Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kattintson ide az 1. részhez

A Cistanche gyógynövénynek nagyon jó neuroprotektív hatása van

2.6. A kaszpáz{3}}/7 aktivitásmérésekkel meghatározott citokininek antiapoptotikus hatásai

Amint azt a fent leírt PI-festési vizsgálatok mutatják, a SAL növelte az SH-SY5Y sejtek halálozási arányát. Mivel a SAL az apoptózissal és a nekrózissal is összefügg [51], megvizsgáltuk a kaszpáz-3 és a 7 (casp-3/7) aktiválását is, mint az apoptózis (végrehajtási fázis) specifikus markere [52]. miután a sejteket CK-knak tették ki. Az egyes tesztvegyületekkel végzett kezelést követően feljegyzett kaszpáz{8}}/7 aktivitásokat normalizálták az 50{{30}} uM SAL-lal (100-ra beállítva) százalék ). Ahogy a 4. ábrán látható, a jól ismert kaszpáz inhibitor Ac-DEVD-CHO (amely specifikus, apoptózissal kapcsolatos kontrollként szerepel) erősen gátolta a kaszpáz-3/7 aktivitást szubmikromoláris koncentrációkban (36,3 ± 2,66 és 25,2 értékig). ± 2,69 százaléka a csak SAL-lel 0,05, illetve 0,5 uM koncentrációban kezelt sejtekben). Hasonló mértékű gátlást korábban is megfigyeltek [53] a neurodegeneráció különböző in vitro SH-SY5Y sejtalapú modelljeiben. A pozitív kontroll NAC szintén jelentősen csökkentette a kaszpáz-3/7 aktivitását, a SAL által kiváltott szint 88,7 ± 1,87 százalékára, illetve 78,5 ± 2,56 százalékára 100 uM, illetve 1000 uM mellett. A tesztelt CK-k sokféle hatást gyakoroltak a kaszpáz{50}}/7 aktivitásra. Érdekes módon a CK ribozidok közül csak a cZR-nek volt szignifikáns hatása az aktivitásokra 0,1 uM mellett (a SAL-indukált szint 83,3 ± 4,33 százalékára csökkentette őket), míg az iPR 1 uM-nál nem csökkentette szignifikánsan a casp-3 ,7. Végül a K3G csökkentette a kaszpáz-3/7 aktivitást, maximális hatást kifejtve 10 uM-nál (a SAL által kiváltott szint 81,7 ± 4,31 százalékára). Összességében a SAL 16-szeres növekedést indukált a kaszpáz-3/7-es aktivitásában az egészséges kontrollsejtekhez képest (CTR, 4. ábra), összhangban egy korábbi vizsgálat eredményeivel, amelyben hasonló SAL koncentrációt (400 uM) és ugyanazt a sejtvonalat használtuk [54]. A NAC köztudottan befolyásolja a kaszpáz-3/7 aktivitást számos modellbenneuronálishalál [55–58]. Az itt bemutatott eredmények azonban elsőként mutatják be a kaszpáz-3/7 működését egy SH-SY5Y sejtalapú SAL-indukált modellben.neuronálishalál. A pozitív kontroll a CK-hoz hasonlóan csökkentette az 500 uM SAL által kiváltott kaszpáz{0}}/7 aktivitást, de a cZR és a K3G még szub-mikromoláris vagy mikromoláris koncentrációban is hatásos volt. Más tanulmányok PD-vel (az MG 132- vagy H2O2- proteaszóma inhibitor MG 132- vagy H2O2- által kiváltott toxicitás az SH-SY5Y sejtekben [17] és a fibroblasztokban [15], valamint a Huntington-kórral (szérum éhezési modell in PC12 sejtek [19]) azt is kimutatták, hogy a CK-k K és tZR anti-apoptotikus (kaszpáz-3) aktivitással rendelkezhetnek [17], és mind a K-nak, mind a tZR-nek lehetnek öregedésgátló hatásai [17,19]. . Sőt, összefüggések a casp-3 csökkenése,7 aktiválása ésneuroprotektívaktivitást jelentettek a SAL és a SAL-hoz kapcsolódó modellek esetében [54,59,60].

