A vese CD169 plus plusz a rezidens makrofágok kulcsfontosságúak az akut szisztémás candidiasis elleni védelemben
Mar 21, 2022
BevezetésA szisztémás candidiasis a negyedik gyakori véráramban előforduló nozokomiális fertőzés, amely a becslések szerint évente több mint 250,{1}} intenzív osztályos beteget érint, annak ellenére, hogy a kórházakban betartják a higiéniai gyakorlatokat (Delaloye és Calandra, 2014; Kullberg és Arendrup, 2015). Bár a fertőzés jelenlegi kezelése főként gombaellenes szereket alkalmaz, a betegek halálozási aránya továbbra is riasztóan magas (40–60 százalék) (Delaloye és Calandra, 2014; Bassetti és mtsai, 2018; Lamoth és mtsai, 2018). Klinikailag azonban a mai napig nem állnak rendelkezésre vakcinák. A krónikus betegségekben szenvedő fekvőbetegek növekvő populációja és a gombaellenes gyógyszerekkel szembeni rezisztencia újonnan kialakuló esetei miatt fontos lesz a gazdaszervezet ilyen fertőzésekkel szembeni immunitásának megértése az immunterápia fejlesztése során, hogy javítsák vagy kiegészítsék a jelenlegi gombaellenes beavatkozásokat (Armstrong-James et al, 2017; Desai). et al, 2017; Bassetti et al, 2018). Az invazív gombaellenes immunitás központi szereplőjeként ismert fagociták, különösen a polimorfonukleáris fagociták (neutrofilek) különféle mechanizmusokat alkalmaznak a gombás fertőzések, például a fagocitózis, a reaktív oxigénfajták (ROS) és a mikrobicid fehérjék felszabadulása, valamint a NETosis kialakulásának szabályozásában. Borregaard, 2010; Mantovani et al, 2011). A neutrofilek kulcsfontosságú szerepét a Candida immunitásban tovább erősíti a neutropenia és a neutrofil defektusok klinikai kapcsolata, mint a szisztémás candidiasisra hajlamosító tényezők (Lehrer és Cline, 1969; Wisplinghoff és mtsai, 2004; Pfaller és Diekema, 4par, 2007); . Azonban sokkal kevésbé ismert a különböző mononukleáris fagociták szerepe ebben a fertőzésben in vivo, részben amiatt, hogy nem állnak rendelkezésre eszközök a különböző makrofágok és dendritsejtek alcsoportjainak körülhatárolására.vese,amelyek a szisztémás candidiasis fő célszervei (Schraml és mtsai, 2013; Gottschalk és Kurts, 2015).
Kulcsszavak:vese; vesekárosodás; veseszövet; vese gombás; vesekárosodás; veseműködés
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE MŰKÖDÉSÉT
A makrofágok fontosságát az invazív Candida immunitásban legjobb tudásunk szerint először Lionakis és munkatársai (2013) bizonyították erősen. Kihasználva a CX3CR1gfp/gfp egereket, ahol a számuk avese-A makrofág populáció nagymértékben csökken, Lionakis és munkatársai (2013) kimutatták, hogyvese-a rezidens makrofágok a döntő első vonalbeli védők C. Albicans támadásával szemben (Lionakis et al, 2013). Ezenkívül úgy tűnt, hogy ezek a makrofágok részt vesznek a neutrofilek toborzásának szabályozásábanveseCandida fertőzés során (Kanayama et al, 2015). A gombák kiürülésének elősegítése mellett a makrofágokról számoltak bevese-szövetjavítás (Tran et al, 2015). A CD169, más néven Sialoadhesin vagy sziálsavkötő immunglobulin-szerű lektin 1 (Siglec-1), korábban beszámoltak arról, hogy egy specifikus marker, amely azonosítja a szövetben rezidens makrofágokat (TRM-eket) különböző perifériás szervekben, például a tüdőben. , lép, máj, ésvese(Purnama és mtsai, 2014; Karasawa és mtsai, 2015; Gupta és mtsai, 2016; Svedova és mtsai, 2017). Érdekes módon,vese-A CD169 plusz makrofágokat összefüggésbe hozták az immunregulációval, akár az immunpatológia előrehaladása, akár az immunrendszer feloldása felé, a betegség/sérülés modelltől függően (Chavez-Galan és mtsai, 2015). Keveset tudunk azonban a CD169 plusz makrofágok in vivo funkcionális szerepéről a szisztémás Candida immunitásban. Itt ezt mutatjuk megvese-A CD169 plusz plusz makrofágok fontos immunszabályozók az akut szisztémás Candida fertőzésben. A CD169 plusz plusz makrofágok hiánya csökkenti az IFN-választ és a neutrofil ROS-termeléstvese.Ennek eredményeként a CD169 plusz makrofágokat nem tartalmazó egerek kis dózisú Candida-fertőzésben szenvednek, ami rendkívül nagy gombásodást és súlyos fertőzést mutat.vese-immunpatológia.
Eredmények
A CD169 plusz plusz makrofágok a vese TRM-ek egy alpopulációjaA vese TRM-ek vizsgálatára egy CD{0}}DTR transzgénikus egérmodellt használtunk, amely specifikusan megszünteti a diftériatoxin (DT) kezelés hatására a TRM-eket CD169 expressziójuk miatt (Purnama et al, 2014; Gupta et al, 2016; Chen & Ruedl , 2020). A CD169 mellett az F4/80 magas expressziós szintjét és a CD11b közepes szintjét használtuk a többi citometriai analízisben, hogy megkülönböztessük a TRM-eket más makrofág-alpopulációktól (Sheng és mtsai, 2015) (1A. ábra). Érdekes módon csak egy részevese-Az F4/80hi CD11bint makrofágokat abláltuk a DT-vel kezelt CD{3}}DTR transzgenikus egereinkben (1A és B ábra), ami arra utal, hogy az F4/80hi CD11bint makrofág populáció heterogenitásavese.Megfigyelésünkkel párhuzamosan Karasawa és munkatársai (2015) arra is rámutattak, hogy avese-A TRM-ek a CD169-et expresszálják (Karasawa et al, 2015). Különösen azt mutatták ki, hogy a CD169 plus plus TRM-ek főként avese-velős régióban, ami megerősíti immunfluoreszcens festéseinket (1C. ábra).
