[18F]-nátrium-fluorid autoradiográfiás képalkotás nephrocalcinosisról a donor veséjében és az explantált vese allograftokban

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 és RobertA. Pol1

Nephrocalcinosislegfeljebb 43 százalékában van jelenveseallograft biopsziát egy évvel a transzplantáció után, és ez a graft gyengébb funkciójával és rossz túlélésével jár. Vizsgáltuk a [18F]-nátrium-fluorid ([18F]-NaF) képalkotást a donor vesék mikromeszesedéseiről (n= 7), és kiültettük.veseallograftok (n= 13). Három µm-es paraffinba ágyazott sorozatmetszetet használtunk a meszesedés szövettani értékelésére (Alizarin Red; Von Kossa festés) és ex-vivo [18F]-NaF autoradiográfiára. A képeket egyesítettük annak értékelésére, hogy a mikromeszesedési területek megfelelnek-e a [18F]-NaF felvételi területeknek. A szövettani analízis alapján tubulointerstitialis és glomeruláris mikrokalcifikáció 19/20, illetve 7/20 mintában volt jelen. Autoradiográfiával 19/20 mintában találtak [18F]-NaF felvételt, szignifikánsan nagyobb nyomjelző aktivitássalveseallograft az elhunyt donor vesemintáihoz képest (p {0}}.019). Az aktív mikromeszesedések alizarinvörös festése jó korrelációt mutatott (Spearman-rho: 0,81, p < 0,001),="" a="" von="" kossa-festés="" pedig="" a="" konszolidált="" meszesedéseknél="" szignifikáns,="" de="" gyenge="" korrelációt="" mutatott="" (0,62,="" p="0,003)." [18f]-naf="" aktivitással.="" ez="" a="" korreláció="" az="" ex="" vivo="" [18f]-naf="" felvétel="" és="" a="" szövettanilag="" igazolt="" mikromeszesedések="" között="" az="" első="" lépés="" egy="" olyan="" képalkotó="" módszer="" felé,="" amely="" az="" aktív="" mikromeszesedéseket="">nephrocalcinosis. Ez a mikrokalcifikáció etiológiájának és a vesetranszplantációs funkcióra gyakorolt ​​hatásának jobb megértéséhez vezethet.

Kattintson ide, hogy megtekinthesse a kivonat előnyeit a vesebetegségben

Nephrocalcinosiskalcium-oxalát (CaOx) vagy kalcium-foszfát (CaPhos) parenchymális és tubuláris lerakódásaként definiálva fontos tényező a graft funkcióinak csökkenésébenvesetranszplantáció 1–3. A CaOx és a CaPhos lerakódását a szérum oxalát, szérum kalcium és szérum foszfát magas szintjének tulajdonítják krónikus betegeknélvesebetegség és/vagy hyperparathyreosis4,5. Az előfordulásanephrocalcinosisvese allograft biopsziák alapján 6 százalék 6 hónapos korban, 25-43 százalék egy év múlva, és akár 79 százalék 10-év múlvavesetranszplantáció 5–7. A transzplantációt követő egy éven belüli vese allograft biopsziákra összpontosító vizsgálatok összefüggést mutattak ki a kalciumlerakódások korai jelenléte és mind a graf-funkció, mind a rossz graft túlélés között4,8,9. Továbbra sem világos azonban, hogy ezek a mikromeszesedések aktív szerepet játszanak-e az allograft diszfunkciójában, vagy pusztán a deregulált ásványi anyagcsere jelei.

Randizni,veseAz allograft biopszia az egyetlen diagnosztikai módszer a transzplantáció utáni mikromeszesedések értékelésére. A nem invazív és megbízható diagnosztikai megközelítés lehetővé tenné az ismételt méréseket, megkönnyítve a meszesedések nyomon követését az idő múlásával, és beavatkozási vizsgálatokat, amelyek potenciálisan javítják a graft funkcióját és a veseátültetés utáni túlélést10.

A [18F]-nátrium-fluoriddal ([18F]-NaF) végzett pozitronemissziós tomográfia/számítógépes tomográfia (PET/CT) képalkotást a klinikai gyakorlatban és a kísérleti vizsgálatokban csont- és érrendszeri képalkotási módként használják11–15. Míg a vaszkuláris mikromeszesedések megbízható megjelenítését a CT-képalkotás nehezíti, az ex vivo [18F]-NaF microPET képalkotás eredményei jól korreláltak a szövettanilag bizonyított mikromeszesedésekkel humán és állati érmintákban16,17. Ezenkívül számos prospektív klinikai vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a korai vaszkuláris [18F]-NaF aktivitás jól kapcsolódik mind a CT-képalkotással kimutatott mikromeszesedésekhez, mind pedig, ami még érdekesebb, ezen meszesedések méretének növekedéséhez18–20.

