A Laminaria Japonica Fucoidan és a Cistanche Tubulosa kivonat szinergikus gyulladáscsökkentő hatásai

Az idegen antigének elleni immunválaszként a makrofágok gyulladást elősegítő citokineket szabadítanak fel, például tumornekrózis faktor- (TNF-), interleukin-1 (IL- 1), IL-6 és mások. Az ilyen citokinek granulociták, monociták, limfociták és hízósejtek kemotaktikus beáramlását indukálják a sérült szövetekbe, ami elősegíti az antigén eltávolítását és a szövetek helyreállítását. A sejtek túlzott infiltrációja és aktivációja azonban súlyosbítja a szöveti sérüléseket, ami ödémához (érrendszeri váladékozáshoz) és fájdalomhoz vezet, amelyek a gyulladás jól ismert jelenségei.

A TNF- számos sejtvonalban fontos tényező a nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS) génexpressziójának indukálásában. Az iNOS aktiválása nitrogén-monoxid (NO) termeléshez vezet, amely nemcsak számos fiziológiai funkciót modulál, mint például a baktericid és értágító, hanem gyulladást is okoz. Szövetkárosodást követően a sejtmembrán-foszfolipidek foszfolipázok általi lebomlása arachidonsavat termel. Az arachidonsavat a ciklooxigenáz (COX) tovább bontja prosztaglandinokra (PG-k). A COX-II által képződött túlzott mennyiségű PGE2 számos citokin gyulladást vált ki. Mivel mind a NO, mind a PGE2 a gyulladás és a fájdalom kiváltásának fő tényezője, a TNF- –NO és a COX-II-PGE2 útvonalak a gyulladásos folyamat fő áramlatai, amelyeket kortikoszteroidok és nem szteroidok gátolnak.gyulladáscsökkentő gyógyszerek(NSAID-ok), ill.

Annak ellenére, hogy számos szteroid és NSAID létezikgyulladásos betegségek terápiája, ezek a gyógyszerek káros hatással lehetnek az immunrendszerre, a gyomor-bélrendszerre, a vesére, a májra, a központi idegrendszerre, a vérnyomásra és a szív- és érrendszerre. Ezért szükséges a kémiai terápiák káros hatásainak minimalizálása azok helyettesítésével vagy természetes termékekkel kombinálva.

A fukoidánt, a tengeri moszatokból, például a Laminaria japonica-ból és a Cladosiphon okamuranusból származó, sok országban elterjedt szulfát-poliszacharid komplexet hosszú ideig terápiás szerként alkalmazzák a keleti gyógyászatban. Korábbi vizsgálatokban kimutatták, hogy a fukoidán antioxidáns, véralvadásgátló, rákellenes ésgyulladáscsökkentő tevékenységek. Ennek megfelelően a fukoidán gyulladásos betegségekre, ischaemiára, immunrendszeri zavarokra és daganatokra gyakorolt ​​jótékony hatásai felkeltik a kutatók figyelmét. Másrészt,Cistanche tubulosaA (CT) hagyományos gyógyszerként is széles körben használatos Kínában. Beszámoltak arról, hogy a CT-kivonatok csökkentik a TNF-a és IL- 4 termelését, amelyek a gyulladásos útvonalakban a NO-termelés fő tényezői [19].

Az ilyen korábbi eredmények arra késztettek bennünket, hogy megvizsgáljuk a fukoidán és a CT-kivonat kombinációs hatékonyságát a gyulladás két fő útvonalán. A hatásmechanizmus tisztázása érdekében elemeztük a NO-t és a PGE2-t a karragenán által kiváltott légzacskó-gyulladásból származó váladékokban.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A MEGELŐZÉSREGYULLADÁSOS TEVÉKENYSÉGEKPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Anyagok és módszerek

Anyagok

A CT félig tisztított fukoidánt és vizes kivonatát a Misuba RTech Co., Ltd.-től (Asan, Korea) szereztük be. A fukoidánt és a CT-kivonatot 4 fokon tartottuk, használat előtt összekevertük (1:3) tisztított vízben, majd 5 ml/kg mennyiségben orálisan adtuk be.

Sejttenyésztés és NO mennyiségi meghatározása

A RAW 264.7 egér makrofág sejtvonalat az American Type Culture Collection-től (Manassas, USA) vásároltuk, és Dulbecco módosított Eagle táptalajban (Sigma, St. Louis, USA) tenyésztettük, amely 10% borjúmagzati szérumot és antibiotikumot tartalmazott [100 U/ml penicillin (Sigma) és 100 µg/ml sztreptomicin (Sigma)]. A sejteket nedvesített 5% CO2 atmoszférában 37 °C-on inkubáltuk.

