Ⅰ RÉSZ: A pachymicus sav hatásai és molekuláris mechanizmusa a vese ischaemiás reperfúziós sérülésére
Mar 25, 2022
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG és XIAO-HUI LIAO
Bevezetés
Akut vesekárosodás (AKI)gyakori klinikai betegség, amelyet többféle etiológia okoz, és összetett patofiziológiai folyamattal rendelkezik(1). Az AKI megbetegedési és mortalitási aránya felnőttek és gyermekek körében magas, ami jelentős kórházi kezelési költségeket eredményez (2,3). Az AKI globális előfordulásának metaanalízise kimutatta, hogy az AKI előfordulási aránya 21,6 százalék volt felnőtteknél és 33,7 százalék gyermekeknél, az AKI-vel összefüggő halálozási arány pedig 23,9 százalék volt felnőtteknél és 13,8 százalék gyermekeknél (4). Az AKI a kórházi betegek ~20 százalékánál fordul elő, akiknek 10 százaléka igényel vesepótló kezelést, az intenzív osztályokon pedig akár 50 százalékánál is előfordul, így jelentősen megnő a kórházi kezelés időtartama és költsége (5). a glomeruláris filtrációs sebesség éles csökkenése rövid távon, amely a szérum kreatininszintjének növekedésével, oliguriával vagy mindkettővel jár együtt; ezek a változások krónikus vesebetegséghez vagy végstádiumú vesebetegséghez vezethetnek (6). A vesekárosodás változatossága, a megbízható korai biomarkerek hiánya és a kórélettani folyamatok heterogenitása miatt jelenleg a konzervatív kezelésen és a vesepótló kezelésen kívül nincs hatékony megelőzési és beavatkozási eszköz (7). Ezért az AKI új kezelési rendjének és gyógyszereinek azonosítása különösen fontos. Az elmúlt évtizedben rengeteg olyan kutatás történt, amely kiterjesztette a nekrózis hagyományos nézetét. A legújabb kutatások megkérdőjelezték a sejthalálra vonatkozó hagyományos nézeteket azáltal, hogy új útvonalakat azonosítottak, amelyek során a sejtek szabályozott módon pusztulnak el, de a nekrózis morfológiai jellemzőit mutatják (7-9). Ennek a szabályozott nekrózisnak több formája van: nekroptózis, ferroptózis, piroptózis, mitokondriális permeabilitási átmenet által vezérelt nekrózis és parthanatosis (10). A nekroptózis és a ferroptózis a vesében előforduló szabályozott nekrózis leginkább tanulmányozott formái (11). Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a ferroptózis gátlása hatékonyan javítja az AKI-t (12).
cistanche pharma specialszámáravese
A ferroptózis a szabályozó sejthalál új típusa, amelyet először Dixon és munkatársai javasoltak 2012-ben (13). Az ilyen típusú sejthalál vasfüggő, és a sejthalál során nagymértékű vasfelhalmozódás és lipidperoxidáció kíséri (13). A ferroptózis fontos szabályozó szerepet játszik számos betegség előfordulásában és kialakulásában, beleértve a daganatokat, a neurológiai betegségeket és az AKI-t (14). Egy in vivo vizsgálatban a ferrosztatin 1-et vagy 16-86-t 15 perccel adták be ischaemia előtt egereknek szigorúischaemia-reperfúziós sérülésAz (IRI)-AKI, valamint a veseszövet károsodás, a szérum kreatinin és a karbamid szintje mind csökkent az egerekben 48 órával az ischaemia után, ami arra utal, hogy a ferroptosisnak döntő szerepe van az IRI patogenezisében.ischaemia-reperfúziós sérülés)(15). Ezért a vas homeosztázis szabályozása, a lipid-peroxidációval szembeni ellenállás és a ferroptózis gátlása ígéretes terápiás stratégiát jelenthet az AKI számára.