Itt megjegyeztük, hogy az ablált CD169 plusz TRM-ek mérsékelten alacsonyabb szintű F4/80 és CD11b (F4/80 plusz plusz CD11b plus ), míg a nem csökkentett TRM-ek viszonylag magasabb F4/80 és CD11b (F4/80 plus plus) szinteket fejeznek ki. plusz CD11b plusz plusz). Ez a két TRM populáció azonban nem különböztethető meg a WT egerekben (1A ábra). Ezért az ablált és nem csökkentett TRM-ek alapján nagy vonalakban alkategóriákba soroltuk őket az I. frakcióba (Fr I) (CD169 plusz plusz F4/80 plusz plusz CD11b plus ) és II. frakcióba (Fr II) (CD169 plusz F4/80 plus plus plus plus CD11b). plusz plusz ) populációk (1A és B ábra). Figyelemre méltó, hogy a CD169-DTR egerek Fr II populációjának észrevehető, de jelentéktelen csökkenése azt is jelzi, hogy az Fr II populáció egy része CD169-et expresszál. A CD169-DTR egér TRM ablációs profilja összhangban van a CD169 transzkriptum expressziójával, ahol az Fr I populáció szignifikánsan magasabb szintű CD169-et expresszál, mint az Fr II populáció (1D. ábra). Ennek megfelelően a humán heparinkötő EGF-szerű növekedési faktor (HB-EGF), a DT receptora magasabb szintjeit figyelték meg az Fr I-ben az Fr II TRM-ekhez képest, ami megmagyarázza a DT-kezelésre való érzékenységüket (1E. ábra).
A CISTANCHE JAVÍTJA A vese-/veseelégtelenséget
A vese CD169 plusz makrofágok hiánya nagymértékben veszélyeztette a gazdaszervezet rezisztenciáját a disszeminált candidiasissal szemben.A CD169 plusz plusz makrofágok fontosságának felmérésére a CD169-DTR és WT egereket iv. fertőzöttük alacsony, 5 × 104 cfu C. Albicans dózissal, és túlélésüket 18 napon keresztül követtük. A fertőzés során az egereket folyamatosan DT-vel kezelték, hogy biztosítsák az Fr I populáció folyamatos ablációját CD169-DTR egerekben (S1. ábra). A Fr I makrofágok részleges csökkenését is megfigyelték fertőzött WT egerekben a fertőzés utáni 3. napon (pi) (1F ábra), ami a makrofág nekroptózis eredménye lehet, amely eseményről számoltak be a patogén fertőzések során (Lai et al. , 2018; Cao et al, 2019). Ezzel szemben a CD{11}}DTR egerekben az Fr I makrofágok teljes ablációja túlnyomórészt a DT-kezelés által kiváltott apoptózisnak köszönhető. Mindazonáltal a CD{12}}DTR egerekben az Fr I makrofágok száma következetesen és lényegesen alacsonyabb volt, mint a WT egerekben a fertőzés során. Másrészt az Fr II makrofágok teljes száma összehasonlítható volt a fertőzött WT és CD{13}}DTR egerek között (1F. ábra, jobb oldali panel). Következésképpen a CD169-DTR egerek, amelyekből hiányoztak az Fr I TRM-ek, kifejezetten sebezhetőbbek voltak, mint a WT egerek, amikor szisztémás Candida fertőzéssel támadták őket (1G. ábra).
CX3CR1gfp/gfp egereket korábban használtak a funkciójának lekérdezéséreveseTRM-ek a teljes vesztesége miattvese-F4/80 plusz CD11b plusz populáció (Lionakis et al, 2013). A CX3CR1gfp/gfp és a CD169-DTR egerek összehasonlítása tehát lehetővé teszi számunkra, hogy megértsük a renális TRM-populáció részleges és teljes elvesztése közötti funkcionális következményeket. Ennek elérése érdekében CD169-DTR, CX3CR1gfp/gfp és WT egereket fertőztünk meg 5 × 104 cfu C. Albicans-szal. A korábban közöltekhez hasonlóan a CX3CR1gfp/gfp egerek a vese TRM-ek teljes hiányát mutatták (mind az Fr I, mind a II populációban), míg a CD169-DTR egereknél az Fr I populáció jellegzetesebb elvesztése (S2A és B ábra). ). Ennek megfelelően az Fr I és II makrofágok hiánya miatt a CX3CR1gfp/gfp egerek nagyon fogékonyak voltak a szisztémás candidiasisra (S2C ábra), és már az 1. pi napon rendkívül magas vesegomba-terheléssel, összehasonlítva a fertőzött WT-vel és CD-vel.{20 }}DTR egerek (S2D ábra). Ezzel szemben a CD169-DTR egerek alacsonyabb mortalitást mutattak, mint a CX3CR1gfp/gfp egerek (1G és S2C ábra), ésvese-A gombás terhelés csak a 10. napon volt szignifikánsan magasabb, mint a fertőzött WT egereknél (2A és B ábra). Mivel a DT-kezelt CD169-DTR és CX3CR1gfp/gfp egerekben más szervekben hiányoznak a TRM-ek (Hochheiser és mtsai, 2013; Gupta et al, 2016; Lee és mtsai, 2018), több perifériás szerv gombaterhelését is felmértük. , vagyisvese,agy, szív, tüdő, máj és lép, fertőzött WT, CD{0}}DTR és CX3CR1gfp/gfp egerekben az 1. pi napon Érdekes módon CD169-DTR és CX3CR1gfp/gfp egerekben, vesékben ezek voltak az egyetlen szervek, amelyek kifejezetten nagyobb gombás terhelést mutattak, mint a többi vizsgált szerv (S2D ábra). A megnövekedett Candida-terhelés a CX3CR1gfp/gfp vesékben az 1. napon megerősíti a Lionakis és munkatársai (2013) által közölt eredményeket.vese-A TRM-ek létfontosságúakvese-első vonalbeli védekezés a szisztémás Candida fertőzés ellen (Lionakis et al, 2013).
