további információ:ali.ma@wecistanche.com

rész: II. Vese- és vesén kívüli megnyilvánulások a cisztinózis felnőtt zebrahal-modelljében

2.3.5. Ctns−/− Zebrafish jelenléte a szaruhártya megnövekedett vastagsága

Cisztinózishatással van a szemre, ami cisztin felhalmozódást eredményez több szövetben, például az íriszben, a kötőhártyában és a retina hámjában, azonban a cisztin felhalmozódása miatt a szaruhártya a leginkább érintett rész [19] és megnövekedett vastagságot mutat [20]. H&E festéssel megállapítottuk, hogy a ctns−/−zebrafish a szaruhártya stromális rétegének vastagsága megnövekedett a vad típusú (10A, B, E) zebrahalhoz képest. Azonban nem tártunk fel nyilvánvaló rendellenességeket a ctns−/−zebrafish retina epitéliumában (10C, D ábra).

9. ábra Átlagos úszási sebesség vad típusú és ctns−/−zebrafish esetén. Az átlagos sebesség mindkét nemben csökkent a ctns−/−zebrafish esetében a vad típushoz képest. Az átlagos úszási sebességet pixel/másodpercben mérik. Minden pont egy zebrahalat jelöl, összesen n=6 vad típusú és n=6 ctns−/−18- hónapos zebrahalat. Kétirányú ANOVA Fisher-féle legkisebb szignifikáns különbség (PLSD) teszttel: ** p <>

1. ábra0. Szemszövettan vad típusú és ctns−/− zebrahalban. (A, B) Reprezentatív képek vad típusú (A) és ctns−/− (B) 18-hónapos zebrahal szaruhártyájáról. A szaruhártya stromális rétege (fekete nyílhegyek és fekete vonalak). H&E festés. A skálasávok 50 µm-t képviselnek. (C,D) Reprezentatív képek a vad típusú (A) és ctns−/− (B) zebrahal retinájáról. H&E festés. A skálasávok 50 µm-t képviselnek. (E) A szaruhártya stromaréteg vastagságának relatív mennyiségi meghatározása. Minden pont a szaruhártya stromális rétegének vastagságának egy fikcióját jelenti. Páratlan t-próba Welch-korrekcióval, kétirányú: * p <>

2.3.6. További Ctns−/− Zebrafish fenotípusok

A fent említett fenotípusokon kívül elvégeztük az agy és a petefészek szövettani analízisét anélkül, hogy különbséget találtunk volna a vad típusú zebrahal és a vad típusú zebrahal között. Ezenkívül értékeltük a ctns-/- és a vad típusú zebrahal testhosszát és súlyát 18 hónapos korukban, és megnövekedett testsúlyt tapasztaltunk, miközben mindkét nemnél megnövekedett testhosszt találtunk a ctns-/-zebrafia esetében a vad típushoz képest (S1. ábra).

3. Vita

Az elmúlt évtizedek soráncisztinózisa gyermekkori halálos betegségből kezelhető anyagcserezavarrá alakult át, amellyel a betegek túlélhetik a felnőttkort és elérhetik az előrehaladott kort [21,22]. A betegek hosszabb túlélése új betegségfenotípusokat tárt fel, és új kérdéseket vetett fel a terápiák patogenezisével és hosszú távú hatásaival kapcsolatban. Ebben a tekintetben a cisztinózis felnőtt állatmodelljeinek tanulmányozása egyre relevánsabbá válik.