4. ábra: Kaszpáz-3/7 aktivitás a PD SAL-indukált modelljében. Háromszor legalább négy független napon belül. * P az 500 uM SAL-t tartalmazó járműhöz képest, # P az 500 uM SAL nélküli járműhöz képest.

2.7. A citokinin neuroprotektív aktivitásának azonosítása a glutamát által kiváltott sejthalál modellben

Mivel az SH-SY5Y sejtek nem expresszálnak minden NMDA receptor alegységet [61], a glutamát (Glu) toxicitás legvalószínűbb mechanizmusa a cisztin/glutamát Xc-antiporter blokkolása, amely masszív oxidatív stresszt indukál [62]. Korábbi szerzők már kimutatták az összefüggést a glutamát által kiváltott sejthalál és az SH-SY5Y sejtek nekroptózisa között [63], valamint a kaszpáz-3 aktiválásának fontosságát a glutamát által kiváltott toxicitásban [62,64]. Számos tanulmány kimutatta a vas által vezérelt sejthalál (ferroptózis) előfordulását glutamát-mérgezés után [62, 65, 66], és háromféle sejthalál (nekroptózis, apoptózis és ferroptózis) előfordulását jelezte az Xc blokádját követően. - antiporter rendszer. Annak érdekében, hogy egy átfogó értékelést aneuroprotektíva tesztelt potenciálcitokininek, a glutamát által kiváltott sejthalál vizsgálati rendszert egy analitikai panelbe foglalták az ismertneuroprotektívvaskelátképző deferoxamin (DFO) és a nekroptózis inhibitora necrostatin-1 (NEC-1) [67] pozitív kontrollként. Itt az SH-SY5Y sejteket 48 órán keresztül differenciáltuk, majd 160 mM Glu-val vagy annak együttes kezelésében különbözőcitokininkoncentrációban ({{0},1–10 uM) 24 órán át, és PI-vel megfestve. Ebben a modellben a Glu sejthalálra gyakorolt ​​hatása 100 százalékos PI jel volt, ezért értékeltük a sejthalál csökkenését a tesztvegyületek által. A Glu majdnem 4-szeres növekedést indukált a sejthalálban az egészséges SH-SY5Y kontrollokhoz képest (26,1 ± 0,42 százalék). A pozitív kontrollok szűrése éscitokininekkimutatta, hogy mindkét pozitív kontroll NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 százalék) és DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 százalék) csökkentette a glutamát által kiváltott sejthalált. Amint az 5A ábrán látható, a panelrőlcitokininek, csak háromcitokininektudtak védeniidegsejt- hasonlóan az SH-SY5Y sejtekhez, mint a pozitív kontrollokhoz. A legaktívabbcitokininektransz-zeatin (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91 százalék; 1 uM, 81,3 ± 2,77 százalék) és cisz-zeatin (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29%) százalék ; 1 uM, {{20}},2 ± 2,89 százalék ) és kinetin (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 százalék; 10 uM, 79,9 ± 3,44 százalék). Ígéretes aktivitásuk igazolására egy ortogonális vizsgálatot alkalmaztak a CK-k biológiai hatásainak részletesebb tisztázására ebben a modellben: A laktát-dehidrogenáz (LDH) felszabadulási vizsgálat [68], amely szintén drámai (4--szeres) növekedést mutatott. a toxicitás növekedése a Glu-kezelést követően. Érdekes módon az LDH-felszabadulás meghatározása lehetővé tette a CK-k és a pozitív kontrollok (NEC-1 és DFO) aktivitásának megkülönböztetését. A CK-k mérsékelt, de jelentős védőaktivitást mutattak (a tZ 91,9 ± 1,40 százalékra csökkentette a halálozási arányt 0,1 uM mellett; cZ 92,3 ± 1,15 százalékra csökkentette őket 0,1 uM mellett és 91,7 ± 1,56 százalékra 1 uM mellett; 2.2. 1,06 százalék 1 uM). A pozitív kontrollok, a NEC-1 és a DFO erősebb védőhatást fejtettek ki, de sokkal magasabb koncentrációknál is hatásosak voltak (76,9 ± 2,94 százalékra, illetve 81,6 ± 3,74 százalékra csökkentve 50 és 10 uM mellett) (5B. ábra). Az LDH assay validálta a PI-festéssel kapott indikációkat, és a pozitív kontrollok megfigyelt hatásai összhangban voltak a publikált adatokkal [69,70]. A HT22 sejtekben a Glu-indukált sejthalál modelljében a K hatásaival kapcsolatos eredmények [18], valamint a reprezentatív CK-k, például a tZ, cZ és K hatásaira vonatkozó megfigyeléseink azt mutatják, hogy a CK-k ígéretes jelöltek az oxidatív stresszel összefüggő neurodegeneratív betegségek kezelésében. 71]. Végül a tZ-t és a cZ-t részesítették előnyben, mivel alacsonyabb koncentrációban is hatásosak voltak, és a K-val együtt kiválasztották az oxidatív stressz és a kaszpáz-3,7-aktiváció szintjére gyakorolt ​​hatásuk további vizsgálatára.