Másrészt avese-A CD{0}}DTR egerekben a gombás terhelés szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a CX3CR1gfp/gfp egerekben, de nem volt egyértelműen magasabb, mint a fertőzött WT egerekbenveseaz 1. napon pi (S2D ábra). Mivel az Fr II populáció viszonylag érintetlen marad CD169-DTR egerekben (S2A és B ábra), megkérdőjeleztük, hogy a CD169-DTR egerekben megfigyelt megnövekedett rezisztencia a CX3CR1gfp/gfp egerekkel összehasonlítva főként a fennmaradó, változatlan vese Fr II makrofágok miatt, amelyek megakadályozzák a legtöbb C. Albicans behatolását a vesetubulusokba, egy olyan területre, ahol nagyon kevés immunsejtet észleltek az egyensúlyi állapot alatt. Ebből a célból figyelemmel kísértük a WT és CD169-DTR egerek különböző szerveinek gombás terhelését az 1., 3., 6. és 10 pi napon (2. ábra). Itt adataink a CD169 plusz makrofágok vese-korlátozott függőségét mutatták a gomba kiürülésében, mivel a CD169-DTR egerekben a vesék kivételével az összes vizsgált szerv tisztult a C. Albicanstól a 10. pi napra (2A. ábra) . Érdekes módon az Fr I alcsoport elvesztése ellenére a CD169- DTR egerekben a gombás terhelés hasonlóan növekedett, mint a fertőzött WT egerekben (0–6. nap) (2A és B ábra), ami arra utal, hogy a vese CD169 plusz minimális szerepe van. makrofágokat, hogy első vonalbeli védelmet váltsanak ki ezzel a fertőzéssel szemben. A CD169-DTR és WT egerek vese gombás terhelése közötti különbséget csak a 10. pi napon észlelték, amikor is a CD169-kimerült vesék gombaterhelése tovább nőtt, míg a WT egerek gombaterhelése úgy tűnt zárva vagy törölve (2B. ábra). Ezért adataink bizonyítják a CD169 plusz makrofágok nélkülözhetetlen szerepét a vese Candida immunitásában, de valószínűleg csekély mértékben járulnak hozzá a vese első vonalbeli védelméhez az ilyen fertőzésekkel szemben. Meglepő módon, mivel a CX3CR1gfp/gfp egerekből hiányoztak mind az Fr I, mind az Fr II makrofágok, és már a pi 1. napján fokozott érzékenységet mutattak (S2 ábra), feltételeztük, hogy az Fr II CD169 plusz makrofágok túlnyomórészt felelősek a korai vesegombák kritikus veleszületett mechanizmusáért. ellenőrzés.
A CD{0}}DTR egerek visszafordíthatatlan, progresszív vesekárosodásban szenvedtek a Candida fertőzés soránMivel a vesék voltak az egyetlen olyan szervek, ahol a fertőzés során felhalmozódott a C. Albicans (2A. ábra), ezután elvégeztük a periódussav-Schiff (PAS) (2C. ábra) és H&E (3A. és S3. ábra) festett metszetek hisztopatológiai vizsgálatát. fertőzött WT és CD169-DTR vesékből a 3., 6. és 10 pi napon A 3. napon vesekárosodás és vérzés jeleit figyelték meg a CD169-DTR vesékben (S3A ábra). A 6. napon a fertőzött WT vesék a tubulus- és endoteliális károsodás kisebb jeleit mutatták, míg a fertőzött CD{12}}DTR vesék súlyosabb vérzéseket és tubuláris nekrózist mutattak (S3B. ábra). Mind a fertőzött WT, mind a CD{14}}DTR vesékben a legtöbb C. Albicans a vesemedencében halmozódott fel (2C. ábra). Figyelemre méltó, hogy a leukociták in situ felhalmozódtak mind a WT, mind a
CD169-DTR vesék, ami arra utal, hogy a C. Albicans kontrollálatlan növekedése a CD169-DTR vesékben nem a leukociták felszaporodásának hiányára vezethető vissza (2C. és 4A. ábra). A 10. napon a CD169-DTR vesék szerkezeti integritása romlott, amit fibrotikus szövetek megjelenése kísért (3A. és S3C. ábra). Pontosabban, a Bowman-tér megnagyobbodása, valamint a tubuláris epiteliális sejtek és a leukociták klasztereinek feltűnő leválása a CD169-DTR vese egyes vesetubulusainak lumenében jól látható volt (3A. ábra). Ezzel szemben a 10. napon a WT-vesék veserégióinak többsége érintetlen maradt, jelezve a korai fertőzésből való felépülést (3A. és S3C. ábra). A veseszövettani vizsgálatokkal párhuzamosan felmértük a vesekárosodás molekula-1 (Kim-1) szintjét a fertőzött WT és CD169- DTR vesében, amely egy típusú-1 transzmembrán fehérje ahol expressziója csak a vesetubulusok sérülése esetén fokozódik (Ichimura et al,
1998; Han és mtsai, 2002; Bonventre, 2009). Adataink azt mutatták, hogy a Kim-1 expressziója a fertőzött CD169-DTR egerek veséjében drasztikusan magasabb volt, mint a fertőzött WT-ben a 10. pi napon (3B. ábra). Ezenkívül a CD169-DTR egerek veséjében az endothel bélés integritása jelentősen legyengült, amint azt a CD169-DTR vesékben nagyobb mennyiségű Evan's Blue visszatartotta (3C. ábra). A CD169 plusz makrofágokról korábban kimutatták, hogy gyulladásgátló hatásúak, ahol ezeknek a makrofágoknak a hiánya túlzott gyulladáshoz vezetett bakteriális fertőzés vagy ischaemia-reperfúziós sérülés esetén (Karasawa és mtsai, 2015; Svedova és mtsai, 2017). Ezekkel a modellekkel összhangban a CD169-DTR egerek veséi magasabb szintű gyulladással (azaz TNF-, G-CSF és M-CSF) társultak, és a vesefunkció drámaian károsodott, amikor
A vese CD169 plusz makrofágok hiánya nem rontotta az effektor sejtek felvételét a Candida fertőzés soránMivel a Candida nem hatékony kiürülése a CD{0}}DTR vesékben az effektorsejtek hiánya miatt következhet be, megfigyeltük a neutrofil és monocitás infiltrációt WT és CD169-DTR egerek veséjében. a 0., 1., 3., 6. és 10. pi napon Szövettani megfigyeléseinkhez hasonlóan (2C. ábra), a vese CD169 plusz Fr I makrofágok hiánya nem befolyásolta a leukociták felszaporodását a fertőzés során (4A. ábra). Ehelyett a CD169-DTR vesék a neutrofil- és monocitavonzó kemokinek (pl. CXCL1, CXCL2 és CCL2) és sejtadhéziós molekulák (pl. ICAM-1) magasabb expressziójával voltak összefüggésben (4B. ábra) és C). A CD169-DTR vesében a kemokinek megnövekedett szintje, amely potenciálisan a C. Albicans gátlástalan növekedése miatt korrelál az immunsejtek megnövekedett mennyiségű infiltrációjával a 6. naptól a 10. napig. Ezzel szemben kevés jele volt annak, C. A WT vesékben lévő albicanok és az immunsejtek nagyrészt kiürültek a 10. napon (pi) (2B. és 4A. ábra). Így adataink arra utalnak, hogy a vese CD169 plusz plusz makrofágok nem voltak a fő szereplők az effektorsejtek, különösen a neutrofilek toborzásában a Candida fertőzés során.