Jelen vizsgálatunkban a vesét és az extrarenálist vizsgáltuk 18 hónapos cisztinozin és felnőtt zebra-modell megnyilvánulásai, ami megfelel a 40-50 éves emberi életkornak [23,24]. Először is validáltuk, hogy a felnőtt ctns−/− zebrafish modell az egész testet és a különböző szervek cisztinfelhalmozódását mutatja be. Ban,-benveseSzövettani szinten a PTEC károsodás jeleit figyeltük meg, amelyeket számos hialinszerű eozinofil csepp jelenléte, citoplazmatikus vakuólumok és a kefeszegélyek részleges elvesztése tükröz. Ezenkívül a ctns-/-hím zebrahal glomeruláris hipertrófiát fejlesztett ki. Végül kimutattuk, hogy a hasított kaszpáz 3 expressziója megnövekedett a ctns-/-zebrafish vese PTEC-jében, ami azt jelzi, hogy az apoptózis részt vesz a zebrahal nephropathiás cisztinózisának patogenezisében. Mivelcisztinózisbetegek extrarenalis is jelen vannak megnyilvánulásait, a ctns−/− mutáció hatását vizsgáltuk más szervekben zebrahal modellünkben. Érdekes módon azt találtuk, hogy a ctns-/-mutáció károsodást okozott a bőr anatómiájában, és hatással van a termékenységre, a mozgási aktivitásra és a szemekre.

A lizoszómák az intracelluláris emésztés helyei, és a sejtmetabolizmus létfontosságú koordinátoraiként tartják számon [25]. Mivel lizoszómális raktározási betegség, a legfontosabb jellemzője acisztinózisa lizoszómális cisztin felhalmozódása [26,27]. Érdekes módon 54-szeresére nőtt a cisztinszint a 18-hónapos cisztinózis-zebrafia teljes testében a vad típushoz képest, míg korábbi vizsgálatunkban [10] a cisztinózis zebrahal lárvái 6 nappal a megtermékenyítés után 13-szeres növekedés. Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a cisztin felhalmozódik élete során a cisztinózisos zebrahalban. A folyadékkromatográfia és a tömegspektrometriás analízis megerősítette, hogy az összes szerv közül,vesea cisztin felhalmozódásának preferált helye. A cisztinnel töltött PTEC-ben lizoszómális duzzanatot és hialinszerű eozinofil cseppeket jelentettek a lizoszómákban [28,29], és humán biopsziákban a cisztinkristályok polimorf alakterekként jelennek meg az intersticiális makrofágokban és a PTEC citoplazmában [27]. Az emberi szövetben a cisztin felhalmozódása és kristályosodása az élet során felhalmozódó folyamat. Az inline cisztinkristályok nem voltak kimutathatók a ctns-/-zebrafish lárvaállapotában [10], míg kísérleti kísérleteink során azt találtuk, hogy a cisztinkristályok polimorf alakja 3 és 6 hónapos korban jelenik meg, és jól látható. 18- hónapos korban, ami a cisztinózis hatásainak fokozatos romlására utalvese.

Kattintson ideCisztán hatása vesebetegségre

A glomerulusok szövettani változásainak felmérésére megmértük a Bowman-kapszula felületét, a glomeruláris csomót és a ctns−/−zebrafish Bowman-terét a PAS-festett metszeteken. Azt találtuk, hogy a ctns-/-zebrafish glomeruláris hipertrófiát fejlesztett ki, ami hiperfiltrációra utal. A zebrahalon megfigyelt enyhe glomeruláris károsodás a zebrahal regenerációs képességének tulajdoníthatóvese, képes új nefronokat hozzáadni, valamint a meglévő nefronokat javítani [30].

A szövettani károsodás mellett kimutatták, hogy a cisztin felhalmozódása aktiválja a proteinkinázt, amely apoptózist vált ki a PTEC-ben[12]. Így értékeltük a hasított kaszpáz-3 expressziót PTEC-ben, és azt találtuk, hogy a ctns−/−zebrafish fokozott kaszpáz-3 és nukleáris fragmentációt mutatott. A hasított kaszpáz-3 jelenlétét főként a citoplazmatikus vakuolákat felhalmozó sejtekben találták meg, ami arra utal, hogy a sérült PTEC-ben apoptózis megy végbe. Egy további mechanizmus, amely megmagyarázhatja a megnövekedett apoptózist, a reaktív oxigénfajták jelenléte lehet a cisztin felhalmozódásával összefüggő csökkent glutation miatt [31]. További vizsgálatokra van azonban szükség annak értékelésére, hogy ez a mechanizmus a ctns−/−zebrafish esetében is előfordul-e.