Pachydermic sav(PA), a Poria cocosból származó lanosztán típusú triterpenoid, számos farmakológiai hatást fejt ki, például daganatellenes, gyulladáscsökkentő, antioxidáns, hipoglikémiás, nyugtató és hipnotikus hatást (16-20). Egy korábbi tanulmány szerint a PA.(Pachiminsav)javíthatja a vesekárosodást patkányok szepszis során azáltal, hogy gátolja a gyulladásos válaszokat és aktiválja a nukleáris faktor eritroid eredetű 2 like 2(NRF2)/hem oxigenáz 1(HO-1) útvonalat az antioxidáns stresszen keresztül (21). Ezenkívül a porikoinsav A hatékonyan fokozza a melatonin gátlását a vese ischaemiát/reperfúziós sérülést követő AKI-ból krónikus vesebetegségbe való átmenet során (22). PA(Pachiminsav)véd az AKI ellen, azonban ez a védőmechanizmus további vizsgálatra szorul. PA(Pachiminsav)beszámoltak arról, hogy aktiválja az NRF2-t egy szepszisben szenvedő vesekárosodásról szóló tanulmányban (21). Nevezetesen, a ferroptózisos vizsgálatokban azonosított első két ferroptózist kiváltó ágens (RSL{3}} és elasztin) a glutation-peroxidáz 4 (GPX4) és a cisztin/glutamát transzporter rendszer (xC-/xCT) gátlásán keresztül elindítja a ferroptózis kaszkádot, mindkettő az NRF2 (23) downstream célpontja. PA(Pachiminsav)feltételezik, hogy szabályozza a downstream fehérjéket, a GPX4-et és az xCT-t az NRF2 aktiválásával és az AKI ferroptózisának megzavarásával. Jelen tanulmány célja a PA hatásának vizsgálata volt(Pachiminsav)az ischaemia-reperfúziós vesekárosodásban szenvedő egerek ferroptózisáról, és meghatározza a mögöttes molekuláris hatásmechanizmust, hogy új ötleteket adjon a klinikai AKI kezelésére.
Anyagok és metódusok
Reagensek és állatok.
PA(Pachiminsav)(99,9%-nál nagyobb vagy egyenlő tisztaságú fehér kristályos por) a MedChemExpress-től (katalógusszám: HY-N0371) vásároltuk, és fénytől távol, 4 °C-on tároltuk. Összesen 30 C57BL/6 hím egeret (8-10 hét; 20-25 g testtömeg) vásároltunk a Chongqing Medical University-től (Chongqing, Kína). A tartási feltételek a következők voltak: 12 óra világos/12 óra sötét, ~60 százalék páratartalom, 25 fok, szabad ivóvíz és élelem, valamint 3 naponta ágyneműcsere; az ivóvizet és az ágynemű anyagokat használat előtt fertőtlenítettük. Minden állatkísérletet a National Institutes of Health által 1996-ban kiadott Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához (24) szerint végeztek. A jelen tanulmányt a Chongqing Orvosi Egyetem (Chongqing, Kína; jóváhagyási szám:{17}}) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá.
Ischaemia-reperfúziós sérülés-AKI modell.
Az egereket ugyanolyan körülmények között etettük 1 hétig, hogy létrehozzuk a vese modelljétischaemia-reperfúziós sérülésa korábban leírtak szerint (25). Az egereket 50-60 mg/kg pentobarbitál-nátriummal (kat. sz. P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) érzéstelenítettük intraperitoneális injekcióval; a bőrt a műtéti területen 70 százalékos alkohollal törölték le. A bemetszés a gerinc bal és jobb oldalán történt (0,5 cm), a bemetszés hossza pedig 1-1,5 cm volt a hát mentén. A veséket ezt követően kihúzták a bemetszésből, hogy szabaddá tegyék a vesefejet. Mikroaneurizma kapcsot használtak a lábszár rögzítésére, hogy megakadályozzák a vese véráramlását és vese ischaemiát váltsanak ki. Teljes ischaemia, amelyet a vese színének néhány másodpercen belüli vörösről sötétlilára történő változása jelez. 40 perces ischaemia után a mikroaneurizma klipjeit felszabadítottuk, hogy minden vese meginduljon a reperfúzió, amit a vese színének vörösre váltása jelez. Az izombőrt összevarrták, miután a vese színe normalizálódott. A teljes vese ischaemiás eljárást termosztatikus betéten végezték el, és az egerek testhőmérsékletét állandóan 36.{11}} fokon tartottuk. Összesen 0,8 ml meleg steril sóoldatot adtunk intraperitoneálisan minden egérnek. Mindegyik állatot melegítőpárnára helyeztük, amíg teljesen magához nem tért, majd visszahelyezték a ketrecébe. Az egereket a műtét után 24 órával nyaki diszlokáció útján leöltük, és a vért az orbitális sinusból gyűjtöttük. A veseszövet egyharmadát kórszövettani elemzésekhez használták fel, a fennmaradó kétharmadot pedig gyorsan tárolták -80 fokon.