A CD{0}}DTR vesékben lévő neutrofilek alacsonyabb ROS-termelést eredményeznekEzt követően megvizsgáltuk, hogy a CD169 plusz plusz makrofágok hiánya károsan befolyásolja-e a gazdaszervezet vese candidacid válaszát. Ebből a célból felmértük a ROS-termelő neutrofilek és monociták mennyiségét a fertőzött WT és CD169-DTR vesékben a 6. pi napon – azon a napon, amikor mind a WT, mind a CD169-DTR vesék hasonló gombaterhelést mutattak. és celluláris infiltráció (2B. és 4A. ábra). Érdekes módon alacsonyabb mennyiségű ROS-termelő neutrofilt figyeltünk meg, de nem monocitákat, a CD{8}}DTR vesékben a WT-vel összehasonlítva (5A és B ábra). Ennek megfelelően ezek a neutrofilek a CD{10}}DTR vesékben szignifikánsan alacsonyabb ROS-szintet generáltak, mint a WT-ben lévők, ami alacsonyabb neutrofilpusztító képességre utal (5C. és D. ábra).
Ezt követően azt kerestük, hogy a CD{0}}DTR vesék csökkent candidacid funkciójához hozzájárult-e a neutrofilek csökkent életképessége. Meglepő módon mind a fertőzött WT, mind a CD{1}}DTR vesék hasonló arányban mutattak PIneg annexin V plusz apoptotikus és PI plusz annexin V plusz elhalt neutrofileket (5E és F ábra). Ez azt jelzi, hogy a neutrofilek életképessége nem egyike azoknak a tényezőknek, amelyek hozzájárultak károsodott candidacid funkciójukhoz CD169-DTR vesékben A vese IFN expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt CD169 plusz plusz makrofágok hiányában A nem hatékony Candida clearance és a csökkent ROS összefüggése A CD169-DTR vesék neutrofiljeinek szintje arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk az IFN expressziós szintjét fertőzött WT és CD169- DTR vesékben a 6. pi napon. Erről a citokinről ismert, hogy védelmet nyújt az invazív candidiasis ellen, mivel fokozza a neutrofilek kandidátus képessége (Diamond és munkatársai, 1991; Kullberg és mtsai, 1993; Stevenhagen és van Furth, 1993; Nader-Djalal és Zadeii, 1998). Érdekes módon csökkent vese-IFN-expressziót figyeltünk meg fertőzött CD169-DTR vesékben qPCR-rel (6A. ábra), valamint más citometriás elemzéssel (6B. ábra).
Az IFN-termelő sejtek egy CD19int kappa-könnyűlánc plusz sejtpopulációra korlátozódnakEzt követően megkíséreltük körülhatárolni azon immunsejtek típusát, amelyek a 6. pi napon IFN-t termelnek (7A. ábra). Meglepetésünkre ezek az IFN-termelő sejtek a Ly6CintLy6Glo, F4/80loCD11blo, MHCII plusz CD11clo, CD49bnegCD3neg és CD8negCD4neg, ami azt jelzi, hogy nem T-limfociták, klasszikus APC-k és granulociták. Ehelyett ezek az IFN-termelő sejtek, amelyek egyértelműen csökkentek a fertőzött CD169-DTR vesékben (7B. ábra), MHCII-t, kappa-könnyűláncot és CD19int expresszálnak, ami B-sejt-szerű populációra utal (7A. ábra). . Mivel az NK-sejtek fontos modulátorok a fagociták gombaellenes mechanizmusainak potencírozásában az IFN-szekréció révén Candida-fertőzésekben (Bhatnagar és mtsai, 2010; Costantini és mtsai, 2010; Bar és mtsai, 2014; Voigt és mtsai, 2014), legutóbb arra törekedtünk, hogy megerősítsük-e. Ebben a fertőzésben NK-sejtek szükségesek az IFN-termelés szabályozásához. Ennek érdekében in vivo immundepletáltuk az NK sejteket, és felmértük az IFN expressziós szintjét a fertőzött vesékben a 2. és a 6. napon. Adataink azt mutatták, hogy az NK-sejtek kimerülése nem befolyásolta az IFN termelődését, sem az IFN-termelő sejtek mennyiségét. S4A–C. ábra).
Vita
A TRM-ek fontos veleszületett válaszokat közvetítenek különféle fertőző betegségekben, és általában F4/80hi és CD11b plusz populációként ismerik fel. A szialoadhesint, más néven CD169-et, kiemelték, hogy csak a TRM egy részhalmaza fejezi ki a vesében (Karasawa és mtsai, 2015); azonban ezt követően nem érkezett jelentés a renális CD169 plusz TRM-ről. Adataink alátámasztják azokat a legújabb megállapításokat, amelyek szerint a vese TRM-ek nem homogének, és nagyjából két alcsoportba sorolhatók, nevezetesen az F4/80 plus plus.
CD11b plus (CD169 plus plus) TRM-ek és F4/80 plus plus plus CD11b plus plus (CD169 plus ) TRM-ek. CX3CR1gfp/gfp és CD169-DTR egerek felhasználásával arra a következtetésre jutottunk, hogy a CD169 plusz plusz TRM és a CD169 plusz TRM egyaránt nélkülözhetetlen a szisztémás Candida immunitáshoz, ahol mindegyik alcsoport eltérő funkciókat mutat a Candida veseimmunitásban. Pontosabban, úgy tűnik, hogy a CD169 plusz plusz TRM létfontosságú a vese C. albicans kinövésének szabályozásában a fertőzés későbbi szakaszában, míg a CD169 plusz TRM kulcsfontosságú a vese első vonalbeli védekezésében azáltal, hogy korlátozza a gomba növekedését a fertőzés kezdeti szakaszában. Ennek megfelelően a CD169 plusz plusz TRM hiánya a neutrofilek és a vese IFN ROS-termelésének határozott csökkenését eredményezte. További vizsgálatokra van szükség a renális CD169 plusz plusz TRM funkciójában a gombák növekedésének és az IFN-termelés szabályozásában.