Habárveseezek az első és legsúlyosabban érintett szervek,cisztinózisegy multiszisztémás betegség, amelyben különböző szervek, például bőr, ivarmirigyek, szemek és izmok érintettek. A szakirodalomból ismert, hogy a cystinosisos betegek bőre gyakran idő előtti öregedéssel, szőke hajjal és világos bőrszínnel jelentkezik [13]. Ez utóbbi fenotípus a cisztinozin transzporternek a melaninszintézis szabályozásában való részvételének köszönhető[32], valamint a sötétebb pigmentáció fenntartásának az újonnan felfedezett MFSD12 cisztein transzporter révén [33]. Izgalmas módon a felnőtt ctns−/−zebrafish modellünk hipopigmentált és foltos bőrmintázatot mutatott, és károsodott melanineloszlást mutatott, ami nem volt megfigyelhető a lárvaállapotban [10].

Továbbá,cisztinózismeddőséget okoz a férfiaknál, míg a nőkről ismert, hogy termékenyek [14]. A legújabb adatok azt sugallják, hogy a meddőség oka lehet progresszív heredegeneráció, ami a sperma minőségének megváltozásához vezet, vagy a férfi kiválasztó rendszer egy meghatározatlan részének elzáródása miatt. Az eltömődött struktúrák befolyásolhatják a sperma minőségét, különösen azokon a területeken, ahol a csatornák nagyon kis átmérőjűek, például a retetestisben[16]. Az inzebrafák, a genicprocessis spermája nagyon hasonlít az emlősökéhez; azonban az egyik fő különbség az, hogy a spermatogenezis a cisztákban megy végbe [34]. Vizsgálatunk során a ctns−/−zebrafish spermatogén cisztájában megnövekedett hímivarsejteket találtunk, azonban heredegenerációra utaló jeleket nem találtunk. Ezért a leírt fenotípus a herék szintjén elzáródásra utalhat, ami a spermiumok kevésbé kibocsátásához vezet a környezetben, azonban további vizsgálatok szükségesek ennek a hipotézisnek a megerősítéséhez. Funkcionális szinten a csökkent petékszám és a megtermékenyített peték csökkenése a ctns−/−zebrafish termékenységének károsodását tükrözi.

Egy másik klinikai megnyilvánulásacisztinózisA betegeket általában az élet második évtizedétől érinti a myopathia, amelyet izomsorvadás és gyengeség jellemez [1]. Érdekes módon azt találtuk, hogy a ctns-/-kifejlett zebrafák csökkent mozgási aktivitást mutatnak a kontrollhoz képest, ami az izomműködés károsodására utal. Megjegyzendő, hogy ez a fenotípus nem volt jelen a lárvákban [10], ami arra utal, hogy a betegség későbbi szakaszában a ctns−/−zebrafish-t érinti. Ennek ellenére az izmokban látható szövettani eltérést nem észleltünk. A csökkent mozgási aktivitás hátterében a mitokondriális diszfunkció állhat, amelyet rutin szövettani vizsgálatokkal nem lehetett kimutatni [35–37]. Ezért a cisztinózisos zebrahal mitokondriumainak átfogó jellemzése további értékelést igényel.

A fent említett fenotípusokon kívül számos tanulmány kimutatta, hogy a cisztinózisos betegek szemtüneteket is mutatnak, mint például fényfóbia és blepharospasmus [1], ahol a szaruhártya a szem egyik leginkább érintett része, ami cisztinkristály-felhalmozódást és megnövekedett vastagságot eredményez [20]. A szaruhártya megnövekedett vastagságának okairól azonban keveset tudunk. Például azt feltételezték, hogy a leírt fenotípus az epiteliális és/vagy endoteliális sejtek szubklinikai diszfunkciójának köszönhető, amely tostromaledemához vezet[20]. Vizsgálatunk során azt találtuk, hogy a ctns−/−felnőtt zebrafishdisplay megnövekedett a szaruhártya stromális rétegének vastagsága, ami azt jelzi, hogy modellünk a szaruhártya diszfunkciójának jeleit mutatja.cisztinózis.