Állatcsoportok.
A C57BL/6 egereket öt csoportra osztották (n=6/csoport) egy véletlenszám-táblázat alapján, az alábbiak szerint: Ál-csoport (Sham), modellcsoport (IRI), alacsony dózisú csoport (IRI plusz PA)) , közepes dózisú csoport (IRI plusz PAw) és nagy dózisú csoport (IRI plusz PAg). A három kísérleti kezelési csoportba tartozó állatok intraperitoneális PA injekciót kaptak(Pachiminsav)5, 10 és 20 mg/kg dózisban. de 3 napig, mielőtt a modellt kiváltották volna. A színlelt és az IRI(ischaemia-reperfúziós sérülés) csoportokat azonos térfogatú dimetil-szulfoxiddal injektáltuk 3 napig a modellindukció előtt. A modellezési módszert a korábban leírtak szerint végeztük (25). Az ál-csoportba tartozó egerek kétoldali veseköcskéit szabaddá tettük, és a fent említettek szerint kezeltük, de nem rögzítettük. A műtéti metszést 40 perc múlva varrták.
Szérum biokémiai elemzés.
Az egereket a műtét után 24 órával leöltük, és 0.8-1 ml vért vettünk az orbitális sinusból, hagytuk pihenni 30 percig, és 900xg-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A felső szérumréteget összegyűjtöttük, becsomagoltuk és -80 fokon tároltuk. A szérum kreatinint (Scr; kat.n.c ).
Hisztopatológiai vizsgálat.
24 órával az IRI után(ischaemia-reperfúziós sérülés), a veseszövetek egy részét 10 százalékos semleges pufferolt formalinban fixáltuk 24-48 órán keresztül szobahőmérsékleten, és rutinszerűen paraffinba ágyazva dolgoztuk fel. A paraffinnal fixált szövetmintákat 4 μm vastag metszetekre vágtuk, amelyeket üveglemezekre helyeztünk, és szobahőmérsékleten 10 percig hematoxilinnel, szobahőmérsékleten 3 percig eozinnal festettük. BX51 fénymikroszkópot (Olympus Corporation) használtunk a vese kórszövettani elváltozásainak kimutatására (nagyítás, x200 és x400). A Paller-pontszámot a vese tubuláris nekrózisának minősítésére használták vese IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)(26). Összesen 10 nem átfedő területet választottunk ki véletlenszerűen nagy nagyítás mellett optikai fénymikroszkóp segítségével (nagyítás, x400), és 10 vesetubulust választottunk ki véletlenszerűen minden látómezőben. Minden kísérleti csoportban három egér vesepatológiai metszeteit véletlenszerűen választottuk ki megfigyelésre. Minden kóros metszethez összesen 10 látómezőt választottunk ki véletlenszerűen, és minden látómezőben 10 vesetubulust értékeltünk. Egérenként összesen 100 tubulust figyeltek meg, így minden csoportban összesen 300 vesetubulust figyeltek meg. Minél magasabb a pontszám, annál súlyosabb a vesetubulusok károsodása.
Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM).
