exonokhoz vagy splice junctionokhoz úgy, hogy a leolvasás bármely 25 bp-os fragmensén legfeljebb két eltérés történt, bekerült a transzkriptom. Az egyedileg igazított, de a leolvasás bármely 25 bp-os fragmensén kettőnél több eltérést tartalmazó leolvasásokat eltávolítottuk az elemzésekből. Hasonlóképpen, a referenciagenomban több helyen megegyező leolvasásokat eltávolítottuk az elemzésből. A referencia genomhoz és a transzkriptomhoz rendelt leolvasások százalékos aránya ezzel a protokollal minden replikátumcsoportra vonatkozóan (kiegészítő 3b. ábra). Ez átlagosan körülbelül 30 millió leolvasást eredményezett mintánként.

A pLVX és CRISPR-SAM plazmidok lentivírus infúziót követő jelenlétének ellenőrzésére RNS-szekvenálást végeztünk csoportonként három állatból álló csoportból származó hippocampális mintákon a viselkedést követően. Mivel a lentivírusokkal in vivo fertőzött sejtek száma túl kicsi volt a megfelelő transzkriptumok jelenlétének megbízható kimutatásához RT-qPCR segítségével (kiegészítő 6a, d ábra), az RNA-seq-t használtuk érzékenyebb módszerként a jelenlét kimutatására. ezekből az átiratokból. A genom összeállítás és a genom annotáció frissített változatát a plazmidkonstrukciók szekvenciáinak és annotációinak az eredeti mm10 egérgenomhoz, illetve az mm10 egérgenom annotációhoz való hozzáfűzésével készítettük. A Tuxedo Suite54-ben található TopHat olvasási illesztési eszközt használva a leolvasásokat a genomra térképezték fel, és csak azokat a találatokat tekintették a plazmidkonstrukciók "illesztett leolvasásának", amelyek a plazmid-transzkriptumokra jellemzőek az endogén egér referenciagenomhoz képest. Az egyező leolvasások számát ezután számszerűsítettük minden egyes minta konstrukciójára vonatkozóan.

Génexpresszió és differenciálanalízis. A génexpressziós szinteket közvetlenül az olvasási illesztési eredményekből számítottuk ki minden ismétlésnél. A standard RPKM értékek55, az exonmodell kilobázisánkénti leolvasások millió feltérképezett leolvasásonként) a szekvenálási adatok által lefedett minden génből és a vizsgálatban használt minden ismétlésből extraháltuk.

Differenciális transzkripciós elemzéseket végeztünk a Cyber ​​T56,57 segítségével minden egyes csoportpáron (otthoni ketrec versus 6{26}} m-rel az edzés után), hogy azonosítsuk az OLM után felfelé vagy lefelé szabályozott géneket. A jelenlegi vizsgálathoz kiképzett 18-hónapos HDAC3 plus/plus és HDAC3flox/flox egereken kívül a {{10}} hónapos C57 vad típusú egerek RNS-szekvenálási adatai is azonosan dolgoztak fel ( otthoni ketrecben és a jelenlegi vizsgálattal azonos módon OLM-tanítással) egy korábbi vizsgálatból20 használtuk a differenciálelemzésekhez. Az állatok száma (biológiai ismétlődések) minden csoportban a következő volt: Fiatal HDAC plusz / plusz HC: 6, Fiatal HDAC3 plusz / plusz OLM: 6, Old HDAC3 plusz / plusz HC: 6, Old HDAC3 plusz / plus OLM: 6, Old HDAC3flox/flox HC: 8, Old HDAC3flox/flox OLM: 8. Nem használtak műszaki másolatokat. A differenciális kifejezés meghatározásához használt p-érték küszöb minden csoportnál 0,05. A Benjamini & Hochberg (BH) q-értékkel mért téves felfedezési arányt (FDR) használtuk a többszörös tesztelés korrekciójára, az FDR küszöbértéke 0,15. A tapasztalat után (az otthoni ketrechez képest) felszabályozott génkészleteket ebben a 3 csoportban (fiatal vadtípus, öregedő HDAC plus/plus vagy öregedő HDAC3flox/flox) kereszteztük, hogy meghatározzuk a két vagy több csoportban közös géneket. Az egyes csoportok szövet-specifikus expressziója, génontológiai kifejezései58 és KEGG-útvonalai59,60 dúsítását DAVID61 segítségével értékelték, a viselkedés után eltérően expresszált gének alapján. Az adatok vizualizálása a "matplotlib" használatával történt a python és a "ggplot" használatával az R esetében.