Cistanche azértvesefunkció

Az egyik fő hiányosság, amelyet be kell pótolni az átfogó megértéshezcisztinózisaz emberi betegséget teljes mértékben összefoglaló állatmodell hiánya. Számos egérmodellt fejlesztettek ki, amelyek cisztin felhalmozódást mutatnak, de nem képesek reprodukálni a teljesvese-fenotípus [8,26]. Pontosabban, a C57BL/6 egér cisztin felhalmozódást mutatott számos szervben, ami az életkorral növekszik [8]. Ezenkívül a C57BL/6 egérmodell 6 hónapos kortól proximális tubuláris elváltozásokat mutat. Hasonlóképpen, modellünkben a proximális tubuláris elváltozások idővel súlyosbodnak. Glomeruláris szinten azonban a C57BL/6 egérmodell normális fenotípust mutatott, míg a felnőtt zebrahal modellünk glomeruláris hipertrófiát mutat. Ezenkívül a C57BL/6 egérmodell nem utánozza az embereknél megfigyelt károsodott termékenységet, míg a ctns-/-zebrafish modell spermiumokban gazdag spermatogén cisztákat és csökkent petetermelést mutat. A szem szintjén mind az egér[38], mind a zebrahal-modell szemrendellenességeket mutat. Éppen ellenkezőleg, a bőr szintjén ez az egérmodell nem mutat károsodott melatonintermelést [8], ami a felnőtt zebrahal modellben hipopigmentált bőrmintázatként jelenik meg. Végül viselkedési szinten a ctns−/− zebrafish modellünk csökkent mozgási aktivitást mutat, aminek oka lehet a mitokondriális funkció károsodása, vagy a megnövekedett testtömeg másodlagos hatása.cisztinóziszebrahal. Összességében úgy tűnik, hogy a ctns−/− zebrafish modellünk jobban összefoglalja az emberi betegséget. Nemrég Shimizu et al. új, kongenikus Ctnsugl mutációt hozott létre egy bemutatott patkánytörzsbenvese-léziók és cisztinkristályok a lizoszómáiban avesekéreg [7]. A modell részletesebb jellemzése azonban még hiányzik. Ezért sürgősen szükség van olyan új funkcionális modellek kidolgozására és jellemzésére, amelyek összefoglalják az emberi betegségeket.

Összefoglalva, kimutattuk, hogy felnőtt ctns−/− zebrafish modellünk a cisztin homokozó számos humán fenotípusát reprodukálja, és hasznos lehet a betegség patogenezisének tanulmányozására felnőtteknél, valamint új gyógyszerek hosszú távú hatásainak tesztelésére a vese- és az extraktum korrekciójára.vese-megnyilvánulásai.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Zebrafish karbantartása és tenyésztése

A zebrafish kezelése és karbantartása a KU Leuven állatjóléti előírásainak megfelelően történt (142/2019-es etikai engedély). Ebbe a vizsgálatba bevontuk a 18 hónapos ctns-/-zebrafish-t és a vad típusú kontroll-zebrafát mindkét nemben. A ctns−/−zebrafish létrehozásának részleteit korábbi tanulmányunkban írtuk le [10].

4.2. Cisztin mérés

A cisztinszintet a zebrahalban mértük (vad típusú hímhal,n=3és ctns−/−hím hal, n=3), és a mennyiséget nmol/mg fehérjékben fejeztük ki. Először a zebrákat tricain-metánszulfonát MS-222 (300 mg/L) merítéssel leöltük, majd a szövetmintákat ultrahanggal kezeltük 200 µl 5 mM N-etil-maleimid (NEM, St. Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS), lizátumonként legfeljebb 200 mg szövetre. Ezt követően 100 µl 12%-os szulfosalicilsavat (SSA) adtunk minden homogenizátumhoz, és a mintákat 12,{15}} g-vel centrifugáltuk 10 percig, 4 °C-on. A cisztint tartalmazó felülúszókat –80 °C-on tároltuk az analízisig, míg a pelleteket egy éjszakán át 4 °C-on 300 µl 0,1 M NaOH-ban oldottuk, és –80 °C-on tartottuk, amíg a fehérje mennyiségét Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit segítségével meg nem mérjük. Ezt követően a cisztin mennyiségét (nmol) az egyes mintákból származó fehérje mennyiségére (mg) normalizáltuk. Ezután 50 µl felső, cisztint tartalmazó felülúszót 50 µL belső standard oldattal (Cystine d6) megtöltünk, és 5 másodpercig vortexeljük; majd az elegyet 200 µl acetonitrillel extraháltuk, 30 másodpercig vortexeltük, majd 16,000 g-vel 9 percig centrifugáltuk. A folyadékkromatográfiás és tömegspektrometriás analízist egy UHPLCAgilent1290InfinityII6470 (Agilent technology, Santa Clara, CA, USA) készülékkel végeztük, amely pozitív ion (ESI plusz) üzemmódban működő ESI-JET-STREAM forrással volt felszerelve. A berendezés vezérléséhez és az adatok elemzéséhez használt szoftver a MassHunter (Agilent Technologies munkaállomás, Barcelona, ​​Spanyolország) volt. Az alkalmazott elválasztóoszlop InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100 × 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Hematoxilin és eozin, valamint időszakos savas eltolódásos festés