A veseszövetet 24 órával a műtét után gyűjtöttük össze. Az érzéstelenítést követően 1 mm²-es veseszövetet in vivo eltávolítottunk, és 2,5%-os glutáraldehidet és foszforsav pufferoldatot (katalógusszám: G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) tartalmazó szövetrögzítő oldatba áztattunk 2 órán át 4 fokon, dehidratálva. fokozatos etanol (50-100 százalék) és propilén-oxid, beágyazva az Epon 812-be (kat. sz. GP18{{20}}10; Bejing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. 1 órán keresztül 35 fokos hőmérsékleten Ultravékony metszeteket (vastagság, 50-70 nm) 200-hálós rézrácsokra helyeztünk, és 30 percig szobahőmérsékleten 2% uranil-acetáttal és 0,04% ólom-citráttal festettük. 15 percig szobahőmérsékleten. A mintákat elektronmikroszkóp alatt néztük meg (JEM-1400 plus, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; nagyítás, x5,000 és x10,{{27} A képeket SlowScan töltéscsatolt eszköz kamerával és TEM analySIS5.0 szoftverrel (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH) készítettük.
Antioxidáns glutation (GSH) és lipid-peroxidációs malondialdehid (MDA) kimutatása.
A veseszövetet (50-100mg) összegyűjtöttük, és fiziológiás sóoldatot (katalógusszám: B020; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) adtunk a szövethez 1:9 tömeg(g):térfogat (ml) arányban. A szövetet homogenizáltuk, hogy 10%-os szövethomogenizátumot kapjunk, amelyet 13 800 xg-vel 15 percig 4 °C-on centrifugáltunk. A felülúszót eltávolítottuk, és a felülúszó teljes fehérjetartalmát a bicinkoninsav módszerrel (21) határoztuk meg. A GSH(kat. sz.
Western blot.
A teljes fehérjét egér veseszövetéből RIPA sejtlízis pufferrel (kat. sz. WO{{0}}; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) extraháltuk, és a fehérjekoncentrációt BCA-teszttel (kat. sz. A{) határoztuk meg. {1}}; Nanjing Jiancheng Biomérnöki Intézet). Egyenlő mennyiségű fehérjét (50μug) választottak el SDS-PAGE(Cox-2,10) segítségével.0 ;NRF2,10.0;xCT,12.5;HO-1, 12.5; GPx4.15.0% ) és PVDF membránokra vittük (GE Healthcare Life Sciences), majd a membránokat 5 százalékkal blokkoltuk sovány tejport 1 órán át szobahőmérsékleten, majd a következők elleni elsődleges antitestekkel inkubáltuk: ciklooxigenáz 2(COX-2;1:1,000; kat. sz.ab179800;Abcam), GPX4( 1:5,000;cat.no.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;cat.no.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 ,000 kat.sz.101147;Gentex)és NRF2 (1:1,000;kat.sz.D1Z9C;CST)egy éjszakán át 4 fokon. A membránokat ezt követően TBST-vel (0,1% Tween) mostuk -20) háromszor. Az elsődleges inc ubáció, a membránokat torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk (1:10, 000;40295G; BIOSS) 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A membránokat háromszor újramostuk TBST-vel, és BeyoECLPlus-szal (kat. szám P00185; Beyotime Institute of Biotechnology) tettük láthatóvá Chemi Doc Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Inc.) segítségével. A fehérjesávok intenzitását a következővel határoztuk meg: ImageJ v1.8.0 szoftver (National Institutes of Health). Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk.
Reverz transzkripciós-kvantitatív (RT-g)PCR.
A különböző csoportokban lévő egerek veséiből a teljes RNS-t TRIzol reagenssel (Takara Bio, Inc.) extraháltuk, és a cDNS-t a PrimeScript RT Reagent készlettel gDNA Eraserrel (katalógusszám RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) szintetizáltuk. A célgének relatív szintjét qPCR-rel határoztuk meg Ultra SYBR Mixture (Takara Biotechnology Co., Ltd.) alkalmazásával. Az RT-qPCR-t 25 ul térfogatban 2 ul cDNS-sel, 400 nM szensz és antiszensz primerrel és 12,5 ul Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix-tel (Takara Bio, Inc. ABI PRISM 7000 rendszeren (Applied Biosystems; Thermo Fisher) végeztük. Scientific, Inc.). A reakciót 40 denaturációs ciklusban, 95°-on 30 másodpercig, 53°-on 30 másodpercig végzett annealing és 72°-os extenzió 10 másodpercig végeztük. A következő primer szekvenciákat használtuk a qPCR-hez: GPX4 forward ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' és hátrafelé,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 előre, 5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' és hátrafelé,5'-GTTGAAACTGAGGGAA {28}}';xCT előre, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' és hátrafelé,5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 előre,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'és hátrafelé,5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3';HO-1 előre.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' és hátrafelé,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; és -aktin előre,5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' és fordított,5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3".