Az alábbiakban bemutatjuk a koncepciót igazoló autoradiográfiás vizsgálat eredményeit a [18F]-NaF képalkotás ex vivo felhasználására.nephrocalcinosisdonoroknálveseés transzplantált vese allograftok, mint diagnosztikai megközelítés a mikromeszesedések megjelenítésére.

Asztal 1.Vesetranszplantációs recipiens jellemzői. Ebben a kohorszban nem fordult elő hiperkalcémia; *A Banf Allograft Patológia Osztályozásának osztályozása – 201828; FSGS=Fokális szegmentális glomerulosclerosis; IFTA=Intersticiális fbrosis és tubuláris atrófia; A megfelelő autoradiográfiás és szövettani eredményeket az S1 kiegészítő tartalmazza.

2. táblázat Elhunytvesedonor jellemzői. *Agyi érrendszeri eseményként meghatározott szív- és érrendszeri betegség, szívinfarktus, invazív beavatkozást igénylő érbetegség; **amint azt a beszerzési csoport megjegyezte; A megfelelő autoradiográfiás és szövettani eredményeket az S2 kiegészítő tartalmazza; nincs diabetes mellitusban szenvedő donor.

Eredmények

Minta kohorsz.

Tizenháromvesemintákat vettek transzplantáció után, átlagosan 33 [IQR 9–66] hónappal a transzplantáció után, 51 [IQR 30–64] éves medián életkorú transzplantált recipiensektől. Transplantectomiát végeztek allograft kilökődés (Banf IIA és IIB) miatt hét betegnél, krónikus allograft arteriopathiát két betegnél, allograft fertőzést két betegnél, elsődleges nem funkciót egy betegnél, valamint intersticiális fbrosis és tubularis atrófia III. 13 betegből nyolc (61,5 százalék) hyperparathyreosisban, hétnél (53,8 százalék) hyperphosphataemiás, ötnél (38,5 százalék) diabetes mellitusban szenvedett, és egyik betegnél sem voltaknephrocalcinosisklinikai ultrahangvizsgálaton vagy a kórelőzményében vesekő szerepel (1. táblázat). Hét elhunyt donor vesemintáját vettük, olyan donoroktól, akiknek medián életkora 65 [IQR 64–71] év. Hét donor közül négynek (57,1 százalék) volt szív- és érrendszeri betegsége, egyiknél sem volt diabetes mellitus, hétből hatból (85,7 százalék) pedig szemrevételezéssel atherosclerosisban szenvedett a vese érrendszerében, amelyek potenciális tényezők a donorok számának csökkenésében.vese(2. táblázat).

1. ábra: A [18F]-nátrium-fluorid ([18F]-NaF) felvételének autoradiográfiás képe (A), a [18F]-NaF felvétel átfedő képével a mikromeszesedések Alizarin-vörös festésével (B) és a meszesedések von Kossa-festésével (C).

Autoradiográfia és szövettan.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 százalék 5 (25 százalék) 20 mintából (1. ábra és 2A. ábra) (kiegészítő S1 és kiegészítő S2, amely az összes minta autoradiográfiáját és átfedő képeit mutatja). A [18F]-NaF területek száma szignifikánsan magasabb voltveseallograft minták az elhunyt donorokhoz képestveseminták, mediánnal 7.0 [IQR 4.0–15,5] és 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], illetve (p=0.019) (Kiegészítő S3).

Alizarin vörös festéssel látható tubulointersticiális mikromeszesedés 20 mintából 19-ben volt jelen, mintánkénti medián 5,5 [IQR 2–10.3], glomeruláris mikromeszesedés pedig hétben volt látható 20 mintából, 1 [IQR 1–3] mediánnal mintánként (2B. ábra). A vese allograft mintákban szignifikánsan több mikromeszesedést figyeltek meg, mint az elhunyt donor vesemintáiban, medián 9.0 [IQR 5.0–20.5] ill. 4,0 [IQR 1,0–4,0], illetve (p=0,046) (Kiegészítő S3). Von Kossa festéssel 20 mintából 18 mintában volt látható tubulointerstitialis meszesedés, medián 2,5 [IQR 1–5] mintánként, és glomeruláris meszesedés 20 mintából hétben, medián 1 [IQR 0–3] ] mintánként (2C. ábra). A meszesedések száma nem különbözött szignifikánsan közöttveseallograft minták és elhalt donor vesemintái, mediánnal 4.0 [IQR 2.0–6.0] és 2.0 [IQR 2.{101} {9}}–7.0], illetve (p=0.311) (Kiegészítő S3). Az interobserver reprodukálhatóságot a meszesedések vizuális és félautomata észlelése között azonosították, az alizarin vörös festődés esetén az ICC 0,94 (95 százalékos CI 0,85–0,98). és 0,77 (95 százalékos CI 0.42–0.91) Von Kossa festéshez.