Adataink azt mutatták, hogy a vese az elsődleges célszerv, ahol a C. albicans fennmarad, és ez összhangban van azokkal a korábbi jelentésekkel, amelyek a vese immunitásának fontosságát jelzik a kísérleti disszeminált candidiasis és az azt követő egérmortalitás esetén (Spellberg).
et al, 2003; MacCallum & Odds, 2005; Lionakis et al, 2011; Navarathna et al, 2012, 2019; Hebecker és mtsai, 2016). A CD169-DTR egerek minden perifériás szervében a TRM-ek ablációja ellenére a vesék maradtak az egyetlen olyan szerv, amelyben fennmaradt a C. Albicans, így kiemelve a vese TRM-ek megkülönböztető szerepét a szisztémás Candida immunitásban. Bár a vese a fő célszerv, nem feltétlenül tükröződik következetesen az emberi társaikban, a veseimmunitás továbbra is a gazdaszervezet e fertőzéssel szembeni rezisztenciájának szerves részét képezi, mivel immunhiányos betegeknél súlyos vese Candida fertőzést figyeltek meg (Lionakis, 2014; Xu és Shinohara, 2017). A C. albicans kontrollálatlan növekedése a vesékben korábban a veleszületett mieloid sejtek lassú vagy késleltetett felszaporodásának tulajdonítható (Lionakis és mtsai, 2011). Fertőzési modellünkben azonban megfigyeltük az immunsejtek funkcionális beszűrődését WT egerek veséjében. Ezenkívül a fertőzött WT vesékben a CXCL1 és CCL2 már 12 órával a fertőzés után kimutatható volt, ami támogatja a veleszületett mieloid sejtek gyors toborzását (MacCallum et al, 2009). Beszámoltak arról is, hogy az immunsejtek toborzását makrofágok, DC-k, hám- és endoteliális sejtek szabályozzák (Netea és mtsai, 2002; Tuite és mtsai, 2004; Tran és mtsai, 2015). Pontosabban, a makrofágokról kimutatták, hogy neutrofileket toboroznak a fertőzés korai szakaszában a CXCL2 expresszió révén (Kanayama és mtsai, 2015; Xu és Shinohara, 2017). Mindazonáltal a CD169-DTR egerek a vesékhez hasonló sejtrekrutációt mutattak, mint a WT egerek, ami arra utal, hogy a sejtbeszűrődést nem a CD169 plusz plusz TRM-ek kezdeményezik vagy segítik.
A közelmúltban Karasawa és munkatársai (2015) a vese Ly6Clo monociták egy kis részhalmazáról számoltak be, amelyek az érrendszerben találhatók, és amelyek CD169-et expresszálnak (Karasawa és mtsai, 2015), és a CD169 plusz makrofágokkal együtt kritikus szerepet játszanak a túlzott gyulladás megelőzésében vese ischaemia esetén. reperfúziós sérülés. A vaszkuláris eredetű TRM-eket más szervekben is leírták, például a bélben (Honda és mtsai, 2020) és a zsírszövetben (Silva és mtsai, 2019), ahol támogatják az érrendszer tónusát és integritását (nem publikált adatok); ezért a vaszkuláris eredetű monociták/TRM-ek potenciálisan hasonló szerepet játszhatnak a vesében, és hozzájárulhatnak a szisztémás candidiasis progressziójához. A vese-makrofágok megértése korlátozott, mivel nem állnak rendelkezésre eszközök és fenotípusos markerek ezeknek a mononukleáris fagocitáknak a körülhatárolására (Gottschalk és Kurts, 2015; Kurts és mtsai, 2020). Annak ellenére, hogy megpróbálták megérteni a vese makrofágjait származási és transzkripciós vizsgálatokon keresztül (Hochheiser és mtsai, 2013; Cao és mtsai, 2015; Munoz és mtsai, 2019; Liu és mtsai, 2020; Salei és mtsai, 2020), sokkal kevésbé sikerült. ismert a vese TRM alcsoportjainak fertőző betegségekben betöltött funkcióiról. Bár a vese makrofágokról korábban kimutatták, hogy képesek közvetlenül korlátozni a C. albicans növekedését és a vesetubulusokba való behatolását, adataink arra utalnak, hogy a CD169 plusz plusz TRM alcsoport nem vesz részt ezekben a korai védőmechanizmusokban (Marcil et al, 2002; Lionakis). et al, 2013; Munoz et al, 2019). Ehelyett a CX3CR1gfp/gfp egerekből származó adatok azt sugallják, hogy a CD169 plusz TRM részhalmaz a fő effektor populáció a C. Albicans támadással szembeni kezdeti vesevédelmet biztosító populációban.
A neutrofilek a Candida immunitás szerves részét képezik veleszületett effektorsejtek (Fulurija és mtsai, 1996; Aratani és mtsai, 1999; Netea és mtsai, 2015), és a neutropeniában és neutrofil defektusban szenvedő betegek nagyobb kockázatot jelentenek az invazív candidiasis kialakulására (Lionakis és Netea). 2013). Az oxidatív ölő effektor útvonal jelentőségét alátámasztják azok az eredmények, amelyek szerint a krónikus granulomatosus betegség és a mieloperoxidáz hiány, ahol a ROS termelés hiányos a neutrofilekben, károsítja a C. albicans pusztulást mind a betegekben, mind az egerekben (Aratani et al, 1999, 2002, Lehrer & Cline, 1969). Ennek megfelelően a CD169 plusz plusz TRM-ek hiánya, amely a ROS plusz neutrofilek számának jelentős csökkenéséhez vezetett, és meglepő módon nem a monociták, arra utal, hogy a vese C. Albicans kontrollálatlan növekedése valószínűleg a neutrofilek csökkent gombaölő képességének volt köszönhető.