cistanchevéleményekhatásairólneuroprotekció

2.8. A citokininek hatása a Glu által kiváltott oxidatív stresszre az SH-SY5Y sejtekben

Az előző modelltől eltérően a Glu különböző útvonalakon képes oxidatív stresszt indukálni az SH-SY5Y sejtekben. Az egyik a cisztin/glutamát (Xc-) antiporter elzáródásán alapul, ami a glutation (GSH) kimerüléséhez és a szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitására gyakorolt ​​negatív hatásokhoz vezet [62]. A glu-közvetített sejthalál feltételezhetően a Rac-NADPH-oxidáz által vezérelt ROS (különösen szuperoxid gyök) képződését is magában foglalja az SH-SY5Y sejtekben [72]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a sejthalál elsődleges oka a Glu-indukált modellben az operációs rendszer. A modellen belül,idegsejt-szerű sejteket Glu-val és tesztelt vegyületekkel együtt kezeltük, DHE-vel megfestettük, és fluoreszcens mikroszkóppal megfigyeltük. Amint az a 6A. ábrán látható, a vörös DHE fluoreszcencia drámai emelkedése volt megfigyelhető a Glu-val kezelt sejtekben, amit a pozitív kontrollanyagok és a tesztelt CK-k javítottak. A mikroszkópos megfigyelés alapján a szuperoxidszintek mennyiségi meghatározását Glu-indukált sejtekben a SAL-indukált sejtekhez hasonló módon, DHE vizsgálattal végeztük. Az eredményeket normalizálták a Glu önmagában indukált szintjeihez képest (100 százalékra beállítva), ami drámai, majdnem 3-szeresére emelte a szuperoxidszintet mindössze 4 órán belül.idegsejt-szerű SH-SY5Y sejtek az egészséges kontrollsejtek szintjéhez viszonyítva (CTR: 33,79 ± 1,45 százalék). A 6B. ábrán látható módon a CK-k, mint például a tZ, cZ és K, jelentősen csökkentették a szuperoxidszintet a Glu-mérgezett sejtekben: 0,1 uM tZ, 0,1 uM cZ, 1 uM és 10 uM K 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 és 83,8 ± 2,32 százalékra csökkentette a csak Glu-val kezelt sejtekben. Ezek a szintek összevethetők a nekroptózis-gátló NEC-1 (80,5 ± 3,19 százalék 5 uM-nál és 80,4 ± 2,70 százalék 50 uM-nál) és a vaskelátképző DFO-val (80,2 ± 3,80 százalék 10 uM-nál) kapott szintekkel. A Glu-indukált sejthalál modellel kapott eredmények, különösen a pozitív kontrollok hatásai összhangban vannak a korábbi jelentésekkel [70,73]. Korábbi bizonyítékok arra vonatkozóan, hogy a CK-k OS-csökkentő hatást fejtenek ki Glu-indukált vagy hasonló modellekben, arra korlátozódtak, hogy a K erős OS-redukáló szer (körülbelül 23 uM koncentrációban) a HT22 sejtalapú Glu-indukált sejthalál modellben [18 ]. Azt találtuk, hogy a K alacsonyabb koncentrációban (1-10 uM) OS-csökkentő hatással bír SH-SY5Y sejtjeinkben. Ezenkívül megfigyelték a tZ jótékony, hosszú távú hatásait az emberi fibroblasztokra, beleértve a hidrogén-peroxid-lebontó aktivitást [15], ami arra utal, hogy a tZ és a cZ közvetett OS-csökkentő hatással bírhat a Glu-indukált sejthalál modellekben. Ezenkívül más jelentések rámutattak a CK-k által közvetített OS-csökkentő hatás és a védő aktivitás közötti összefüggésekre [22,74–76]. Összességében a tZ, cZ és K meglepően erős OS-csökkentő hatást mutatott, összehasonlítható a pozitív kontrollokéval, annak ellenére, hogy összességében eltérő erősségeik voltak.neuroprotektívhatás.