Zebrafish (vad típusú nőstény hal, n=3; vad típusú hím hal, n=3; ctns−/−nőstény hal, n=3; ctns−/−hím hal, n=3) trikain-metánszulfonát MS-222 (300 mg/L) merítéssel feláldoztuk, majd az egész zebrahalat 4 százalékos pufferolt paraformaldehidben (4 százalék PFA) rögzítettük 4 ◦ C-on 1 hétig. . Miután kétszer mostuk PBS-sel, a zebrákat EDTA-oldatba (100 mM, pH=8) vittük át vízkőtelenítés céljából további 1 hétig, majd paraffinba ágyaztuk. Leicamikrotomon (LeicaBiosystems, Wetzlar, Németország) levágott paraffinba ágyazott zebraszövet (4-µm vastagság). A metszeteket H&E-vel és PAS-szal festettük meg a szabványos protokollok szerint.

A zebrahalak (vad típusú nőstényhal, n=3és ctns-/-nőstény hal, n=3) szövettani vizsgálatai során a szemeket kifejtettük, és 4 százalékos PFA-ban rögzítettük szobahőmérsékleten 4 órán át. A következő beágyazás optimális vágási hőmérsékletű közegbe (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japán), 10-µm-es kriometszetek készültek (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokió, Japán). A metszeteket H&E-vel festettük meg a szabványos protokollok szerint. A képek Leica fénymezős mikroszkóppal (Leica DM6, Wetzlar, Németország) készültek.

4.4. Immunhisztokémia (hasított kaszpáz-3 festés)

A frissen vágott zebrahalszövetet tartalmazó metszeteket paraffinmentesítettük és rehidratáltuk. A metszeteket 10 mM citrát pufferrel (pH=6) hő által indukált antigén-kinyerésnek vetettük alá. 5%-os normál kecskeszérummal (NGS) dPBS-ben történő blokkolást követően a metszeteket nyúl anti-hasadás kaszpázzal-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, 1:200 hígítás) inkubáltuk, majd anti-nyúl. -Envision, HRP-vel jelölt másodlagos antitest (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Negatív kontrollként normál nyúlszérumot használtunk. Diaminobenzidint (DAB, DAKO, Glostrup, Dánia) használtunk kromogénként. Ezt követően a metszeteket H&E-vel ellenfestettük, dehidratáltuk és felhelyeztük.

Vesebetegség kezelése: Cistanche

4.5. Toluidine kék festés és TEM

Zebrahalvese-szöveteket (vad típusú hím zebra, n=3 és ctns−/−hím zebrafish, n=3) begyűjtöttük, és az EM fixációs pufferben rögzítettük (1,5% glutáraldehid/1% paraformaldehid). . Ezt követően a veseszöveteket 2,5% glutáraldehid/1,2% akrolein fixációs pufferben (0,1 mol/L kakodilátok, 0,1 mol/L szacharóz, pH 7,4) és 1 ml utófixálták. százalékos ozmium-tetroxidot, és a gyantába ágyazva. A félvékony metszeteket (0.5-µm vastagság) toluidin kékkel festettük. Az ultravékony metszeteket uranil-acetáttal festettük meg. A képeket JEM-1200 EX transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEOL Ltd., Tokió, Japán) gyűjtöttük, különböző nagyításokkal.