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEFÁJDALÁST
Az IFN jelentőségét a szisztémás candidiasisban jól bemutatták egy kísérleti egérmodellben, ahol a knockout egerek IFN-hiánya növeli a fertőzésre való fogékonyságukat (Balish és mtsai, 1998; Cenci és mtsai, 1998; Kaposzta és mtsai, 1998). Továbbá kimutatták, hogy az IFN beadása növeli a neutrofilek és makrofágok fagocita- és gombaölő képességét, ami viszont javítja a betegek invazív candidiasissal szembeni rezisztenciáját (Djeu és mtsai, 1986; Malmvall és Follin, 1993; Marodi és mtsai, 1993). ). A TRM-et kimerítő egérmodellünkben következetesen a vese IFN csökkenését figyeltük meg CD169 plusz plusz TRM hiányában, ami arra utal, hogy a CD169 plusz plusz TRM részt vesz az IFN expresszió beindításában vagy fenntartásában. Míg az IFN protektív szerepe a disszeminált candidiasisban nyilvánvaló, az IL17-közvetített protektív válasz ebben a modellben többnyire ellentmondásos volt (Balish és mtsai, 1998; Lavigne és mtsai, 1998; MacCallum, 2009; Kashem és mtsai, 2015). Mengesha és Conti, 2017). Mindazonáltal az IL17-közvetített immunitásról ismeretes, hogy elengedhetetlen a szájüregi és dermális candidiasishoz (Conti és Gaffen, 2010; Netea és mtsai, 2015; Mengesha és Conti, 2017). Modellünkben a CD169 plusz plusz TRM ablációja nem befolyásolta az IL17 expressziós szintjét. Valójában nem sok IL17 expressziót figyeltünk meg a fertőzött WT vesékben (az adatokat nem mutatjuk be). Megfigyeléseinkhez hasonlóan LeibundGut-Landmann és munkatársai (2007) szignifikánsan nagyobb mennyiségű IFN-ről számoltak be, mint az IL17 fertőzött WT egerekben (LeibundGut-Landmann és mtsai, 2007), ami azt jelzi, hogy az IFN által közvetített immunitás kifejezettebb szisztémás candidiasisban. Egy másik tanulmány, amely megerősítette az IFN jótékony szerepét a Candida immunitásban, az IFN-termelő Th1-sejtek, de nem az IL{29}}termelő Th17-sejtek adoptív átvitele által kiváltott védelem volt a szisztémás candidiasis ellen (Kashem et al, 2015).
A CD169 plusz plusz TRM, IFN és neutrofilek közötti érdekes korreláció feltárása felé tett első lépésként kísérleti kísérletünk az IFN sejtforrását kívánta feltárni modellünkben. Az NK-sejtek, mint korai IFN-termelők, kimutatták, hogy képesek felismerni a C. Albicans-t, és potencírozni a neutrofilek gombaölését az IFN és a GM-CSF szekréciója révén (Bhatnagar et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al. al, 2014; Whitney et al, 2014; Dom´ınguez-Andres et al, 2017 ´). Ezenkívül kimutatták, hogy az NK-sejtek 5–10 százaléka termel IFN-t a Candida-fertőzött vesékben (Whitney és mtsai, 2014). Meglepetésünkre nem figyeltünk meg IFN plusz NK sejteket, és nem figyeltük meg az IFN leszabályozását NK sejtek hiányában a modellünkben. Ez a megfigyelt eltérés annak tudható be, hogy az IFN-termelő sejteket különböző időpontokban értékelték. Pontosabban, az IFN-termelést a 6. pi napon értékeltük, amely időpont sokkal későbbi volt, mint Whitney-csoporté, azaz 16 óra pi. Ezért az NK-sejtek nem feltétlenül vesznek részt az IFN-termelés fenntartásában ennél a fertőzésnél. Érdekes módon Murciano és munkatársai arról számoltak be, hogy az elölt C. Albicans élesztők gátolják az NK-sejtek IFN-felszabadulását (Murciano és mtsai, 2006). Az eltérés másik valószínű oka az IFN szekréció vizsgálatára alkalmazott kísérleti módszer lehet. Ebben a cikkben a monesint, egy fehérjeszekréció-gátlót közvetlenül adtunk be az egereknek, és ezt követően ex vivo sejtinkubálás nélkül értékeltük a celluláris IFN-termelést. Másrészt Whitney és munkatársai (2014) tanulmányában az IFN előtt
Az elemzések során először a vesesejteket készítették elő, és 7 órán keresztül inkubáltuk tenyészetben egy fehérjeszekréció-gátlóval (Whitney és mtsai, 2014). Meglepő módon a vizsgálatunkban vizsgált egyéb limfoid és mieloid alcsoportok, különösen a CD169 plusz plusz TRM, szintén nem expresszálnak IFN-t, annak ellenére, hogy a tanulmányok a makrofágok közvetlen IFN-szekréciójáról számoltak be (Bogdan és Schleicher, 2006). Ehelyett adataink arra utalnak, hogy a fő IFN-termelők egy B-szerű sejtpopulációra korlátozódnak. Érdekes módon az IFN-t termelő veleszületett B-sejtek hasonló szubpopulációjáról számoltak be, amely létfontosságú az intracelluláris bakteriális fertőzések korai veleszületett immunválaszának szabályozásában és beindításában (Bao és mtsai, 2014; Krocova és mtsai, 2020). Ezenkívül más korábbi munkák feltárták, hogy az érett B-sejtek T-sejtekkel beindítva és kórokozókkal vagy TLR-ligandumokkal stimulálva IFN-t szekretálhatnak (Gray és mtsai, 2007; Lund és Randall, 2010). Bár nem ritka a B-sejt-IFN tengely a mikrobiális fertőzésekben, sürgősen szükség van jövőbeli vizsgálatokra ennek a vese-IFN plusz B-sejt-szerű populációnak az átfogó profilálásához és a CD169 plusz plusz TRM-mel való kapcsolatának azonosításához a vesében. Összefoglalva, arra a következtetésre jutottunk, hogy a vese TRM-ek két fő populációba sorolhatók a CD169 expressziója alapján. Ennél is fontosabb, hogy ez a két alcsoport nem redundáns védelmi funkciókat rejt magában a disszeminált candidiasisban, ami betekintést nyújt a gazdaszervezet C. Albicans elleni veleszületett védő immunitásának celluláris alapjába. Ezek a feltárások hasznosak lehetnek a terápiás beavatkozások jövőbeni tervezésében.
Anyagok és metódusok
EgerekA CD169-DTR transzgenikus egereket laboratóriumunkban állítottuk elő BALB/c genetikai háttérben a korábban leírtak szerint (Purnama és mtsai, 2014), majd 10 generáción keresztül kereszteztük őket C57BL/6-tal. A CX3CR1gfp/gfp egereket a The Jackson Laboratory-tól vásároltuk. A CD169-DTR C57BL/6 transzgenikus egereket a WT C57BL/6-tal együtt tenyésztették és tartották specifikus kórokozómentes körülmények között a Nanyang Technological University (NTU) állattelepén. A Candida fertőzésre hím egereket (7-10 hetes) használtunk. Minden kísérletet jóváhagyott az Institutional Animal Care and Use Commission ARF-SBS/NIE A-0380AZ szám alatt.