Az autoradiográfiás és szövettani eredmények fedőképei a [18F]-NaF felvétel és a mikrokalcifikációt szolgáló Alizarin-vörös festés együttes lokalizációját mutatták (1B. ábra). Összehasonlításképpen, a [18F]-NaF felvételről és a meszesedések Von Kossa-festéséről készült fedőképek felvételt mutattak olyan területeken, ahol nem szövettanilag igazolt meszesedés (1C. ábra). Az álnegatív [18F]-NaF felvétel a fedőrétegen kívüli szövettanilag igazolt (mikro)meszesedési területek százalékos arányaként medián 0 százalék [IQR 0–25% ] volt az Alizarin vörös területek és medián 100 százalék [65–100 százalék ] Von Kossa területeken. A mikromeszesedések alizarinvörös festése jó korrelációt mutatott a [18F]-NaF felvétellel (Spearman-rho 0,81 (95 százalékos CI 0,57–0,92), p.< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 százalék [18F]-NaF felvétel (4. ábra).

2. ábra: [18F]-nátrium-fluorid ([18F]-NaF) felvétel és (Alizarin vörös) mikromeszesedés (A), alizarin vörös festéssel a mikromeszesedésekhez (B) és von Kossa festéssel a meszesedéshez (C).

A recipiens jellemzői a transzplantációs műtét idején.

között nem volt különbségveseallografált minták (n{0}}) vagy hiperfoszfatémiás (n=6) betegektől a [18F]-NaF területek számához (medián 5.0 [IQR) 2.0–11,8] versus 7.0 [7.0–23.0], p=0.170) , Alizarin vörös (medián 7,5 [IQR 5.0–14.0] versus 12.0 [3.0–34.0], p{{30}},390), és Von Kossa (medián 5.0 [IQR 3,5–6,3] versus 3.0 [2.{101} {59}}–5.0], p=0.247). Az (n=8) vagy nem (n=5) hyperparathyreosisban szenvedő betegek veseallografált mintáinak összehasonlítása nem mutatott különbséget a [18F]-NaF területek számában (medián 7.0 [IQR 4.0–7,5] versus 7,5 [4.0–23.0], p=0.459), Alizarin vörös (medián 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] versus 1{{103}}.0 [3,5–32,8], p{{76 }},769), és Von Kossa (medián 4.0 [IQR 1,5–5.0] versus 4,5 [2.0–6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). A [18F]-NaF területek számát tekintve (medián 5,5 [IQR 2,5–) nem volt kimutatható szignifikáns különbség a diabetes mellitusban (n=5) vagy anélkül (n{93}}) szenvedő betegek veseallografált mintái között. 19,3] versus 7,0 [6,5–15,5], p=0,524), Alizarin vörös (medián 10,0 [IQR 5,5–24,8] versus 9,0 [4,0–8,5], p=0,833) és Von Kossa (medián 3,0 [IQR 2,0–5,8] versus 4,0 [3,5–8,5], p=0,284). A transzplantáció és a transzplantációs műtét közötti időszakban (hónapok) nem figyeltek meg szignifikáns összefüggést a [18F]-NaF területek számával (p=0,586), az Alizarin vörössel (p=0,667) és a Vonnal. Kossa (p=0.459). A transzplantáció idején fennálló életkorban nem figyeltek meg szignifikáns összefüggést a [18F]-NaF területek (p=0.902), az Alizarin vörös (p=0.798) és a Von Kossa (p) számával. =0.334). Hasonlóképpen, nem figyeltek meg szignifikáns korrelációt a dialízis időtartama (hónapok) közöttveseallograf hiba és a [18F]-NaF területek száma (p=0.481), Alizarin vörös (p=0.565) és Von Kossa (p=0.174).

3. ábra: A [18F]-nátrium-fluorid ([18F]-NaF) területek számának összefüggése az Alizarin-vörösre festett mikromeszesedésekkel (A) és a von Kossa-festett meszesedésekkel (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 százalék [18F]-nátrium-fluorid ([18F]-NaF) nyomjelző felület, az Alizarin vörösre festett mikromeszesedések (A) és von Kossa, festett meszesedések (B) számához (medián, interkvartilis tartomány).