A génexpresszió -aktin normalizálás utáni átlagos értékét használtuk kalibrátorként a célgének relatív szintjének meghatározására. A célgének relatív expressziós szintjét a 2-△C módszerrel (27) számítottuk ki.
Statisztikai analízis.
A statisztikai elemzést a GraphPad Prism 7.{1}}(GraphPad Software, Inc.) és az SPSS 23 szoftver (IBM Corp.) segítségével végeztük. Az adatok három független ismétlés átlag± szórásaként vannak megadva, hacsak másképp nem jelezzük. Egyirányú ANOVA-t, majd Tukey post hoc tesztjét használtuk a több csoport közötti különbségek összehasonlítására<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Eredmények
PA(Pachiminsav)csökkenti a vesekárosodást IRI-ben szenvedő egerekben(ischaemia-reperfúziós sérülés). Az Scr és a BUN a vesefunkció két fontos mutatója (5). Az Scr és a BUN szintje szignifikánsan magasabb volt az IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport a színlelt csoporthoz képest (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Pachiminsav)szignifikánsan mérsékelte a szérum kreatinin és karbamid növekedését az IRI-hez képest(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport (P<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Pachiminsav)kezelési csoport és az IRI(ischaemia-reperfúziós sérülés) group (P>0.05; 1A és B) ábra).
Amint az 1D. ábrán látható, a veseszövetek H&E-festése az ál-csoportban nem mutatott jelentős változást a veseszövet szerkezetében. Ezzel szemben az IRI(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoportban ödémát és vese tubuláris epiteliális sejtjeinek elvesztését, tubuláris tágulást, intersticiális gyulladást, gyulladásos sejtinfiltrációt, kollagénlerakódást és lerakódási csőnekrózisos anyagot mutattak ki (1D. ábra). A Paller-pontszám, amely a veseszövet sérülését jelzi (26), szignifikánsan magasabb volt az IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoportok az ál-csoporthoz képest (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pachiminsav)a terápia jelentősen javította ezeket a léziókat, és a Paller-pontszám szignifikánsan alacsonyabb volt az IRI-hez képest(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport (P<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(ischaemia-reperfúziós sérülés) model group and the low-dose group (P>0.05; 1C. ábra).
1. ábra PA(Pachiminsav)enyhíti a vesekárosodást ischaemia-reperfúziót követően.(A) BUN- és (B) szérum kreatinint mértek egerekben a Sham, IRI-ben.(ischaemia-reperfúziós sérülés), IRI plusz PAL, IRI plusz PAM és IRI plusz PAH csoportok (40 perces vese ischaemia, majd 24 órás reperfúzió; n=6/csoport). (C) A Paller pontszámokat használták a vesetubuláris sérülés minősítésére a Sham, IRI, IRI plusz PAL, IRI plus PAM és IRI plus PAH csoportokban (n=3/csoport). (D) Hematoxilin és eozin képek a vesékről a Sham, IRI egerekből(ischaemia-reperfúziós sérülés), IRI plusz PAL, IRI plusz PAM és IRI plusz PAH csoport. Skála, 50 µm. Az adatokat átlag ± standard deviáció formájában adjuk meg. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Pachiminsav), pachydermic sav; BUN, vér karbamid-nitrogén; IRI,ischaemia-reperfúziós sérülés; L, alacsony dózisú csoport; M, közepes dózisú csoport; H, nagy dózisú csoport.