4.6. Digitális képelemzés

A megfestett tárgylemezeket Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Hollandia) segítségével digitalizáltuk.

4.6.1. Glomeruláris hipertrófia elemzése

A zebrahal glomeruláris hipertrófiájának elemzéséhez a Bowman-kapszula, a Bowman-tér és a glomeruláris köteg felületét (µm2) megmértük PAS-festett tárgylemezeken. A metszetenkénti összes rendelkezésre álló glomerulust bevontuk, és ImageJ szoftverrel mértük. A statisztikai elemzéshez az egyes zebrahal méréseinek átlagát használtuk fel.

4.6.2. Hasított kaszpáz-3 kifejezéselemzés

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 százalék pozitív festődés). A statisztikai elemzéshez az egyes zebrahalak pontszámának átlagát használtuk.

4.6.3. A szaruhártya stroma elemzésének vastagsága

A zebrahal szaruhártya strómájának vastagságát (10-szeres nagyítás) a szem középpontjától azonos távolságra mértük ImageJ szoftver segítségével zebrahalon. Minden egyes képhez n=7 mérést végeztünk a szemszakasz különböző helyein (centrális, középső, periféria) a szaruhártya mentén 100 µM-os időközönként. A statisztikai elemzéshez a mérések átlagát használtuk fel.

4.7. Termékenységi tanulmány

A termékenységet nőstény és hím zebrahal (vad típusú hím hal, n=4 és vad típusú nőstény hal, n=6 és ctns−/−hím, n=4 és ctns−/−nőstény hal, n=6) ívási tálcán. Másnap reggel, egy órával a világítás után, az embriókat összegyűjtöttük, és feljegyeztük a termelt peték teljes számát. A megtermékenyített petéket szűrtük, és fénymikroszkóppal megszámoltuk a nem termékenyektől. A tenyésztést hetente n=7 alkalommal végeztük egymás után. Két olyan kísérletet kizártunk, amelyek egyidejűleg nem termeltek petéket vad típusú és ctns-/-zebrahal esetében.

4.8. Mozgásszervi tevékenység

Zebrafish (vad típusú nőstény hal, n=6; vad típusú hím hal, n=6; ctns−/−nőstény hal, n=6; ctns−/−hím hal, n=6) a normál lakóegységekben helyezték el, és 5 perces adaptációs idő után 5 percig filmeztek. A videófelvétel a tartály tetejére helyezett GoPro® HERO 7-el készült, így felülnézetben látható az úszó hal. A felbontást és a képsebességet 1080 p-re (1920 × 1080), illetve 30 fps-re állítottuk. A videókat az idTracker segítségével elemeztük. A kísérlet során nyomon követték az egyén zebra pályáit. A pályákat ezt követően egyedi python kóddal elemeztük, hogy kiszámítsuk az átlagos mozgási sebességet (pixel/sec) minden csoportban [39].

Cisztanche-vese

4.9. Testsúly és hossz mérések

A zebrákat 300 mg/Loftricaine-methanesulfonate MS-222 oldatba merítve öntötték le. A külső ingerekre adott válasz hiányának ellenőrzése után az elaltatott zebrákat papírzsebkendőre helyezték és megszárították. Az elaltatott zebrahal hosszát tolómérővel határozták meg, a száj hegyétől a faroktőig. Az elaltatott zebrahal súlyát analitikai mérleggel értékelték.

4.10. Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést SPSS (IBM, New York, NY, USA) és GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla) segítségével végeztük. Két csoport adatait nem párosított t-próbával elemeztük Welch-korrekcióval, kétirányú. Két kategorikus független változó adatait kétirányú ANOVA-val elemeztük Fisher-féle legkisebb szignifikáns különbség (PLSD) teszttel. A p < 0,05="" különbségeket="" statisztikailag="" szignifikánsnak="">

4.11. Termékenységi tanulmány

A vad típusú és a ctns-/-zebrafish tojástermelési arányának összehasonlításához Poisson-regressziós analízist végeztünk általános becslési egyenletekkel, robusztus standard hibákkal, hogy figyelembe vegyék az arányok és a kísérletek közötti korrelációt. A vad típusú és a ctns−/−zebrafish közötti esélyajánlatok összehasonlításához általánosított becslési egyenleteket alkalmazó logisztikus regressziós analízist végeztünk robusztus standard hibákkal, hogy figyelembe vegyék a kísérleteken belüli esélyek korrelációját.