Vita

Ebben az elméleti bizonyítási tanulmányban ex-vivo [18F]-NaF felvételt vizsgáltak emberbenveseparenchyma minták jó korrelációt mutattak a szövettanilag igazolt mikromeszesedésekkel. A [18F]-NaF felvétele erősebb korrelációt mutatott az aktív mikromeszesedéseknél az Alizarin vörös festéssel, mint a konszolidált meszesedéseknél a Von Kossa festéssel, ami arra utal, hogy a [18F]-NaF képalkotás szerepe van a nephrocalcinosis korai stádiumú területeinek azonosításában.

A bemutatott minták donorvese és kiültetett vese allograftok esetkeverékét reprezentálják. Ez a két mintatípus különbözött a nyomjelző kötődés tekintetében, több [18F]-NaF felvételt figyeltek meg az explantált vese allograft mintákban. Ez összhangban van a korábbi publikációkkal, amelyek a vesetranszplantáció utáni mikromeszesedés növekedéséről számolnak be5–7. Az egyesületnephrocalcinosisa biopszia időpontjában és egy évvel a transzplantáció után gyengébb graftfunkcióval számoltak be két vese allograft biopsziás vizsgálatban, 258 és 149vesetranszplantált recipiensek rendre8,9. Ezen túlmenően, egy longitudinális kohorszban 97 vesetranszplantált recipiensből szignifikánsan rosszabb 1-éves és 12-éves graft túlélést mutattak ki a kalcium-oxalát lerakódású betegeknél (azaz a graft túlélése 98,6% versus 72,5% és 79,3 százalék a 49,7 százalékkal szemben). A többváltozós logisztikus regressziós analízisben a kalcium-oxalát lerakódások jelenléte függetlenül összefüggésbe hozható a graft elvesztésével, egy olyan modellben, amely többek között a biopszia idején a kreatinint és a donortípust4. A mikrokalcifikációk sajátos szerepe ebben a kaszkádbanveseAz allograft funkció csökkenése továbbra is tisztázatlan. A transzplantáció előtti klinikai környezetben a CaOx-lerakódások a szérum oxalát magas szintjének tulajdoníthatók, amely molekula nem távolítható el hatékonyan a dialízis során4. Míg a CaPhos lerakódások leggyakrabban hyperparathyreosisban és magas szérum kalciumszintben szenvedő betegeknél figyelhetők meg, a transzplantáció előtti és utáni zavart ásványi anyagcsere miatt5. Nem találtunk különbséget a szövettani és autoradiográfiás eredményekben a hyperphosphataemia, hyperparathyreosis, diabetes mellitus, a transzplantáció és a transzplantátum eltávolítása közötti idő, valamint a vese allograft elégtelensége utáni dialízis időtartama tekintetében.

Aktív mikromeszesedések újszerű kezelési stratégiáinak kidolgozásáhoznephrocalcinosis, klinikai jelentőségét a (krónikus) transzplantációs kudarc tekintetében átfogóbban kell megérteni. A magas kockázatú célpopuláció azonosításávalvesetranszplantált recipiensek esetében klinikai vizsgálatok tervezhetők a kezelési stratégiák feltárására21. Egy lehetséges fókusz az endogén meszesedésgátlók felszabályozásában kereshető, különös tekintettel az osteopontin3-ra.

Tekintettel a magas előfordulásinephrocalcinosisés összefüggése a vese allograft funkciójával, indokolt a mikromeszesedés etiológiájának jobb megértése. Egy nem invazív és megbízható diagnosztikai megközelítés a mikrokalcifikáció azonosítására és számszerűsítésére a korai nephrocalcinosisban lehetővé teheti a nephrocalcinosis vesetranszplantációs funkcióra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatát. A [18F]-NaF képalkotás érdekes, mivel az emberi és állati érminták [18F]-NaF felvétele megnövekszik a biológiailag aktív meszesedési területeken, mielőtt ezeket a területeket mikro-számítógépes tomográfiával láthatóvá lehetne tenni16,17,22. A közelmúltban végzett klinikai PET/CT vizsgálatok kimutatták, hogy a [18F]-NaF felvétel összefüggésben áll az erek meszesedésének progressziójával, ami klinikai bizonyítékot szolgáltat a [18F]-NaF használatára biológiailag aktív meszesedéses területek kimutatására18–20. A tanulmány megfigyelései összhangban vannak ezekkel a korábbi eredményekkel az érrendszeri képalkotás terén. Jó korrelációt mutattunk ki a [18F]-NaF felvétel és a szövettanilag igazolt mikromeszesedések között, míg a konszolidált meszesedésekkel egyértelműen gyengébb volt a korreláció.