5. ábra (A) Halálozási arányidegsejt-szerű SH-SY5Y sejtek a glutamát (Glu) által indukált sejthalál modelljében; (B) Glu-indukált toxicitás (LDH-kibocsátás).idegsejt-mint az SH-SY5Y sejtek. Háromszor megismétlődik legalább három független napon.* P a 160 uM Glu-t tartalmazó hordozóhoz képest, # P a 160 uM Glu-t nem tartalmazó hordozóhoz képest.

6. ábra (A) A jelzett vegyületek Glu-indukált oxidatív stressz (OS) és OS-csökkentő hatása emberbenidegsejt-szerű SH-SY5Y sejtek, amelyeket fluoreszcens mikroszkóppal tettek láthatóvá dihidroetidium (DHE) jelölést követően. Bars=50 um. A képek mutatjákidegsejt-mint az SH-SY5Y sejtek DMSO-val (Control), 160 mM glutamáttal (Glu) önmagában, és együtt: 10 uM deferoxamin (plusz DFO), 50 uM necrostatin{{6} } (plusz NEC-1), 0,1 uM tZ (plusz tZ) és 0,1 uM cZ (plusz cZ) 4 órán át, majd DHE-vel megfestjük. (B) Glu-indukált szuperoxid gyökképződés inidegsejt-mint az SH-SY5Y sejtek 4 óra elteltével. A grafikon a DHE-vel festett sejtek mennyiségi meghatározását mutatja az Infinite M200 Pro mikrolemez-leolvasóval (Tecan, Ausztria). Három példányban öt független nap alatt.

* P a 160 uM Glu-t tartalmazó járműhöz képest, # P a 160 uM Glu-t nem tartalmazó járműhöz képest.

2.9. A citokininek hatása a kaszpáz-3/7 aktivitásra a glu-indukált sejthalál modelljében

A Glu hasonló toxikus hatást fejt ki az SH-SY5Y sejtekre, mint a HT22 sejtekre korábban közölt Xc-antiporter blokkolással kapcsolatos hatásai. Így mindkét esetben nem apoptotikus sejthalál mechanizmusok (ferroptózis, nekroptózis stb.) szerepet játszanak [62], bár a kaszpáz-3 expressziója és bizonyos mértékig az NR1 NMDA alegysége erősebben fordulhat elő SH-ban -SY5Y sejtek [61]. Ezért a sejthalál végső stádiumai a két sejtvonalban eltérőek lehetnek. Az SH-SY5Y sejtek sejthalálának Glu-indukált modelljében számos tanulmányban megfigyelték a kaszpáz-3 aktivitás hozzájáruló szerepét [62,77–79]. Ebben a vizsgálatbanidegsejtAz -szerű SH-SY5Y sejteket itt 160 mM Glu-val kezeltük, ami a kaszpáz-3/7 aktivitás növekedéséhez vezet. Az apoptózis szerepének tisztázására az SH-SY5Y sejtek Glu-indukálta halálában egy specifikus kaszpáz-3/7 inhibitort, az Ac-DEVD-CHO-t alkalmazták, és azt találták, hogy erős gátló hatással rendelkezik: 50 évesen. nM a kaszpáz-3,7 aktivitást a kezelt sejtek szintjének 23,70 ± 1,01 százalékára csökkentette

