A katepszin B cikloasztragenollal történő megcélzása fokozza a CD8 T-sejtek daganatellenes immunitását az MHC-I lebomlásának gátlásával 1. rész

ABSZTRAKT

HáttérA tumorantigének elvesztése és a CD8 T-sejtek PD-1/PD-L1 útvonal által okozott depléciója fontos tényezők a tumor immunrendszerből való kijutásához. Az elmúlt években egyre több kutatás folyik a hagyományos kínai orvoslásról a daganatok kezelésében. A Cycloastragenol (CAG), amely az Astragalus membranaceus hatékony aktív molekulája, vírusellenes, öregedésgátló, gyulladásgátló és egyéb funkciókkal rendelkezik. Daganatellenes hatása és mechanizmusa azonban nem tisztázott.

A cisztanche glikozidja növelheti az SOD aktivitását a szív- és májszövetekben, és jelentősen csökkentheti az egyes szövetek lipofuscin- és MDA-tartalmát, hatékonyan megkötve a különböző reaktív oxigéngyököket (OH-, H2O₂ stb.) és megvédheti a DNS-károsodást. OH-gyökök által. A Cistanche feniletanoid glikozidok erős szabad gyökfogó képességgel rendelkeznek, nagyobb redukáló képességgel rendelkeznek, mint a C-vitamin, javítják a SOD aktivitását a spermiumszuszpenzióban, csökkentik az MDA-tartalmat, és bizonyos védő hatást fejtenek ki a spermium membrán működésére. A cistanche poliszacharidok fokozhatják a SOD és a GSH-Px aktivitását a D-galaktóz által okozott kísérletileg öregedő egerek eritrocitáiban és tüdőszöveteiben, valamint csökkenthetik a tüdő és a plazma MDA- és kollagéntartalmát, valamint növelhetik az elasztintartalmat. jó eltávolító hatás a DPPH-ra, meghosszabbítja a hipoxia idejét öregedő egerekben, javítja a SOD aktivitását a szérumban, és késlelteti a tüdő fiziológiás degenerációját kísérletileg öregedő egerekben A sejtmorfológiai degenerációval a kísérletek kimutatták, hogy a Cistanche jó antioxidáns képességgel rendelkezik és potenciálisan gyógyszer lehet a bőröregedési betegségek megelőzésére és kezelésére. Ugyanakkor a Cistanche-ban található echinakozid jelentős mértékben képes megkötni a DPPH szabad gyököket, és képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat és megakadályozza a szabad gyökök által kiváltott kollagén lebomlását, valamint jó helyreállító hatással van a timin szabad gyökök anionjainak károsodására.

Kattintson a Cistanche előnyeire és hátrányaira

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MódA CAG daganatellenes hatását MC38 és CT26 egér transzplantált tumormodellekben vizsgáltuk. A CAG daganatellenes hatását tovább elemeztük egysejtes multi-omics szekvenálás segítségével. A CAG célfehérjéjének megtalálásához célérzékeny akadálymentesítési profilalkotási technológiát alkalmaztak. Ezt követően a CAG daganatellenes mechanizmusát konfokális mikroszkóppal, immunprecipitációval és mutáns plazmidok transzfekciójával vizsgálták. Végül megvizsgáltuk a CAG és PD-1 antitestek kombinált daganatellenes hatását egerekben vagy organoidokban.

EredményekAzt találtuk, hogy a CAG hatékonyan gátolta a tumor növekedését in vivo. Egysejtű multi-omika atlaszunk kimutatta, hogy a CAG elősegíti a tumorsejt-felszíni antigének megjelenését, és a CD8 plusz T-sejtek fokozott ölő funkciója jellemezte. Mechanikusan a CAG a célfehérjéhez kötődött katepszin B-hez, amely azután gátolta a fő hisztokompatibilitási komplex I (MHC-I) lizoszómális lebomlását, és elősegítette az MHC-I aggregátum n-jét a sejtmembránba, megerősítve a tumorantigén előállomását. . Mindeközben a CAG és a PD-1 antitest kombinációja hatékonyan fokozta a tumorpusztító CD8 plusz T-sejtek tumorölését xenograft egerekben és vastag- és végbélrák organoidokban. Következtetés Adataink először számoltak be arról, hogy a katepszin B downregulációja tumorellenes immunitást biztosít, és lejáratja a természetes CAG termék daganatellenes mechanizmusát.