Amint már említettük, a [18F]-NaF felvétel és az Alizarin vörös pozitív mikromeszesedések közötti kolokalizációt azonosították, míg a [18F]-NaF felvételi területek nem lokalizálódnak a konszolidált meszesedések Von Kossa festésével. A megszilárdult meszesedésekkel és a megfelelő [18F]-NaF-felvétellel nem rendelkező területek inaktív meszesedésnek tekinthetők, ahol nincs folyamatban lévő mineralizációs folyamat, amint azt Irkle és munkatársai korábban leírták. a carotis meszesedésének ex vivo vizsgálatában16. Bár csak érmeszesedésre validálták és nemveseparenchyma meszesedések esetén, ezt a [18F]-NaF kötődési tulajdonságai a meszesedések külső felületéhez és a szilárd meszesedésekben korlátozott penetrációja támasztja alá. Ezért a [18F]-NaF felvétel nagyobb lesz a mikromeszesedéseknél, nagy felülettel, mint a mikromeszesedéseknél, nagy térfogatú, de viszonylag kis felülettel13,16.

Ennek a fogalombizonyítási tanulmánynak is vannak korlátai. Először is, a vizsgálati terv velejárója, hogy az eredmények egyetlen időpontot képviselnek, és hiányzik a meszesedés progressziójának klinikai nyomon követése. Másodszor, ez a bizonyítási koncepció viszonylag kis számú vesemintából áll, mivel a késői transzplantációs sikertelenség utáni transzplantációs műtétre csak klinikai indikáció esetén és a visszaesett donor elérhetősége esetén kerül sor.vesekutatási felhasználása korlátozott23. Ezért a kalciumlerakódások etiológiájának átfogó elemzését e projekt keretein túlmenően meg kell fontolni. Harmadszor, az eredmények klinikai lefordítását nehezíti az in vivo [18F]-NaF vesékben való eloszlására vonatkozó ismeretek hiánya és a vese tracer clearance hatása, azaz az alacsony cél-háttér aktivitás korlátozhatja a meszesedések megjelenítését. A probléma megoldásához fel kell mérni a [18F]-NaF PET képalkotás optimális pillanatát, vagyis azt, hogy a [18F]-NaF valóban mikor ürül ki, és a fennmaradó aktivitás a meszesedő területekhez való kötődésből származik. Valószínűleg ez három órát meghaladó késleltetett képalkotással érhető el, amint azt a koszorúér-meszesedések felmérése során végezzük24. A transzplantált recipienseknél tapasztalt csökkent glomeruláris filtrációs ráta elhúzódó kiválasztási fázist eredményezhet, ami hosszabb időszakot igényel a nyomjelző injekció és a PET képalkotás között, de a jelenlegi irányelvek nem utalnak a [18F]-NaF nyomjelző potenciális nefrotoxicitására11,25. Potenciális lépés az itt bemutatott koncepcióvizsgálat és az in vivo képalkotás között a normoterm perfundált vesék ex vivo [18F]-NaF PET-felvétele vagy in vivo [18F]-NaF microPET állatkísérletek26,27. Negyedszer, ennek a technikának a klinikai alkalmazását hátráltathatják a [18F]-NaF PET/CT-eljárás elvégzésének költségei és a velejáró sugárterhelés. Az új, nagyobb érzékenységű digitális PET kamerarendszerek azonban mindkettőt csökkenthetik a rövidebb szkennelési idő és az alacsonyabb befecskendezett aktivitási dózis miatt.

Ennek a koncepciót bizonyító tanulmánynak az erőssége a [18F]-NaF autoradiográfiával és szövettannal azonosított mikromeszesedés részletes egy-egy összehasonlításában rejlik. A különböző minták [18F]-NaF-felvétele további módosítások nélkül is összehasonlítható volt, mivel minden mintát ugyanabban a [18F]-NaF-oldatban inkubáltunk. Ezenkívül ez a tanulmány szolgáltatja az első adatokat, amelyek vizuális és statisztikai egyezést mutatnak a [18F]-NaF felvétele és a szövettanilag igazolt mikromeszesedés között a vesemintákban.

Cisztanche-vesefunkció

Végezetül megadjuk az első adatokat a [18F]-NaF használatáról egy autoradiográfiás vizsgálatban az aktív mikromeszesedés azonosítására.nephrocalcinosisutánveseátültetés. Ez az ex-vivo [18F]-NaF proof of concept vizsgálat az első lépés a klinikai [18F]-NaF PET/CT vesetranszplantált betegeknél történő lehetséges alkalmazása felé.