A fukoidán és a CT kivonat NO szekrécióra gyakorolt ​​hatásának felmérésére RAW 264.7 sejteket (1×106 sejt/ml) fukoidánnal vagy CT kivonattal (1–320 µg/ml) inkubáltunk 5 percig. , majd interferon- (IFN-, 10 U/ml) és lipopoliszacharid (LPS, 10 µg/ml) 24 órán keresztül. Előzetes vizsgálataink során bebizonyosodott, hogy a RAW 264.7 sejtek aktiválását célzó IFN- plus LPS kezelés nem befolyásolta a sejtek életképességét 24 óráig, és a fukoidán és a CT kivonat nem volt citotoxikus 1 mg/ml-ig. A NO oxidált terméke, a nitrit (NO2 – ) koncentrációját mértük a NO indikátoraként. A táptalajt azonos térfogatú Griess-reagenssel (1% szulfanilamid, 0,1% naftil-etilén-diamin 2,5% foszforsavban) [21] összekevertük, és szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. A nitritkoncentrációt 540 nm-en elemeztük, ahol NaNO2-t használtunk a standard görbe létrehozásához.

Állatok és kezelés

A hím ICR egereket (7 hetes) a Daehan Biolink-től (Eumseong, Korea) vásároltuk, és állandó környezeti feltételek mellett (22±2ºC; 40-70% relatív páratartalom; 12-órás fény) tartottuk őket. -sötét ciklus; 150-300 lux fényerő). A pellet takarmány és a tisztított víz ad libitum volt elérhető. Az összes állatkísérletet jóváhagyta a koreai Chungbuk Nemzeti Egyetem (CBNU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), és a CBNU Laboratóriumi Állatkutató Központ szabványos működési eljárásai (SOP) szerint hajtották végre.

Az egereket (n=8/csoport) orálisan fukoidánnal (18 vagy 54 mg/kg), CT-kivonattal (54 vagy 162 mg/kg) vagy ezek keverékével (18+54, {{6) kezeltük. }} vagy 90+270 mg/kg) naponta egyszer 7 napon keresztül. Az alacsony dózisú fukoidán (18 mg/kg) és CT-kivonat (54 mg/kg) 100 mg/test (70 kg) és 300 mg/test becsült humán dózisból származott a testtömeg felületi transzlációja után (Km{14). }} ember/Km{15}} egér esetén). A fukoidán és a CT-kivonat magas dózisait 3-szorosra állítottuk, önmagában vagy keverékben, és a legnagyobb dózisú keveréket 5-szörösre rögzítettük a maximális szinergikus hatások felmérése érdekében.

A fukoidánnal és CT-kivonattal végzett kezelés első napján az egereknek 10 ml steril levegővel szubkután injekciót adtak a hátsó oldalukba, hogy egy tasakot képezzenek [22,23]. 2 és 5 nap elteltével a tasakot újra befecskendeztük 5 ml levegővel. Egy órával az utolsó kezelés után 1 ml karragenánt (1%-os sóoldatban; Sigma) vagy vivőanyagát (sóoldat) fecskendeztük be a tasakba.

A váladékok elemzése

A levegős tasakot 1 ml hideg sóoldattal mostuk 6 órával a karragenán injekció után, és feljegyeztük az öblítőfolyadék nettó térfogatát. A gyulladásos sejtek, a neutrofilek, a monociták és a limfociták teljes számát Coulter-számláló segítségével határoztuk meg. Az NO és a PGE2 koncentrációját Griess-reagenssel (Sigma) és enzim immunoassay-vel (EIA) határoztuk meg Correlate-EIA kit (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA) segítségével.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A GYULLADÁSOS SEJT KEMOTAXIS HAJÁSÁNAK BLOKKÁLÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Hisztopatológiai vizsgálat

A tasakot bélelő szövetet eltávolítottuk és semleges formalinoldatban rögzítettük. A paraffinba ágyazott szövetlemezeket hematoxilin-eozinnal megfestettük, és fénymikroszkóp alatt megvizsgáltuk a gyulladásos elváltozásokat.

Statisztikai elemzés

Az eredményeket átlag±SE formában adjuk meg. A kísérleti csoportok összehasonlítását egyirányú varianciaanalízissel, majd Tukey-teszt korrekciójával végeztük. AP érték<0.05 was considered statistically significant.

Eredmények

In vitro a RAW 264.7 sejttenyészet, az IFN- és az LPS kezelés nagymértékben növelte a NO termelést (1. ábra). A fukoidánnal (1–320 µg/ml) végzett előkezelés nem befolyásolta a makrofág sejtvonal NO felszabadulását (1A. ábra). Összehasonlításképpen, a CT-kivonat (32-320 µg/ml) szignifikánsan elnyomta a NO-termelést, ami gyulladásgátló hatást jelez (1B. ábra).