A PA hatásai(Pachiminsav)az egerek veseszövetében a mitokondriumok morfológiai változásairól vese IRI-t követően(ischaemia-reperfúziós sérülés). A TEM nem mutatott ki szignifikáns változást a veseszövet mitokondriális szerkezetében az ál-csoportban. A modellcsoportban ferroptózissal összefüggő mitokondriális változásokat, például csökkent mitokondriális térfogatot, megnövekedett membránsűrűséget és csökkent vagy hiányzó mitokondriális krisztákat figyeltek meg a veseszövetben (2A. ábra). A modellcsoporthoz képest a közepes dózisú csoport mitokondriumai főleg ödémát mutattak, és a ferroptózisra jellemző specifikus elváltozások ritkák (2A. ábra). A nagy dózisú PA-ban azonban(Pachiminsav)csoportban nem figyeltek meg jellegzetes ferroptózis-változásokat a veseszövet mitokondriumaiban, és csak enyhe ödéma volt kimutatható (2A. ábra). A mitokondriumok változásai az alacsony dózisú csoportban ugyanazok voltak, mint a modellcsoportban (2A. ábra).
A PA hatásai(Pachiminsav)a GSH és az MDA expressziójára a vese IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés). A GSH a GPX4 működéséhez szükséges kofaktor. A GSH szintézis közvetlenül befolyásolja a GPX4 aktivitást. Az MDA a lipidoxidáció terméke, amely tükrözi az intracelluláris lipidperoxidáció mértékét, és közvetve a ferroptózis előfordulását (28, 29). Amint azt a 2B. ábra mutatja, a veseszövetekben szignifikánsan alacsonyabb volt a GSH szintje az IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport összehasonlítva a színlelt csoporttal. A gyógyszeres kezelési csoportok közül a GSH expresszió szignifikánsan magasabb volt az IRI plusz PA és IRI plusz PAn csoportokban az IRI-hez képest(ischaemia-reperfúziós sérülés)modellcsoport (P<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Ezzel szemben, amint az a 2C. ábrán látható, a szöveti lipidperoxidáció nagyobb volt (az MDA-szintek alapján) az IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport összehasonlítva a színlelt csoporttal. A gyógyszeres kezelési csoportok közül az MDA szintek szignifikánsan alacsonyabbak voltak az IRI plusz PA és IRI plusz PAu csoportokban az IRI-hez képest(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport (P<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
2. ábra PA(Pachiminsav)csökkenti a ferroptózist az IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)-akut vese sérülés.(A) Transzmissziós elektronmikroszkópos képek a Sham, IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés), IRI plusz PAL, IRI plusz PAM és IRI plusz PAH csoportok (40 perces vese ischaemia, majd 24 órás reperfúzió). Nagyítás, x20, 000; skálasáv, 1 µm. A fekete nyilak azt jelzik, hogy a veseszövetben csökkent a mitokondriális térfogat, a membránsűrűség nőtt és csökkent, vagy eltűntek a mitokondriális cristae-k. A kék nyilak mitokondriális ödémát jeleznek. Felmérték a (B) GSH és (C) MDA szintjét a veseszövetekben (n=6/csoport). Az adatokat átlag ± standard deviáció formájában adjuk meg. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport. PA(Pachiminsav), pachydermic sav; IRI,ischaemia-reperfúziós sérülés; L, alacsony dózisú csoport; M, közepes dózisú csoport; H, nagy dózisú csoport; GSH, glutation; MDA, malondialdehid.
PA(Pachiminsav)szabályozza a ferroptózissal kapcsolatos fehérjék expresszióját a vese IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés). Jelen tanulmányban a ferroptózissal összefüggő fehérjék GPX4, xCT és HO-1 expressziós szintjét Western-blot (3A. és B. ábra) és RT-qPCR (3C. ábra) analízissel detektáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a GPX4, xCT és HO-1 fehérjeszintje szignifikánsan lecsökkent az IRI-ben.(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport a színlelt csoporthoz képest (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pachiminsav)szignifikánsan megnövelte a GPX4, xCT és HO-1 fehérje és mRNS expressziós szintjét az IRI-hez képest(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport (P<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(ischaemia-reperfúziós sérülés)és alacsony dózisú PA(Pachiminsav) treatment groups (P>0.05; 3B és C ábra).