Mód

Emberiveseminták.

A veseszövetet transzplantációs műtét után (n=13) és elhalálozott donorok veséiből (n=7) vették fel, ha a donor veséjét a kapcsolt transzplantációs központok csökkentették. A vesetranszplantált recipiensek és donorok klinikai adatait a betegek orvosi nyilvántartásából nyerték ki, beleértve a hyperparathyreosis, hyperphosphataemia és diabetes mellitus jelenlétét a transzplantációs műtét előtt, valamint a vese allograft minták klinikai patológiai értékelését a vese allograft patológia Banf osztályozása alapján28. A kutatási tevékenységeket a Helsinki Etikai alapelveinek deklarációjával összhangban végezték az emberi alanyok bevonásával végzett orvosi kutatások esetében, és az intézményi felülvizsgálati bizottság jóváhagyta ezt a tanulmányt (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Valamennyi transzplantációs recipienstől tájékozott beleegyezést kaptak, és az elhalálozott donoroktól származó, kidobott vesék kutatási célokra történő felhasználásához az adományozás előtti jóváhagyást adtak. A klinikai és kutatási tevékenységek összhangban voltak az Isztambuli Nyilatkozat alapelveivel, amint azt a „Isztambuli Nyilatkozat a szervkereskedelemről és a transzplantációs turizmusról” vázolja.

A szövetmintavétel szabványos műtéti eljárása (SOP) a következő volt: A mintákat a sebészeti helyiségben vették, közvetlenül a vese kivonása után (transzplantációs műtéthez), vagy az eldobott donor megérkezésekor.vesetranszplantációs központunkban. A kísérlethez használt mintákat a felső pólus keresztirányú síkjában vettük, beleértve a kérgi és velős veseszövetet is, 25 mm × 15 mm és 20 mm × 40 mm közötti méretben. Ezeket a mintákat formalinnal fixáltuk és paraffinba ágyaztuk. Mikrotomos precíziós vágóműszerrel három µm-es paraffinba ágyazott metszet készült. Ezeket a metszeteket adhéziós mikroszkópüvegre (TOMO, Matsunami Glass, USA) szereltük fel. Soros szakaszok, azaz szomszédos szakaszok, amelyek a szekvenciális rétegeket mutatják megveseszövetmintákat használtunk autoradiográfiához és szövettani analízishez. A nyomjelző inkubáció és a szövettani festés előtt a metszeteket parafnmentesítettük, demineralizált vízben rehidratáltuk, és ideiglenesen foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) tároltuk.

[18F]-NaF inkubáció és autoradiográfia.

Az ex vivo kísérlet Hop és munkatársai korábbi tanulmányaiban használt protokollon alapult. és Reijrink et al.22,29. Az első vizsgálat egy autoradiográfiás vizsgálat, amely a [18F]-NaF felvételét vizsgálja műtéten átesett stroke-betegek carotis plakkjaiban, összehasonlításként a meszesedés CT-alapú indikációjával. A második vizsgálat egy autoradiográfiás vizsgálat a zsírszövetminták [18F]-FDG-felvételéről, összehasonlításként a sorozatos metszetek immunhisztokémiájával. Mindhárom sorozat metszet egyikét [18F]-NaF 618 millibecquerel (MBq) koncentrációjú, 300 ml PBS-ben készült oldatában szobahőmérsékleten 30 percig fürdőztük. A mosást háromszor hideg PBS-sel és kétszer hideg vízzel öblítettük. A mintákat szabad levegőn szárítottuk, és a mintákra vakolt foszforszűrőt helyeztünk. Az expozíciót egy éjszakán át végeztük, 24 óra 30 percig. A szöveti aktivitás eloszlásának és intenzitásának meghatározását phosphor screen-en végeztük Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, USA) segítségével.

Alizarin vörös és von Kossa festés.

Alizarin vörös festést végeztünk a kalcium felhalmozódásának vizualizálására a korai stádiumú meszesedésben. A mintákat 2 tömeg/térfogat%-os alizarin vörös (ionmentes vízben oldott) oldatban (pH 4,2) inkubáltuk 5 percig30. A mosást 20-szori 1:1 aceton/xilolban történő öblítéssel és 20-szoros 100%-os xilolban történő öblítéssel végeztük. Von Kossa festést végeztünk, hogy láthatóvá tegyük a szervetlen foszfátmolekulák jelenlétét a konszolidált meszesedésekben. Röviden, a mintákat 1 százalékos ezüst-nitrát (AgNO3) oldatban inkubáltuk 1 órán át, miközben napfénynek tették ki30. Felváltva ioncserélt vízben háromszori öblítéssel, az inkubálást nátrium-tioszulfáttal 5 percig végeztük, majd a sejtmagvörösben 3 percig inkubáltuk.