A karragén befecskendezése az egér levegőtasakjába jelentősen megnövelte a tasakon belüli váladék mennyiségét (2. ábra). Az ilyen megnövekedett váladékozást fukoidánnal (18 mg/kg) és CT-kivonattal (54 és 162 mg/kg) végzett kezelés csillapította. Figyelemre méltó, hogy a fukoidán és CT-kivonat kombinációs kezelése tovább csökkentette a váladék mennyiségét az egyéni hatásokhoz képest, bár a nagyobb dózisú kombinációk (54+162 mg/kg és 90+270 mg/kg) nem mutattak további hatásosságot. a legalacsonyabb dóziskombinációra (18+54 mg/kg) (2A ábra). A tasak N fokú intenzitása szintén drasztikusan megnőtt a karragén injekciót követően (2B. ábra). A fukoidán enyhe hatásához képest a CT kivonat jelentősen csökkentette az N fokú onkoncentrációt. A fukoidán és CT kivonat kombinált kezelése dózisfüggő módon tovább csökkentette az NO szintet. Hasonlóképpen, a megnövekedett PGE2 tartalmat szinergikusan elnyomta a fukoidán és CT-kivonat kombinációs terápia (2C. ábra).

A tasakban lévő gyulladásos mediátorokkal párhuzamosan a gyulladásos sejtek száma drasztikusan megnőtt a karragenán injekció hatására: a neutrofilek, a monociták és a limfociták kontrollszintjének 37,8-szorosára, 4,8-szorosára és 24,1-szeresére nőtt (1. táblázat). A fukoidán és a CT kivonat azonban szignifikánsan csökkentette a gyulladásos sejtek infiltrációját, amelyben a fukoidán valamivel jobb volt, mint a CT kivonat. A fukoidán és a CT kivonat együttes adagolásával váratlanul nem sikerült szinergista hatást elérni a gyulladásos sejtek infiltrációjában.

Amint az a váladékokban lévő gyulladásos sejtek infiltrációjából következtethető, a levegőtasakokat körülvevő bőr alatti szövet súlyos gyulladásos elváltozásokat mutatott (3. ábra). A karragenán hatásának kitett megvastagodott bőr alatti szövetben rendkívül sok sejtet figyeltek meg (3B. ábra), összehasonlítva a kontrollállatok közel normális jellemzőivel (3A. ábra). Az ilyen gyulladásos elváltozásokat jelentősen gyengítette a fukoidánnal (3C. és 3D. ábra) vagy CT-kivonattal (3E. és 3F. ábra) végzett kezelés.

Figyelemre méltó, hogy nagyobb gyulladáscsökkentő hatást értek el a fukoidánnal és CT-kivonattal végzett kombinált terápia (3G-3I. ábra).

Vita

Egy in viv fokú arageenan-indukált légzsák-gyulladás modellt alkalmazva a rágcsálók hátába levegő befecskendezése olyan sejtek szaporodását idézi elő, amelyek az üreg felszínén rétegeződnek, és a szinoviumba hasonló szerkezetet alkotnak. Ebben a modellben a karragenán által kiváltott gyulladásos sejt-infiltráció injekciója növelte a váladék mennyiségét, ami vaszkuláris szivárgásra utal. A légtasak a gyulladásos sejtek és a helyileg felhalmozódó folyadékban könnyen mérhető mediátorok tárolójaként szolgál.

A vaszkuláris permeabilitást indukáló különféle gyulladásos mediátorok közül jól ismert, hogy a NO és a PGE2 számos gyulladásos betegség patogenezisében szerepet játszó fő tényezők. A fájdalom kiváltásának és érzékelésének közvetítőiként is ismertek. Az iNOS, amely különböző sejttípusokban expresszálódik és aktiválódik TNF- és/vagy LPS-stimuláció révén a gyulladás során, magas, tartós NO-koncentrációt termel. Az NO fontos szabályozó molekula különféle élettani funkciókban, mint például a vasodilatáció, amely vaszkuláris szivárgáshoz vezet. A PGE2, amelyet arachidonsavból állítanak elő COX-okon keresztül, számos gyulladásos betegség kialakulásához járul hozzá, és a PGE2 túltermelése a különböző gyulladásos stimulációk hatására a COX-II szintjének emelkedésével és a gyulladás progressziójával jár. Ezért a TNF- - NO és a COX-II-PGE2 útvonalakat a gyulladásos folyamatok két fő áramlatának tekintik, amelyeket az iNOS (kortikoszteroidok) és COX (NSAID-k) inhibitorai blokkolnak.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA GYULLADÁSOS BETEGSÉGEK TILTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A jelen vizsgálatban a fukoidán és a CT-kivonat együttadása csökkentette a váladék mennyiségét a tasakban, ami arra utal, hogy szuppresszív hatást fejtenek ki az érrendszeri szivárgás ellen (2A. ábra). Az egyes fukoidán és CT kivonatok egyedi hatásaihoz képest a kombinált kezelés tovább nőtt, ami azt jelenti, hogy a két fokú kompozíció szinergikusan hat. A fukoidán és a CT-kivonat közötti ilyen szinergikus hatásokat alátámasztották a váladékok NO és PGE2 szintjére gyakorolt ​​aktivitásuk (3B. és 2C. ábra).