Kromatin immunprecipitáció. A ChIP-t a Millipore ChIP kit11,12,62 protokollja alapján DH ütésekkel hajtották végre. A szövetet 1 százalék formaldehiddel (Sigma) térhálósítottuk, lizáltuk és ultrahanggal kezeltük, majd a kromatint egy éjszakán át immunprecipitáltuk 2 ul anti-H4K8Ac-vel (Millipore #17-10099) vagy 4 ul anti-HDAC3-mal (Millipore #{{). 13}}) vagy ezzel egyenértékű mennyiségű Normal Rabbit Serum (H4K8Ac negatív kontroll, Millipore) vagy anti-egér IgG (HDAC3 negatív kontroll, Millipore). Mosás után a kromatint eluáltuk a gyöngyökből, és a DNS oszlopos tisztítása előtt proteináz K jelenlétében fordított térhálósítást végeztünk. Az egyes gének promotereinek primer szekvenciáit a Primer 3 programmal terveztük (S4 táblázat). Minden állatból öt ul bemeneti, anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG vagy anti-nyúl/egér IgG immunprecipitátumot vizsgáltunk meg két párhuzamosban. A ChIP-qPCR adatok normalizálásához százalékos beviteli módszert alkalmaztunk. A bemeneti mintát 100 százalékra állítottuk, és mind az IP-, mind az IgG-mintát ennek a bemenetnek a százalékában számítottuk ki a 100*AE^ (korrigált bemenet – Ct(IP)) képlet segítségével. A redős dúsulást ezután a ChIP és az átlagos IgG arányaként számítottuk ki. A lemezen belüli standard görbe által meghatározott amplifikációs hatásfok (AE).

Szelet előkészítés és rögzítés. Fiatal (körülbelül 3-hónap) és idősödő (18-hónap) egerekbe sztereotaxikusan beoltották a vírust. Az első kísérletben fiatal és idős HDAC3 plus/plus és HDAC3flox/flox egereket infundáltunk AAV-CaMKII-Cre-vel bilaterálisan a DH-ba. A második kísérletben fiatal és idős, vad típusú C57 egereket infundáltunk AAV-HDAC3(Y298H)-val az egyik félteke DH-jába, és AAV-EV kontrollt a másik féltekébe. Két héttel az infúzió után (az optimális vírusexpresszió érdekében)2 keresztirányú hippokampuszszeleteket (320 μm) helyeztünk egy interfész-rögzítő kamrába előmelegített (31 ± 1 fokos) mesterséges cerebrospinális folyadékkal (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1). KH2PO4, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 és 10 mM D-glükóz). A szeleteket folyamatosan perfundáltuk 1,75-2 ml/perc sebességgel, miközben a szeletek felületét meleg, párásított 95 százalékos O2/5 százalék CO2-nak tették ki. A felvételek legalább 2 órás inkubáció után kezdődtek.

A terepi gerjesztő posztszinaptikus potenciálokat (fEPSP) a CA1b stratum radiatumból rögzítettük egyetlen üvegpipetta (2-3 MΩ) segítségével, amelyet 2 M NaCl-dal töltöttünk meg. A stimulációs impulzusokat (0.05 Hz) a CA1c-ben elhelyezett bipoláris stimuláló elektróda (sodort nikrómhuzal, 65 μm) segítségével továbbítottuk Schaffer kollaterális-commisszurális vetületeihez. Az áramerősséget úgy állítottuk be, hogy a maximális fEPSP válasz 50 százalékát kapjuk. A stabil alapvonal megállapítása után az LTP-t egyetlen, öt théta-löketből álló sorozattal indukáltuk, amelyben minden egyes sorozat (négy impulzus 100 Hz-en) egymástól 200 ms-ra (vagyis théta-frekvencián) történt. A stimuláció intenzitása nem nőtt a TBS alatt. Az adatokat a NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst) segítségével gyűjtöttük és digitalizáltuk.

Statisztikai analízis. A statisztikai elemzéseket a szövegben és az ábra jelmagyarázatában leírtak szerint végeztük, Prism 6 (GraphPad) segítségével. Analitikai megközelítéseink a korábban publikált munkákon alapulnak12,20,63,64. Nem használtunk statisztikai módszereket a mintanagyság előzetes meghatározására, de a mintaméreteink hasonlóak a szakterületen általában használtakhoz, beleértve a korábbi publikációkban közölteket12,20,64,65. Az adatok eloszlását normálisnak feltételeztük, hasonló szórást figyeltek meg a csoportok között, de ezt formálisan nem tesztelték. Amikor egy kísérletben két csoportot kellett összehasonlítani, kétirányú Student-féle t-tesztet használtunk. Amikor két tényezőt hasonlítottak össze (mint például az életkor és a genotípus vagy a munkamenet és a csoport), az adatokat kétirányú ANOVA-val elemezték, majd Sidak többszörös összehasonlítása után post hoc teszteket végeztek. Minden elemzés kétirányú, a szignifikanciához 0,05 érték szükséges. A hibasávok minden ábrán a SEM-et jelentik. Minden kísérletnél a csoportátlag ± 2SD értékeit kiugró értéknek tekintettük, és eltávolították az elemzésekből.