Képfeldolgozás és -elemzés.

A megfestett szövetmetszeteket Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japán) segítségével digitalizáltuk, és a képeket az Aperio ImageScope 12.1-es verziójával ellenőriztük.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Németország). Az autoradiográfiát és a kvantitatív számítógépes képelemzést az ImageJ szoftver 1.51-es verziójával (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc) végeztük.

Minden szövettani képnél háttérkivonást alkalmaztunk, a szövettani minta határán körvonalat szúrva. A meszesedések félautomata kimutatását az Alizarin red és a Von Kossa festésben az ImageJ—BioVoxxel Toolbox31 segítségével végeztük. Minden mintára küszöbértékeket alkalmaztunk, és a kimutatott meszesedési területeket 6 iterációval tágítottuk a vizualizáció optimalizálása érdekében. Az autoradiográfiás képekhez az eredeti szövettani minták alapján rotációt és átméretezést végeztünk. Minden mintára küszöbértékeket alkalmaztunk, ami nyomjelző felvételi területeket eredményezett, követve Irkle és munkatársai által leírt megközelítést: a képeket Otsu-módszerrel küszöböltük ki, majd Gauss-féle elmosódást és küszöbértéket Li-módszerrel16. A fedőképeket a szomszédos szövettani képek körvonalainak párosításával, majd a szövettani és autoradiográfiás eredmények ezt követő egyeztetésével kaptuk (1. ábra). A meszesedés és a nyomkövető terület (a mintaterület százalékában) pixel alapú mennyiségi meghatározását az ImageJ—Analyze Particles eszközzel végeztük.

Cistanche-vesebetegség tünetei

Statisztikai elemzések.

A statisztikákat a Statistical Package for the Social Sciences 23-as verziójával (IBM Corporation, Armonk NY, USA), a grafikonokat GraphPad Prism 7.02 for Windows programmal (Graph Pad Software, San Diego, USA), az ábrákat pedig az Adobe Illustrator CS6 programmal készítettük. (Adobe Systems, San Jose, USA). Az eredményeket a torzított adatok medián és interkvartilis tartományaként (IQR), kategorikus adatok esetén pedig gyakoriságként és százalékosan mutattuk be. A csoportokat Mann–Whitney U-teszttel hasonlítottuk össze (kétfarkú pérték<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Az adatok elérhetősége

Elhunyt donor vese ésveseKiegészítő információként online elérhetők a [18F]-nátrium-fluorid ([18F]-NaF) felvételéről készült transzplantációs recipiens autoradiográfiás képek, valamint a [18F]-NaF felvétel átfedő képei a mikromeszesedések Alizarin-vörös festésével és a meszesedések Von Kossa-festésével. Minden további adatot kérésre rendelkezésre bocsátunk, összhangban a Groningeni Egyetemi Orvosi Központ IRB előírásaival.

Hivatkozások

1. Gwinner, W. et al. A protokoll biopsziával kimutatott vese allograftok korai meszesedése: okok és klinikai következmények. Am. J. Transzplantáció. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Mi aznephrocalcinosis?. Kidney Int. 88, 35–43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Az Osteopontin véd a magas foszfáttartalommal szembennephrocalcinosisés az erek meszesedése. Kidney Int. 89, 1027–1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. A kalcium-oxalát lerakódás korai jelenléteveseA graft biopsziák rossz hosszú távú graft túléléssel járnak. Am. J. Transzplantáció. 5, 323–329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. A kalcium-foszfát lerakódások lokalizációja, etiológiája és hatása vese allograftokban. Am. J. Transzplantáció. 9, 2470–2478 (2009).