csak Glu-val és 0,5 uM-nál szinte teljesen blokkolta az aktivitást (csökkentve azt egy normalizált szintre, mindössze 7,22 ± 1,05 százalékra; ez az egészséges sejteknél megfigyelt szinthez hasonlítható):

7,8 ± 0,39 százalék ), a 7. ábra szerint. A pozitív kontrollok alkalmazása a kaszpáz-3,7 aktivitás fokozatos dózisfüggő csökkenését eredményezte. Érdekes módon a NEC-1 enyhe hatást fejtett ki, maximális hatást 50 uM-nál, a DFO pedig erősebb gátló aktivitást mutatott 10 uM-nál (az aktivitást 80,5 ± 1,85-re és 75,8 ± 3-ra csökkentette). .00 százalék , illetve). Másrészt a casp-3,7-re csak csekély, de szignifikáns hatást ért el a tZ 1 uM-nál (89,5 ± 2,50 százalék), a cZ 0,1 uM-nál (87,4 ± 1,62 százalék) és a K 1 uM-nál ( 91,0 ± 2,06 százalék). Összességében az eredmények azt mutatják, hogy mindkét pozitív kontroll erősebb kaszpáz-3/7 aktivitást csökkentő aktivitást mutatott, mint a vizsgált CK-k, de a CK-k sokkal alacsonyabb koncentrációban fejtették ki hatásukat. Összességében az eredmények azt mutatják, hogy a kaszpáz-3/7 aktivitás modulálása kulcsszerepet játszik aneuroprotektívolyan szerek, mint a DFO [58] aktivitása a Glu-indukált sejthalál modelljében [79,80]. Azonban, amint az ebben a szakaszban látható, a NEC-1 is rendelkezettneuroprotektívaktivitást, ami arra utal, hogy más típusú sejthalál is szerepet játszhat a neuronszerű SH-SY5Y sejtek Glu-indukálta halálában [63,67,81]. A NEC-1 [70], a DFO [69] és a K [18] HT22 sejtekre gyakorolt ​​hatásának elemzése során arra utaló jeleket is találtak, hogy a Glu által kiváltott sejthalálban kaszpáz-független mechanizmusok vesznek részt.

7. ábra: A kaszpáz-3/7 aktivitása az oxidatív károsodás Glu-modelljébenidegsejt-mint az SH-SY5Y sejtek. Háromszor legalább négy független napon belül. * P a 160 uM Glu-t tartalmazó járműhöz képest, # P a 160 uM Glu-t nem tartalmazó járműhöz képest.