C. albicans fertőzésA C. Albicans SC5314 törzs klinikai izolátumát élesztőkivonat-pepton-dextróz (YPD) lemezen tenyésztettük 24 órán át 30 °C-on, majd 16-18 órán át YPD tápközegben. A C. albicans szuszpenziót centrifugáltuk, mostuk és megszámoltuk. Fertőzés céljából 5 × 104 cfu C. albicanst ivottunk be minden egérbe. Az rIFN-kezeléshez a fertőzött egereket naponta 10,000 U rekombináns IFN-nel (R&D Systems) kezeltük. Az egereket a fertőzés ideje alatt naponta ellenőriztük és mértük. Diftériatoxin által közvetített és antitest által közvetített ablációs DT-t (10 ng/g testtömeg) állítottunk elő 1% egérszérummal kiegészített PBS-ben. A CD169-DTR és WT egereket intravénásán DT-vel adtuk be a fertőzési séma szerint (S1. ábra)
Az NK-sejtek kimerítésére az egereknek ip. 100 ug antiegér NK1.1 (PK136; Invivomab) antitestet adtunk naponta.
Gombaterhelés elemzésekAz agyat, a szívet, a tüdőt, a májat, a veséket és a lépet a fertőzés jelzett időpontjaiban gyűjtöttük be, lemértük és felaprítottuk, mielőtt 1 mg/ml kollagenáz D-vel emésztőközegben 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A mintákat ismételten felszuszpendáltuk, amíg nem látható aggregátum. Sorozathígítást végeztünk, és YPD lemezekre szélesztettük. A lemezeket 48 órán át 30 °C-on inkubáltuk. A CFU-t a telepek kézi számlálásával határoztuk meg. A gombaterhelést CFU-ban fejeztük ki a szerv grammjára vonatkoztatva.
Az egysejtű szuszpenzió szövetgyűjtése, feldolgozása és izolálásaA veséket összegyűjtöttük, feldaraboltuk és 1 mg/ml kollagenáz D-vel inkubáltuk emésztőközegben 1 órán át 37 °C-on. A darált veséket ismételten fel-le pipettáztuk, amíg nem volt látható aggregátum. 330 g-vel 5 percig végzett centrifugálás után a sejtpelleteket 5 ml 35%-os Percoll-ban (GE Healthcare Life Science) újraszuszpendáltuk, és 600 g-vel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszókat eldobtuk, és a sejtpelleteket újraszuszpendáltuk 5- ml vörösvértest-lízis pufferrel. A lízis után a sejtszuszpenziókat centrifugáltuk, és 2%-os IMDM-mel reszuszpendáltuk. Az egysejtű szuszpenziókat további felhasználásig 4 fokon tároltuk. A sejtszámláláshoz a sejtszuszpenziók kis alikvotjait, amelyeket tripánkékkel előkeverve, hemocitométerrel megszámoltuk. A sejtválogatáshoz a vese egysejt-szuszpenzióit patkány anti-egér CD16/32-vel (2,4G2, 1 mg/ml), majd egér CD45 (30F11), F4/80 (BM8) felszíni antigének elleni FL fluoreszcens antitestekkel inkubáltuk. és CD11b (M1/70). A megfestett sejteket egyszer mostuk, és egy 40-μm-es szűrőn engedtük át, majd egy 4-lézeres BD FACSAria II sejtválogatón (BD Bioscience) szétválogattuk őket.
Áramlási citometriás elemzések Az egysejtű szuszpenziókat patkány anti-egér CD16/32-vel (2,4G2, 1 mg/ml) inkubáltuk 4 fokon 15 percig (1:100) FACS pufferben. (2 százalék FCS-sel kiegészített PBS) az Fc receptorok blokkolására. A felületi antigének festéséhez a sejteket egér CD45 (30F11), F4/80 (BM8), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) és Ly6C (HK1.4) elleni fluorokrómmal konjugált antitestekkel inkubáltuk 4 °C-on. fokon 20 percig. A megfestett sejteket egyszer mostuk, és FACS pufferben újraszuszpendáltuk, hogy egy ötlézeres BD LSRFortesssa X-20 (BD Biosciences) készüléken nyerjük el. Az intracelluláris citokin IFN kimutatására vese egysejt-szuszpenziókat készítettünk monenzin proteinszekréció-blokkolóval kezelt egerekből a protokoll szerint (Sun és mtsai, 2009). Röviden, minden egeret intravénásán injektáltunk 250 ul PBS-sel, amely 100 ug monenzint (M5273; Sigma-Aldrich) tartalmazott, 5 órával a szerv izolálása és az ezt követő vese egysejt-szuszpenziók elkészítése előtt. A sejteket patkány anti-egér CD16/32 antitesttel inkubáltuk, majd fluoreszcens antitestekkel festettük egér felületi antigén CD45 (30F11), CD11b (M1/70), F4/80 (BM8), Ly6G (1A8), Ly6C (HK1) ellen. .4), CD3ε (145-2C11), CD49b (HMa2), CD19 (1D3), CD4 (GK1.5), CD8 (53.6–7), CD11c (N418), MHCII (M5/114.15.2) ), és lg κ könnyűlánc (RMK-45). A megfestett sejteket egyszer mostuk FACS pufferrel, majd fixálást (2% PFA) és permeabilizálást (0,05% szaponin) végeztünk, majd anti-IFN antitesttel (1:500; BioLegend) 0,05% szaponinoldatban inkubáltuk. A megfestett sejteket egyszer mostuk, és FACS pufferben újraszuszpendáltuk, hogy egy ötlézeres BD LSRFortesssa X{90}} (BD Bioscience) készüléken nyerjük el. A sejthalál és az apoptózis kimutatására a vese egysejt-szuszpenzióit kezdetben patkány anti-egér CD16/32 antitesttel inkubáltuk, majd fluoreszcens antitestekkel festettük egér felületi antigén CD45 (30F11), CD49b (HMa2), CD3ε ({{101) }}C11), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) és Ly6C (HK1.4). A megfestett sejteket egyszer mostuk FACS pufferrel és 1x annexin V kötőpufferrel (BioLegend), mielőtt FITC konjugált annexin V-vel inkubáltuk a gyártó utasításai szerint (BioLegend). A megfestett sejteket egyszer mostuk, és propidium-jodidot (PI, 1 ug/ml) tartalmazó 1× annexin V pufferben újraszuszpendáltuk, mielőtt egy ötlézeres BD LSRFortessa X{116}} (BD Bioscience) készüléken felvettük volna.