6. Nankivell, BJ et al. A krónikus allograft nephropathia természetes története. N. Engl. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. A krónikus allograft nefropátia kockázati tényezői veseátültetés után: protokoll biopsziás vizsgálat. Kidney Int.67, 341–348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Oxalát lerakódások a natív és átültetett vesék biopsziáiban, és hatás a graft működésére. Nephrol. Tárcsa. Transzplantáció. 24, 1319–1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Az oxalát lerakódás a vese allograft biopsziáiban a transzplantáció után 3 hónapon belül allograft diszfunkcióval jár. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Elfelejtettük a képalkotást a veseátültetés előtt és után? Eur. Radiol. 28, 3263–3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: EANM eljárás irányelvei csontképalkotáshoz. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR és mtsai. A szívkoszorúér 18F-nátrium-fluorid felvétele. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 1539–1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. A 18F-nátrium-fluorid felvétel az aktív meszesedés és a betegség progressziójának markere az aorta szűkületben szenvedő betegeknél. Circ. Cardiovasc. Imaging 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. et al. A 18F-nátrium-fluorid PET/CT alkalmazhatósága atheroscleroticus plakk képalkotására. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Cél azonosítás a 18F-fluorodeoxiglükóz pozitronemissziós tomográfiai képalkotáson túl sérülékeny atheroscleroticus plakkok diagnosztizálására és beavatkozására: ígéretes nyomjelzők a láthatáron. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Az aktív vaszkuláris mikrokalcifikáció azonosítása 18F-nátrium-fluorid pozitronemissziós tomográfiával. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD et al. A 18 F-fluorid jelerősítés azonosítja az ateroszklerotikus plakkok instabilitásával kapcsolatos mikromeszesedéseket a pozitronemissziós tomográfiás/számítógépes tomográfiás képeken. Circ. Cardiovasc. Imaging 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM et al. Vaszkuláris felvétel a 18F-nátrium-fluorid pozitron emissziós tomográfián: a vaszkuláris meszesedés előfutára? J. Nucl. Cardiol. (2020).

19. Derlin, T. et al. A18F-FDG PET-tel mért gyulladás, a18F-fluorid PET-tel értékelt aktív ásványi lerakódás és az atheroscleroticus plakk vaszkuláris meszesedésének korrelációja: kettős nyomkövetős PET/CT vizsgálat. J. Nucl. Med. 52, 1020–1027 (2011).

20. Kitagawa, T. et al. A 18F-nátrium-fluorid pozitronemissziós tomográfia prediktív értéke a nagy kockázatú koszorúér-betegség kimutatásában számítógépes tomográfiával kombinálva. J. Am. Szív Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. et al. Endogén meszesedésgátlók az erek meszesedésének megelőzésében: konszenzusos nyilatkozat a COST EuroSofCalcNet akcióból. Elülső. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. A 18F-nátrium-fluorid pozitron emissziós tomográfia mikromeszesedéseket vizsgált a felelős és nem felelős humán carotis plakkokban. J. Nucl. Cardiol. 26, 1064–1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nephrectomia transzplantációs sikertelenség után: jelenlegi gyakorlat és eredmények. Am. J. Transzplantáció. 7, 1961–1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. A három órás késleltetett képalkotás javítja a koszorúér 18F-nátrium-fluorid PET értékelését. J. Nucl. Med. 60, 530–535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Az Európai Nukleáris Medicina Szövetség (EANM) Kardiovaszkuláris Bizottságának állásfoglalása az érelmeszesedés PET-képalkotásáról. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. A DCD sertések veséjét MRI-vel elemeztük, hogy ex vivo értékeljük életképességüket. Transplantation 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. et al. Mesenchymalis stromasejtek infúziója sertésbevesenormoterm gépi perfúzió során: ép MSC-k Nyomon követhetők és lokalizálhatók glomerulusokra. Int. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. 2018-as referencia-útmutató a vese allograft patológiájának Banf-osztályozásához. Transplantation 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. [18F]A zsírszövetben az FDG-felvétel nincs összefüggésben a 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő gyulladással. Mol. Imaging Biol.23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. et al. A vaszkuláris meszesedés és az aorta fbrosis az osteopontin bifunkcionális szerepe a diabéteszes arterioszklerózisban. Arter. TrombVascBiol 31, 1821–1833 (2011).

31. Brocher, J. Két új hisztogram limitáló binarizációs algoritmus kvalitatív és kvantitatív értékelése. Int. J. Képfeldolgozás. 8, 30–48 (2014).

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatási projektet a De Cock-Hadders Alapítvány (projektkód: 2018-03) támogatása támogatja.

Szerzői hozzájárulások

Az SB közreműködött a tervezésben, a beszerzésben és az elemzésben, valamint elkészítette a kéziratot. Az IFA, az MR és az MLCB hozzájárultak a tervezéshez, a beszerzéshez és az elemzéshez, és érdemben átdolgozták a kéziratot. Az SPB, a CM és az MHdB hozzájárult a koncepcióhoz, és érdemben átdolgozta a kéziratot. A JLH, az RHJAS és a RAP hozzájárultak a koncepcióhoz, a tervezéshez és az elemzéshez, és érdemben átdolgozták a kéziratot.

Versengő érdekek

A szerzők nem nyilatkoznak egymással versengő érdekekről.