Kiegészítő anyagok: A következők online elérhetők a https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22179398/s1 címen.

A szerző közreműködése: Conceptualization, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; módszertan, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; szoftver SPB, JH, LDG, HT, TN; érvényesítés, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB és EL; formális elemzés, SPB, JH, LDG, HT, TN; nyomozás, LvdH, HJB, EL; források, HJB és EL; adatkezelés, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; írás – eredeti tervezet előkészítése SPB, JH; írás – áttekintés és szerkesztés, LvdH, HJB, EL; vizualizáció, LvdH, HJB, EL; felügyelet, PdW, LvdH, HJB, EL; projekt adminisztráció, LvdH, HJB, EL; finanszírozás megszerzése, HJB, EL Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás: A szerzők szeretnének elismerni a KULeuvenC1GranttoE.L. belső támogatását. (C14/17/113), The China Scholarship Council Grant to JH (CSC n◦ 201508500109), és az FWO posztdoktori ösztöndíja az LDG-nek (12I3820N).

Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata: A tanulmányt a Helsinki Nyilatkozat irányelvei szerint végezték, és a KU Leuven n.142/2019 etikai bizottsága hagyta jóvá. Köszönetnyilvánítás: Szeretnénk köszönetet mondani: Didier Cagnininek az agy szövettanának kiértékeléséért mind a ctns-/-, mind a vad típusú zebrahal esetében, KathleeenLambaerts-nek, FrédéricHendrickx-nek és KimvanKelstnek a KU Leuven vízi létesítményében nyújtott állandó támogatásukért és segítségükért, Peter Nees-nek. a TEM, Ron Wolterbeek pedig a statisztikai elemzéshez.

Érdekellentét: A szerzők összeférhetetlenséget jelentettek be. A finanszírozók nem vettek részt a tanulmány tervezésében; az adatok gyűjtésében, elemzésében vagy értelmezésében; a kézirat megírásában, vagy az eredmények közzétételéről szóló döntésben.

Hivatkozások

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cisztinózis: Áttekintés. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [CrossRef]

2. Jezegou, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; et al. A PQLC2 heptahelikus fehérje egy lizoszómális kationos aminosav-exportőr, amely a ciszteamin hatásának hátterében állcisztinózisterápia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN A nephropathiás cisztinózis prognózisának javítása. Int. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [CrossRef]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Vendég, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; et al. A ciszteamin terápia késlelteti a nephropathiás cisztinózis progresszióját késői serdülőkben és felnőttekben. KidneyInt. 2012, 81, 179–189. [CrossRef]