Az adatok elérhetősége. A jelen tanulmány megállapításait alátámasztó adatok ésszerű kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől. Az RNS-szekvenálási adatokat az NCBI Gene Expression Omnibus-jában helyezték el, és a GEO-sorozat GSE94832 hozzáférési számán keresztül érhetők el.

Hivatkozások

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ A nucleus suprachiasmaticus és a hippocampus epigenetikai változásai hozzájárulnak az életkorral összefüggő kognitív hanyatláshoz. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC cirkadián ritmusok és memóriaformálás. Nat. Neurosci tiszteletes. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. A hippokampusz MAPK aktivitásának cirkadián oszcillációja és a cAmp: következményei a memória fennmaradására. Nat. Neurosci. 11, 1074–1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS A tanulás és a memória cirkadián modulációja félelem-kondicionált egerekben. Behav. Brain Res. 133, 95–108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV A cirkadián óra és az öregedő agy patológiája. Nat. Neurosci tiszteletes. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH. Az 1. periódus a CREB kinase pP90RSK nukleáris ingadozásának szabályozásával biztosítja a memóriareleváns jelátvitel cirkadián modulációját egér hippocampusban. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD. Az öregedéssel összefüggő kognitív diszfunkció epigenetikai hipotézise. Front Aging Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. A megváltozott hiszton-acetiláció korfüggő memóriazavarral jár egerekben. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. A H3K9me3 gátlás javítja a memóriát, elősegíti a gerinc kialakulását és növeli a BDNF szintjét az idős hippocampusban. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Epigenetikai hozzájárulás a kognitív öregedéshez: az elme és az élettartam szétválasztása. Tanuld meg Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. A HDAC3-szelektív inhibitorok tartósan fokozzák a kokainkereső magatartás kihalását. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. A kontextust és a hallási félelmet eltérően szabályozza a HDAC3 aktivitás az amygdala laterális és bazális almagjában. Neuropsychopharmacology 42, 1284–1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. A HDAC3 a hosszú távú memória kialakulásának kritikus negatív szabályozója. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Az RGFP966-on keresztüli hiszton-dezacetiláz gátlás feloldja a szenzoros kérgi plaszticitás és a memóriaképződés specifitásának fékjeit.J. Neurosci. 35, 13124–13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. A gerinces IIa osztályú hiszton-dezacetilázok rejtett katalitikus aktivitásának feltárása. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335–17340 (2007).

16. Sun, Z. et al. A HDAC3 deacetiláz-független funkciója a transzkripcióban és az anyagcserében nukleáris receptor korepresszort igényel. Mol. Cell 52, 769–782 (2013).

17. Alaghband, Y. et al. A HDAC3 dezacetiláz doménjének megkülönböztető szerepe a hippocampusban és a mediális prefrontális kéregben a memória kialakulásában és kihalásában. Neurobiol. Tanul. Mem. 145, 94–104 (2017).

18. Nott, A. et al. A hiszton-deacetiláz 3 a MeCP2-vel társulva szabályozza a FOXO-t és a szociális viselkedést. Nat. Neurosci. 19, 1497–1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR A hiszton-dezacetiláz 3 szükséges a megfelelő agyfejlődéshez. J. Biol. Chem. 289, 34569–34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. A neuron-specifikus kromatin BAF53b szabályozó alegység szükséges a szinaptikus plaszticitáshoz és a memóriához. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Transzkripciós faktorok a hosszú távú memóriában és a szinaptikus plaszticitásban. Physiol. Rev. 89, 121–145 (2009).