3. Következtetések

Összefoglalva, vizsgálatunk feltárta, hogy a CK-k és metabolitjaik rendelkeznekneuroprotektívtevékenységek SAL-indukált modelljébenParkinson kórés Glu-indukált oxidatív károsodás az emberi differenciált SH-SY5Y-benneuronálissejteket. Úgy találták, hogy a K3G, a cZR és az iPR biológiailag jelentősneuroprotektívtevékenységek. Ezenkívül az aktív CK-k alacsonyabb (mikromoláris és mikromoláris) koncentrációkban is hatásosak voltak, mint a pozitív kontrollanyag, a NAC. A K3G, a cZR és az iPR pozitív hatással volt az életképességre, a citotoxicitásra, az oxidatív stresszre és a kaszpáz-3,7 aktivitásra (kivéve az iPR-t). Az ortogonális demonstrációk határozottan azt mutatják, hogy az antioxidatív stressz-aktivitás kulcsszerepet játszik a CK-k védő hatásában a SAL-indukált sejthalál modellben. A vizsgált CK-panelben csak három metabolit (tZ, cZ és K) védettidegsejt-szerű SH-SY5Y sejtek az oxidatív károsodás Glu-indukált modelljében, hasonlóan a vaskelátképző NEC1-hez és a nekroptózis-gátló DFO-hoz. Ígéretes aktivitásuk igazolására ortogonális laktát-dehidrogenáz (LDH) felszabadulási vizsgálattal teszteltük hatásukat. A CK-k mérsékelt, de jelentős protektív aktivitással rendelkeztek. Ez gyengébb volt, mint a kontroll anyagok megfelelő aktivitásai, de a moduláció eltérései ellenéreneuronálisMindhárom vizsgált CK hatékonyan csökkentette a szuperoxidgyök képződést, hasonlóan a pozitív kontroll anyagokhoz. A CK-k hasonló hatással voltak a Glu-indukált oxidatív stresszre az SH-SY5Y sejtekben, mint a NEC1 és a DFO, de ezek a vegyületek erősebben gátolták a kaszpáz-3/7 aktivitást, mint a CK-k. Mivel a Glu-indukált sejthalál nem támaszkodik kaszpáz-függő útvonalon, amint azt a DFO és NEC{8}} HT-22 sejtekre gyakorolt ​​hatását vizsgáló tanulmányok kimutatták [70], a CK-k láthatóan modulálhatják mindkét kaszpáz- függő és független sejthalál az oxidatív stressz csökkentésével [18,82]. A folyamatban lévő vizsgálatok során a CK-k részletes hatásmechanizmusa és/vagy mitokondriális hatásaik aneuronálisvagy asztrocita sejteket fognak vizsgálni.

cistanchetapasztalataPDésmemória

4. Anyagok és módszerek

4.1. Vegyszerek és reagensek

Citokinina standardokat az OlChemIm-től (Olomouc, Cseh Köztársaság) szereztük be. A Calcein AM-et (1 mg/ml oldat), és az LDH-felszabadító készletet, valamint a Neurite kinövéskészletet a ThermoFishertől vásároltuk. Propidium-jodid, dihidroetidium, kaszpáz- 3/7 vizsgálati puffer komponensei, DMEM/F12 1:1 táptalaj, magzati szarvasmarha-szérum, tripszin, ATRA, szalsolinol-hidrobromid, glutamát-mononátriumsó, deferoxamin, N-acetilcisztein A sejttenyészetekhez használt Ac-DEVD-CHO és DMSO-t a Sigma Aldrich (Merck) cégtől vásároltuk. Az Ac-DEVD-AMC szubsztrátot az Enzo Life Science szállította.

4.2. ORAC gyökfogó aktivitási vizsgálatok

A vegyületek szabad gyökök megkötő képességét in vitro az Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) vizsgálattal határoztuk meg. Röviden, fluoreszceint (100 ul, 500 mM) és 25 ul vizsgált vegyület oldatot adtunk egy 37 °C-on előinkubált 96-lyukú mikrolemezhez. Ezután 25 ul 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. SH-SY5Y sejtkultúra

Az ATCC-től (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) vásárolt SH-SY5Y humán neuroblasztóma sejtvonalat Dulbecco módosított Eagle's Medium és Ham's F12 táptalaj keverékében (DMEM: F-12, 1:1) növesztettük. ), kiegészítve 10 százalék borjúmagzati szérummal (FBS) és 1 százalék penicillinnel és sztreptomicinnel 37 oC-on, párásított 5 százalékos CO2 atmoszférában. A sejteket legfeljebb 20-szor passzáltuk, és a tápközeget hetente kétszer vagy háromszor cseréltük. A sejtsűrűséget a tervezett vizsgálatnak megfelelően (5000, 7000, 10 000 vagy 20 000 sejt lyukanként) 96-többüregű lemezeken 100 uL össztérfogatú táptalajban állítottuk be. kísérlet. Az oltást követő napon 1 százalékos FBS DMEM/F12 tápközegben ATRA-t adtunk a sejtekhez 10 uM végső koncentrációig, és az inkubálást további 48 órán át folytattuk a differenciálódás előidézése, a hosszabb idegsejtek képződésének lehetővé tétele és a proliferáció.