5. Cherqui, S. Ciszteamin terápia: A cisztinózis kezelése, nem gyógymód. Kidney Int. 2012, 81, 127–129. [CrossRef]

6. David, D.; Princero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E. A cisztinózis molekuláris alapjai: földrajzi eloszlás, a CTNS gén mutációinak funkcionális következményei és a javítás lehetősége. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. A Ctns gén deléciója vesetubuláris diszfunkciót és cisztin felhalmozódást okoz LEA/Tohm patkányokban. Mamm. Genom 2019, 30, 23–33. [CrossRef]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. A vese fenotípusacisztinózisaz egérmodell a genetikai háttértől függ. Nephrol. Tárcsa. Transzplantáció 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN GeneticVeseBetegségek: A zebrafish modellek feltörekvő szerepe. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. A cisztinózis(ctns)zebrafishmutánsok pronefrikus glomerulák és tubuláris diszfunkciót mutatnak. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco, MA;Najafian,B.;Alpers,CE;Fogo,ABAJKDAVesepatológiai osztály:Cisztinózis. Am. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [CrossRef]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Fokozott apoptózis cisztinotikus fibroblasztokban ésvese-proximális tubulus epiteliális sejtek a protein kináz C delta ciszteinilációjából származnak. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [CrossRef]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; et al. Fokozott belső öregedés nephropathiás cisztinózisban, nagy felbontású optikai koherencia tomográfia alapján. J. Invest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [CrossRef]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Termékenységi állapot ciszteaminnal kezelt férfi cisztinózisos betegekben. Fertil. Steril. 2010, 93, 1880–1883. [CrossRef]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Első sikeres fogantatás, amelyet egy férfi cisztinózisos beteg váltott ki. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Herék működése csecsemőkori nephropathiás cisztinózisban szenvedő férfiaknál. Zümmögés. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Cisztinózisban szenvedő nők terhessége. Clin. Kidney J. 2019, 12, 855–858. [CrossRef]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Idiopátiás intrakraniális hipertónia cisztinózisban. J. Pediatr. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Christopher, K.; Chauhan, A. A stromális kollagén potenciális szerepe a cisztin kristályosításában cisztinózisban szenvedő betegeknél. Int. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [CrossRef]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA A szaruhártya vastagsága nephropathiás cisztinózisban. Br. J. Ophthalmol. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Cisztinózis: A kezelhető betegség kialakulása. Pediatr. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. A hosszú távú ciszteamin-kezelés hatásai betegeknélcisztinózis. Pediatr. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) mint modell az öregedés és a testmozgás vizsgálatához: A fizikai képességek és az edzhetőség az életkorral csökken. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Élettartamok és öregedő fenotípusok a Zebrafish két törzsében (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [CrossRef]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Lizoszóma biogenezis és lizoszóma membránfehérjék: Trafficking meets function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [CrossRef]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; et al. Intralizoszomális cisztin felhalmozódása cisztinózisban nem szenvedő egerekben, a cisztinózisban hibás fehérje. Mol. Sejt. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [CrossRef]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. A dedifferenciáció és az endolizoszomális kompartment aberrációi jellemzik a nephropathiás cystinosis korai stádiumát. Zümmögés. Mol. Közönséges petymeg. 2014, 23, 2266–2278. [CrossRef]

28. Hard, GC Néhány segítséget nyújt a hialincsepp-nephropathia szövettani felismerésében kilencven napos toxicitási vizsgálatok során. Toxicol. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [CrossRef]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. A cisztin intracelluláris eloszlása ​​cisztinnel töltött proximális tubulusokban. Pediatr. Res. 1994, 35, 447–450. [CrossRef]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Zebrafish használata podocita genezis tanulmányozására a vese fejlődése és regenerációja során. Genesis. 2014, 52, 771–792. [CrossRef]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. A lizoszómális cisztin felhalmozódása elősegíti a mitokondriális depolarizációt és a redox-érzékeny gének indukcióját humán vese proximális tubuláris sejtjeiben. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [CrossRef]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Chat, P.; et al. A cisztinozin egy melanoszomális fehérje, amely szabályozza a melanin szintézist. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [CrossRef]

33. Adelmann, CH; Traunbauer, AK; Chen, B.; Condon, KJ; Chan, SH; Kunchok, T.; Lewis, CA; Sabatini, DMMFSD12 közvetíti a cisztein melanoszómákba és lizoszómákba történő bejutását. Természet 2020, 588, 699–704. [CrossRef]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW A zebrahal (Danio rerio) spermatogenezisének szövettani és sztereológiai értékelése, különös tekintettel a spermatogoniális generációkra. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Rendellenes mitokondriális autofágia nephropathiábancisztinózis. Autofágia 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Az atipikus mitokondriális ciklikus-AMP szint hatása nephropathiás cisztinózisban. Sejt. Mol. Life Sci. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. MitochondrialDynamicsofProximalTubularEpithelialCellsinNephropathic Cystinosis. Int. J. Mol. Sci. 2019,21,192. [CrossRef]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; et al. A cisztinózisos állatmodell szem anomáliái a betegség patogenezisét utánozzák. Pediatr. Res. 2007, 62, 156–162. [CrossRef]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: A jelöletlen állatok kis vagy nagy csoportjaiban lévő összes egyed nyomon követése. Nat. Módszerek 2019, 16, 179–182. [CrossRef]