22. Barnes, CA Hosszú távú potencírozás és az öregedő agy. Philos. Trans. R. Soc. London. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Az UCSC Genome Browser adatbázis: 2016-os frissítés. Nucleic Acids Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. és Salzberg, SL. Rövid DNS-szekvenciák ultragyors és memória-hatékony igazítása a humán genomhoz. Genome Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. A hippocampális expressziós elemzések az azonnali-korai, neuroenergetikus és myelinogén útvonalak szelektív összefüggését tárják fel a kognitív károsodással idős patkányokban. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Különböző szerepek a Nr4a1 és Nr4a2 számára az objektum elhelyezkedésében és az objektumfelismerés hosszú távú memóriájában. Tanuld meg Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Effects of sleep deprivation and aging on long-term and remote memory in mice. Tanuld meg Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. A PERIOD1 koordinálja a hippocampális ritmust és a memóriafeldolgozást a nappalival. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. et al. Az egér hippocampális óra génexpressziójának időbeli dinamikája támogatja a memóriafeldolgozást. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL A hippocampuson belüli cirkadián oszcillációk támogatják a memória kialakulását és a perzisztenciát. Front Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL. Tapasztalatfüggő génexpresszió patkány hippokampuszban térbeli tanulás után: az Arc, c-fos és zif268 közvetlen korai gének összehasonlítása. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Kromatin-módosítások és funkcióik. Cell 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. et al. Genomléptékű transzkripciós aktiválás egy tervezett CRISPR-Cas9 komplexszel. Nature 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. A hiszton-dezacetiláz 3 gátlása helyreállítja a szinaptikus jelölést és befogást az öregedés során a nukleáris faktor kappa B. Sci. aktiválása révén. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Szinaptikus bizonyítékok az elosztott tanulás hatékonyságára. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. A CBP hippocampális fokális kiütése befolyásolja a specifikus hisztonmódosításokat, a hosszú távú potencírozást és a hosszú távú memóriát. Neuropsychopharmacology 36, 1545–1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL. A hiszton-dezacetiláz 3 szelektív gátlása által kiváltott, mediális-perforáns pályafogú szemcsesejt-szinapszisok hosszú távú potencírozásához Fragile X mentális retardációs fehérje szükséges. Neurobiol. Tanul. Mem. 114, 193–197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB és a memória. Annu. Neurosci tiszteletes. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. A CREB, mint pozitív szabályozó szerepe a memória kialakulásában és fejlesztésében. Brain Res. Bika. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD és Reines, D. A törékeny X RNS-kötő fehérjét kódoló gént a 2-es nukleáris légzési faktor és a CREB transzkripciós faktorcsalád szabályozza. Nucleic Acids Res. 34, 1205–1215 (2006).

41. Wang, H. et al. A CREB szerepe az FMRP szabályozásában az I. csoportba tartozó metabotrop glutamát receptorok által a cingulate cortexben. Mol. Brain 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Megváltozott viselkedési ritmusok és óragénexpresszió egerekben a Period1 gén célzott mutációjával. EMBO J. 20, 3967-3974 (2001).

43. Halder, R. et al. A plaszticitás gének DNS-metilációs változásai kísérik a memória kialakulását és fenntartását. Nat. Neurosci. 19, 102–110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ és Sweatt, JD. Tapasztalatfüggő epigenomikus átrendeződés a hippocampusban. Tanuld meg Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. A clock gene, period, kulcsszerepet játszik a Drosophila hosszú távú memória kialakulásában. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058–16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. A kokainérzékenység és a jutalom a cirkadián gének és a ritmus befolyása alatt áll. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR A MAP (mitogen-aktivált protein) kináz és adenilil-cikláz aktivitások napi oszcillációja a hippocampusban a szuprachiasmaticus magtól függ. J. Neurosci. 31, 10640–10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Objektumhelyzet és tárgyfelismerő memória vizsgálata egerekben. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. A ventromediális hipotalamusz cirkadián órája szabályozza a ciklikus energiafelhasználást. Cell Metab. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Phenotyping circadian rhythms in mice. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Lipofuscin-szerű autofluoreszcencia csökkentése fluoreszcensen jelölt szövetben. J. Histochem. Cytochem. 47, 719-730 (1999).

52. Pfafffl, MW Egy új matematikai modell a valós idejű RT-PCR relatív mennyiségi meghatározásához. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Relatív expressziós szoftvereszköz (REST) ​​a relatív expressziós eredmények csoportonkénti összehasonlítására és statisztikai elemzésére valós idejű PCR-ben. Nucleic Acids Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. RNS-seq kísérletek differenciális gén- és transzkriptum-expressziós analízise TopHattal és Cuffinks-szel. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transscriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T webszerver: nagy áteresztőképességű adatok differenciális elemzése. Nucleic Acids Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Bayes-i keretrendszer a microarray expressziós adatok elemzéséhez: regularizált t-teszt és génváltozások statisztikai következtetései. Bioinformatics 17, 509–519 (2001).