3. ábra PA(Pachiminsav)növeli a ferroptózissal kapcsolatos fehérjék, a GPX4, xCT és HO-1 expressziós szintjét.(A) Western-blot vizsgálatot végeztünk a ferroptózissal kapcsolatos fehérjék, a GPX4, xCT és HO-1 expressziós szintjének kimutatására IRI-ben.(ischaemia-reperfúziós sérülés)-akut vesekárosodást okozó egerek (n=3). (B) A GPX4, xCT és HO-1 szürkeértékeinek relatív kifejezése. (C) Reverz transzkripciós-kvantitatív PCR analízist végeztünk a ferroptózissal kapcsolatos fehérjék mRNS expressziós szintjének kimutatására (n=3). Az adatokat átlag ± standard deviáció formájában adjuk meg. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport. PA(Pachiminsav), pachydermic acid; GPX4, glutation-peroxidáz 4; xCT, glutamát transzporter rendszer; HO-1, hem oxigenáz 1; IRI,ischaemia-reperfúziós sérülésy; L, alacsony dózisú csoport; M, közepes dózisú csoport; H, nagy dózisú csoport.
Az eredmények azt mutatták, hogy a ferroptózissal összefüggő lipidperoxidációs fehérje, a COX{1}} fehérje- és mRNS-szintje szignifikánsan megemelkedett az IRI során.(ischaemia-reperfúziós sérülés)(4. ábra). Kezelés közepes és nagy dózisú PA-val(Pachiminsav)jelentősen csökkentette a COX{0}} expressziót az IRI-hez képest(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport (P<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(ischaemia-reperfúziós sérülés)és alacsony dózisú PA(Pachiminsav) treatment groups (P>0.05; 4. ábra).
4. ábra PA(Pachiminsav)csökkenti a ferroptózissal kapcsolatos fehérje, a COX-2 expressziós szintjét.(A) Western blottingot végeztünk a ferroptózis lipid-peroxidációs marker fehérje, a COX-2 expressziós szintjének kimutatására IRI-akut vesekárosodásban szenvedő egerekben. (B) A COX-2 szürkeértékeinek relatív kifejeződése. (C) Reverz transzkripciós-kvantitatív PCR analízist végeztünk az mRNS COX-2 expressziójának kimutatására (n=3). Az adatokat átlag ± standard deviáció formájában adjuk meg. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport. PA(Pachiminsav), pachydermic sav; COX-2, ciklooxigenáz 2; IRI,ischaemia-reperfúziós sérülés; L, alacsony dózisú csoport; M, közepes dózisú csoport; H, nagy dózisú csoport.
PA(Pachiminsav)elősegíti az NRF2 jelátviteli útvonal aktiválását a vese IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés).A PA hatásának vizsgálata(Pachiminsav)az NRF2 jelátviteli útvonalon az NRF2 fehérje és mRNS szintjét értékeltük (5. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy az NRF2 expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt az IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport összehasonlítva a színlelt csoporttal. Ezenkívül az NRF2 expressziója szignifikánsan magasabb volt az IRI plusz PAw és IRI plusz PAH csoportokban az IRI-hez képest.(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport (P<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Továbbá PA-kezelés(Pachiminsav)dózisfüggő módon is növelte az NRF2 expresszióját (5. ábra).
5. ábra PA(Pachiminsav)aktiválja az NRF2 jelátviteli útvonalat.(A) Western blottingot végeztünk az NRF2 fehérje expressziójának kimutatására IRI-ben(ischaemia-reperfúziós sérülés)- akut vesekárosodást okozó egerek. (B) NRF2 szürkeértékeinek relatív kifejezése (n=3). (C) Reverz transzkripciós-kvantitatív PCR analízist végeztünk az mRNS NRF2 expressziójának kimutatására (n=3). Az adatokat átlag ± standard deviáció formájában adjuk meg. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(ischaemia-reperfúziós sérülés)csoport. PA(Pachiminsav), pachydermic sav; NRF2, nukleáris faktor eritroid eredetű 2 hasonló 2; IRI,ischaemia-reperfúziós sérülés; L, alacsony dózisú csoport; M, közepes dózisú csoport; H, nagy dózisú csoport.