4.4. Mikroszkópia

Mikroszkópiai felvételeiidegsejt-szerű SH-SY5Y sejteket DM IL LED fluoreszcens mikroszkóppal (Leica Microsystems, Mannheim, Németország) a vizsgálathoz megfelelő gerjesztő szűrővel, vagy fényes mező beállítással, DP73 nagy teljesítményű digitális fényképezőgéppel (Olympus, Tokió, Japán) nyertük. ). Mivel a festés jel-zaj aránya mérsékelt volt, a kontrasztot kissé módosítottuk az ImageJ szoftverben (Fidzsi-szigetek), anélkül, hogy ez befolyásolta volna a kapott megfigyelést. Az eredeti képeket a kiegészítő anyagok tartalmazzák.

4.5. Sejtmembránfestés (Neurite Outgrowth kit, Invitrogen™)

IdegsejtA 48 órás differenciálási eljárással nyert SH-SY5Y-szerű sejteket (5000 sejt/lyuk) Neurite outgrowth kittel (Invitrogen™) festettük a gyártó ajánlásai szerint, kisebb módosításokkal. A sejteket PBS-sel mostuk, a készlethez mellékelt membránfestő festék (a 96 többüregű lemezre vonatkozó protokollt követve) PBS-ben készült oldatával jelöltük 20 percig 37 oC-on, újra mostuk PBS-sel, és fluoreszcens mikroszkóp alatt néztük meg. 533, illetve 585 nm-es gerjesztési és emissziós hullámhosszal).

4.6. Sejtkezelés

A differenciálódási eljárás után a differenciáló táptalajt 1% DMEM/F12 táptalajra cseréltük, amelyet 0,1, 1 és 10 uM koncentrációjú tesztvegyületekkel (7000-val) egészítettünk ki. sejt/lyuk a citotoxicitási tesztekhez), vagy a toxin SAL-lal együtt 500 uM (7000–10 000 sejt/lyuk) vagy 160 mM Glu (20 000 sejt/lyuk) mellett a vizsgálati típusnak megfelelő időtartamig (életképesség, sejthalál stb.). A kontrollsejteket 0,1% DMSO-t tartalmazó tápközeggel kezeltük.

4.7. Sejtéletképesség és sejthalál

Az életképességeidegsejtAz SH-SY5Y-szerű SH-SY5Y sejteket, amelyek 24 órás kezelés után 96-lyuk mikrolemezeken növekednek (kb. 7000 sejt/lyuk), a Calcein AM teszttel értékelték kis módosításokkal [31]. Az alkalmazott Calcein AM oldat PBS-ben 0,75 uM koncentrációjú volt, és az inkubációs időt 50 percre állítottuk be. Az egyes lyukakban lévő élő sejtek számát Infinite M200 Pro mikrolemez-leolvasóval (Tecan, Ausztria) határoztuk meg, 495, illetve 517 nm-es gerjesztési és emissziós hullámhosszal.

A sejthalálidegsejt-szerű sejteket (SAL-modell: 10,000 sejt/lyuk; Glu-modell: 20,000 sejt/lyuk) PI-vizsgálattal határoztuk meg, amint azt Stone et al. 2003 kis módosítással [83]. Röviden, a SAL-indukált modell tápközegét leszívtuk, és 1 ug/ml PI-oldatra cseréltük PBS-ben, de a Glu-indukciónak alávetett sejtek gyengébb adherenciájúak, ezért 1 mg/ml-es PBS-oldatot adtunk hozzá. 1 ug/ml végső koncentrációt adjon. Mindkét esetben a sejteket további 15-25 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a PI fluoreszcenciát Infinite M200 Pro olvasóval (Tecan, Grödig, Ausztria) mértük 535, illetve 617 gerjesztési és emissziós hullámhosszal. A csak toxinokkal kapott PI fluoreszcenciát 100 százalékos sejthalálnak állítottuk be.