ROS kimutatási vizsgálatAz egysejtű szuszpenziókat mostuk, és 2,5 ug/ml H2DFFDA-val inkubáltuk, 100 ug/ml zimozánnal vagy anélkül, 60 percig 4 vagy 37 °C hőmérsékleten. A sejteket ezután kétszer mostuk 2%-os IMDM-mel, és fluorokrómmal jelölt antitestekkel festettük 4 fokon 20 percig. A megfestett sejteket mostuk, és újraszuszpendáltuk PI-t tartalmazó FACS pufferben, hogy egy ötlézeres BD LSRFortessa X-20 (BD Bioscience) készüléken nyerjük el. Az adatokat normalizáltuk a 4 fokban inkubált megfelelő sejtek alapján.
Szérum kreatininVérszérumot gyűjtöttünk egerekből a 10. napon pi. A szérum kreatininszintjét az egér Cr (Creatinine) ELISA Kit (Elabscience) segítségével határoztuk meg a gyártó utasításai szerint.
Evans kék vizsgálatA vérerek permeabilitását Radu és Chernoff szerint értékeltük (2013). Röviden, a nem fertőzött és fertőzött WT és CD{1}}DTR egereket intravénásán 200 ul 0,5 százalékos Evans blue/PBS-sel injekcióztuk. 30 perccel később az egereket elaltattuk, szerveiket összegyűjtöttük, lemértük, és 100%-os formamidban inkubáltuk mikrofuga-csövekben 48 órán át. Evans kékkel infúziós formamidot (0,5 ml) eldobható polisztirol küvettákba vittünk át anélkül, hogy szövetdarabokat vittünk volna át. A 610 nm-en mért abszorbanciákat rögzítettük, és ezeket az értékeket a szervek tömegével normalizáltuk.
Szövettani elemzésekAz immunfluoreszcens festéshez a begyűjtött veséket Optimal Cutting Temperature vegyületbe (OCT Tissue Tek) ágyaztuk, és -80 fokon tároltuk. 6-µm-es metszeteket vágtunk és 10-15 percig acetonban rögzítettük. A metszeteket 20 percig Fc blokkal inkubáltuk, mostuk, és FL fluoreszcens antitestekkel inkubáltuk 1 órán át. A mosott metszeteket ezután DAKO FL fluoreszcens rögzítőközeggel szereltük fel. A képeket Nikon Eclipse 80i mikroszkóppal készítettük 20-szoros objektív nagyítással. A H&E és PAS festéshez a selejt egereket 4 százalékos PFA-val (Sigma-Aldrich) perfundáltuk. A begyűjtött veséket 4 százalékos PFA-ban inkubáltuk 24 órán át szobahőmérsékleten, dehidratáltuk, és paraffinba ágyaztuk (Paraplast Plus; Leica). A paraffinba ágyazott blokkokat ezután 6-μm-es metszetekre vágtuk. A metszeteket xilolban paraffinmentesítettük 20 percig, majd rehidratáltuk. A hematoxilin és eozin (H&E) festéshez a metszeteket módosított Mayer-oldatú hematoxilinnal (Abcam), majd eozinnal (Sigma-Aldrich) festettük. A xilollal történő tisztítás után a metszeteket DPX Mountant-tel (SigmaAldrich) szereltük fel. A PAS festéshez a metszeteket perjodsav oldattal (Abcam) inkubáltuk, mostuk és Schiff-oldattal (Abcam) festettük. Ezt követően a metszeteket módosított Mayer-féle hematoxilin oldattal (Abcam) ellenfestettük. A xilollal történő tisztítás után a metszeteket DPX ragasztóval (Sigma-Aldrich) rögzítettük. A képeket Eclipse 80i mikroszkóp (Nikon) segítségével, a Digital Sight DS-U3 (Nikon) és NIS-Elements D szoftverrel (Nikon) készítettük 4×10×-es, 20×-os és 100×-os nagyítással.
Kvantitatív valós idejű PCRA begyűjtött veséket azonnal homogenizáltuk TRIzolban (Thermo Fisher Scientific) homogenizátor (CAT X360) segítségével. Az RNS-eket a gyártó utasításai szerint extraháltuk (RNAsimple Total RNA kit; Tiangen Biotech Ltd.). A tisztított RNS-ből egyszálú cDNS szintézist a gyártó utasításai szerint végeztünk (Promega M-MLV reverz transzkriptáz). A valós idejű PCR-t a gyártó utasításai szerint hajtottuk végre a Primerdesign Precision FAST protokoll (Primerdesign Ltd.) használatával. A primer szekvenciák a következők voltak: CXCL1; Fwd: ACTGCACCCAAACCGAAGTC, Rev: TGGGGACACCTTTTAGCATCTT. CXCL2; Fwd: ACAGAAGTCATAGCCACTCTC, Rev: CCTTGCCTTTGTTCAGTATC. CCL2; Fwd: CATCCACGTGTTGGCTCA, Rev: GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT. TNF-; Fwd: TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG, Rev: GGTCTGGGCCATA GAACTGA. G-CSF; Fwd: GTGCTGCTGGAGCAGTTGT, Rev: TCGGGATCCCCAGAGAGT. GM-CSF; Fwd: GCATGTAGAGGCCATCAAAGA, Rev: CGGGTCTGCACACATGTTA. M-CSF; Fwd: GGTGGAACTGCCAGTA TAGAAAG, Rev: TCCCATATGTCTCCTTCCATAAA. IL10; Fwd: CAGAGCCACATGCTCCTAGA, Rev: TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT. ICAM-1; Fwd: AGTCCGCTGTGCTTTGAG, Rev: AGGTCTCAGCTCCACACT. VCAM-1; Fwd: TCTTACCTGTGCGCTGTGAC, Rev: ACTGGATCTTCAGGGAAT GAGT. KIM-1; Fwd: AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAG, Rev: TGA TAGCCACGGTGCTCA. CD169; Fwd: GCTGATACTGGCTTCTACTTCT, Rev: AGGTGGTCAGGTCTGGAGTAA. IFN-; Fwd: CACGGCACAGTCATTGAAAG, Rev: CCAGTTCCTCCAGATATCCAAG. -aktin; Fwd: AAGGCCAACCGTGAAAAGAT, Rev: CTGTGGTACGACCAGAGGCATACA. hHB-EGF; Fwd: ATGACCACACACAACCATCCTG, Rev: CCAGCAGACAGACAG ATGACA