Érdekes módon azonban megerősítést nyert, hogy a fukoidán nem gátolja közvetlenül a makrofágok aktiválódását in vitro vizsgálatban (1A. ábra). Hasonlóképpen, a fukoidán gátló potenciálja az NO és a PGE2 akkumulációjának in vivo vizsgálatában viszonylag alacsonyabb volt, mint a CT-kivonaté (2B. és 2C. ábra). A fukoidán ilyen hatásmechanizmusa különbözik a sejtek CT-kivonat általi közvetlen inaktiválásától (1B. ábra). Összehasonlításképpen, a fukoidán nagy hatékonyságot fejtett ki a gyulladásos sejtek infiltrációjának gátlásában a tasakban (1. táblázat). A fukoidán jobb volt a CT-kivonatnál a neutrofilek, monociták és limfociták vándorlásának gátlásában a karragenán által kiváltott szövetsérülési helyekre. Érdekes módon a fukoidán és a CT kivonat között nem volt szinergikus migrációs gátló hatás, ami a fukoidán és a CT kivonat eltérő hatásmechanizmusára utalna: azaz a fukoidán blokkolja a gyulladásos sejtek beszűrődését, míg a CT kivonat gátolja a sejtek aktivációját.

A polimorfonukleáris sejtek, különösen a neutrofilek, a fő sejtkomponensek, amelyek a karragenán által kiváltott akut gyulladásos helyekre toborozódnak. Ezenkívül a kialakuló gyulladásos sejtek, például a makrofágok és a limfociták szintén központi szerepet játszanak a gyulladásos folyamatban, citokinek szekretálásával. Amikor fukoidánnal vagy CT-kivonattal előkezelték, a fehérvérsejtek száma, amelyek a karragenánnal befecskendezett légzsákokba vándoroltak, jelentősen lecsökkent. Ez az eredmény összhangban volt a kortikoszteroidok, például a dexametazon hatásával, de nem az NSAID-okkal, beleértve az indometacint is. Ezért feltételezzük, hogy a fukoidán és a CT kivonat részben szteroid tulajdonságokkal rendelkezik.

A gyulladásos sejtkemotaxist gátló hatás mellett a CT-kivonat elnyomja a makrofágok aktiválódását. Ezt megerősítette az NO in vitro és in vivo gátló hatása, amely a makrofágok által termelt fő gyulladásos mediátor. Így a CT-kivonat makrofágokra gyakorolt ​​hatása az mRNS-expresszió elnyomásának és/vagy az iNOS-aktivitás közvetlen gátlásának tulajdonítható ezekben a sejtekben.

A PGE2 szintén az egyik fő gyulladásos mediátor. A szöveti ödémával párhuzamosan fokozódik, amelyet az NSAID-ok, a COX-gátlók elnyomnak. A karragenán növelheti a PGE2 termelést azáltal, hogy COX-II mRNS-t és COX-II fehérjét indukál a tasak váladékában. Ebben a modellben a karragenán szignifikánsan növelte a PGE2 mennyiségét, és ezt a CT-kivonat jelentősen elnyomta. Érdekes megjegyezni, hogy ez az eredmény összhangban volt egy NSAID indometacin hatásával. Ezért az eredményekből arra következtethetünk, hogy a CT-kivonat az NSAID-ok további tulajdonságaival is rendelkezik. Összességében úgy gondolják, hogy a CT-kivonat kortikoszteroid és NSAID-szerű hatást fejtett ki a karragenán által kiváltott gyulladásos modellben, és a fukoidán fokozta aCT kivonat gyulladáscsökkentő hatásaa gyulladásos sejtek infiltrációjának blokkolásával.

Bár a hatásmechanizmus pontos meghatározása további vizsgálatokat igényel, a fukoidán és a CT-kivonat keveréke jelentősen gyengítette a gyulladásos tüneteket azáltal, hogy blokkolja a TNF-NO és a COX-II-PGE2 útvonalat a karragenán által kiváltott légzacskó-gyulladásban. Ezek az eredmények bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a fukoidán és a CT-kivonat kombinált kezelése ígéretes jelölt lehet a kortikoszteroidokra vagy NSAID-okra reagáló különféle típusú gyulladások enyhítésére.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA GYULLADÁSOS BETEGSÉGEK TILTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%