4.8. Az oxidatív stressz mérése dihidroetidium (DHE) vizsgálattal

A sejteket differenciáltuk és kezeltük az előző részben a SAL-indukcióra vonatkozóan leírtak szerint (10,000 sejt/lyuk, 24 óra vagy Glu-indukció (20,000 sejt/lyuk, 4 óra). A kezelések során a sejteket 500 xg-vel centrifugáltuk 330 másodpercig, majd a táptalajt (leszívás után) 10 uM PBS-es DHE-oldattal helyettesítettük. A DHE fluoreszcenciát Infinite M200 Pro mikrolemez olvasóval (Tecan, Grödig, Ausztria) mértük 500, illetve 580 nm-es gerjesztési és emissziós hullámhosszal. A DHE-vel festett sejtek szemléltető fluoreszcens mikrofotói mikrolemez-leolvasóval végzett DHE mérés után készültek.

A Cistanche növénynek nagyon jó neuroprotektív hatása van

4.9. A kaszpáz-3/7 aktivitás mérése

Az egylépéses kaszpáz-3/7 vizsgálatokat egy korábban publikált eljárás szerint végeztük [84]. A SAL-indukciónak és Glu-indukciónak alávetett tenyészetek esetében a reakcióelegyeket (kaszpáz-3,7-puffer és a sejteket tartalmazó komponensek 96-többüregű lemezeken) 2 és 3 órán keresztül 37 oC-on inkubáltuk, illetőleg. A kaszpáz-3/7 aktivitást ezután Infinite M200 Pro mikrolemez-leolvasóval (Tecan, Ausztria) mértük 346, illetve 438 nm-es gerjesztési és emissziós hullámhosszal.

4.10. Statisztikai analízis

A kísérleteket három párhuzamosban végeztük, és három-öt (n {0}}–5) független napon megismételtük. Minden adatot átlag ± SEM-ben fejeztünk ki. Az összes mért változó értékeit átlag ± SEM-ben fejeztük ki, amelyeket a Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) segítségével számítottunk ki, amelyet szintén használtak az ábrák előállításához. A statisztikai elemzést a PAST (ver. 1.97) szoftvercsomaggal végeztük [85]. A differenciálási kísérlethez Student t-próbát használtunk. A többi kísérletet nem-paraméteres Kruskal–Wallis teszttel, Mann–Whitney post hoc teszttel, szekvenciális Bonferroni korrekcióval értékeltük. A p < 0,05="" értéket="" szignifikánsnak="">

Kiegészítő anyagok: Az eredeti képek online elérhetők.

A szerző hozzájárulásai: A szerzők hozzászólásai a következők voltak: Vizsgálat, módszertan, validálás, adatelemzés, GG, CWD és JG; írás – eredeti tervezet előkészítése GG, CWD és MS; adatkezelés, finanszírozás beszerzése, felügyelet, írás – áttekintés és szerkesztés, CWD, MS és PK Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás: Ezt a munkát részben a csehországi Olomouc-i Palacky Egyetem Belső Pályázati Ügynöksége (IGA{{0}}PrF_2020_021) és a Cseh Grant Agency ({{) támogatásával támogatták. 2}}S), valamint az Európai Regionális Fejlesztési Alap – ENOCH projekt (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) és hallgatói ösztöndíj a Palacky Egyetem Alapítványától.

Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata: Nem alkalmazható.

Tájékozott hozzájárulási nyilatkozat: Nem alkalmazható.

Adatelérhetőségi nyilatkozat: Az adatokat a cikk vagy a kiegészítő anyag tartalmazza.

Köszönetnyilvánítás: A szerzők köszönetet mondanak Dita Jordovdnak, Jana Hrubešovdnak és Lucie Koplikovdnak a kiváló technikai segítségért. Ezenkívül a szerzők köszönetet mondanak a Sees-editing Ltd.-nek, az Egyesült Királyságban a kézirat angol nyelvű szerkesztéséért.

Összeférhetetlenség: A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Minták elérhetősége: A vegyületek mintái nem állnak rendelkezésre a szerzőktől.