BEVEZETÉS

A vastag- és végbélrák az egyik leggyakoribb daganatos megbetegedés világszerte. Előfordulási aránya és halálozási aránya az első három közé tartozik, súlyosan veszélyeztetve az emberi életet és egészséget.1 A gyakori kezelési módszerek közé tartozik a sebészeti kemoterápia és a sugárterápia, a célzott gyógyszerek és az immunterápia.2–4 A rákos sejtek azonban általában elveszítik a felületi antigéneket, és kifejeződnek. magas szintű gátló molekulák, hogy elkerüljék az immunsejtek felügyeletét. Ezért a daganatos immunszökés problémájának megoldására a kutatók immunellenőrzési pont-inhibitorokat és neoantigénterápiát fejlesztettek ki, amelyek megakadályozzák a rákos sejtek elfedését az immunsejtekbe.5–8 Bár az immunkontrollpont-gátlók képesek visszaállítani a kimerült immunsejteket, a rák felszíni antigénjét. a sejteket nem vették be jelentősen. Ezért különösen fontos olyan gyógyszereket találni, amelyek elősegíthetik a tumor felszíni antigének megjelenését. A rákos sejtek citotoxikus CD8 plusz T sejtek általi felismerése a TCR/CD3/fő hisztokompatibilitási komplex (MHC-I) útvonaltól függ. A TCR megkapja a CI dendritesejt/ráksejt membránfehérje által jelenlévő antigént, és továbbítja a jelet a CD3 szoros összekapcsolására, amely aztán mélyebbre nyúlik a citoplazmába.{10}} Ugyanakkor a CD28/B7 jel aktiválásával , a CD8 plusz T-sejtek koaktiválhatók a rákos sejtek felismerésére és elpusztítására.11 A közelmúltban végzett vizsgálatok azt találták, hogy a daganat progressziója során a lizoszómák az MHC-I aggregáció csökkenését eredményezik a rákos sejtek felszínén, ami nem hatékony jelen lévő antigéneket.{16}} Liu és munkatársai arról számoltak be, hogy a PCSK9 gátlása megakadályozhatja az MHC-I lebomlását a lizoszómákban, és lehetővé teszi az MHC-I visszajutását a sejtmembránba, hogy antigéneket mutasson be.12 Ezért az antigénprezentáló funkció helyreállítása Az MHC-I különösen fontos a tumor immunszökés gátlásában.

Egyre több tanulmány kimutatta, hogy a hagyományos kínai orvoslás aktív molekuláinak alkalmazása a daganatellenes beavatkozások során nagy kilátásokat rejt magában.{0}} A Cycloastragenol (CAG) egy hatékony aktív molekula az Astragalus membranaceusban, amely antivirális, antibakteriális és anti- gyulladásos és egyéb farmakológiai hatások, de daganatellenes hatásáról ritkán számolnak be.16–19 Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a CAG gátolta a vastagbélrák daganatok transznatív daganatainak növekedését. A mechanizmus főként az MHC-I lebomlásának gátlását jelentette. katepszin B (CTSB), elősegítve a rákos sejtek antigénprezentációját, majd fokozva a CD8 plusz T-sejtek ölőképességét.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Antitestek és reagensek

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 százalék). CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actin (Cat#{{) antitestei 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ) és Anti-egér/nyúl Immunhisztokémiai Detection Kit (Cat#PK10006) a Proteintechtől vásárolták. H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853) antitestei, és a CTSB-t (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) a Santa Cruz Biotechnology-tól vásárolták. A Ki-67 antitestét (Cat#12202, PRID: AB_2620142 ) a Cell Signaling Technology cégtől vásárolták. A Na/K ATPáz antitestét (Kat.# ab3528, RRID: AB_303877) az Abcam cégtől vásárolták. A CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003) és CD{ áramlási citometriás antitestei {31}}A PerCP-t (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) a BD Bioscience-től vásároltuk. A Gzmb-FITC áramlási citometriás antitestét (katalógusszám 515403, RRID: AB_2114575) a BioLegendtől vásároltuk. NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) és IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID) áramlási citometriás antitestei :AB_466192) a Thermo Fisher Scientifictól vásárolták. A DMEM táptalajt (Cat#01-052-1ACS), a PenicilinStreptomycint (Cat#15140122) és a Fetal Bovine Serumot (Cat#C04001-500) a Biological Industries cégtől vásároltuk. A kecskeszérumot (Cat#88RNG001) és a Pierce BCA protein assay Kit-et (Cat#23225) a Thermo Fisher Scientific cégtől vásároltuk. Az anti-humán PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) és az egér elleni PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) antitestei a Bio X cellától vásárolták. A MACS Tumor Tissue Dissociation Kit (katalógusszám130-095-929) a Miltenyi Biotec-től vásárolt.

Sejttenyésztés

Laboratóriumunkban az MC38 és CT26 egér vastagbélrák sejtvonalakat tartottuk fenn.20 A humán vastagbélrák l HCT-116 vonalait a Kínai Tudományos Akadémia Type Culture Collection gyűjteményéből szereztük be (Sanghaj, Kína). Az MC38, CT26 és HCT{6}} sejteket 10% magzati szarvasmarha szérumot és 1% penicillint/sztreptomicint tartalmazó DMEM tápközegben tenyésztettük 37 fokos hőmérsékleten, 5% CO2 inkubátorban.

Transzplantációs tumorkísérlet

Hatnyolc hetes nőstény C57BL/6JGpt egereket, BALB/c egereket és BALB/,c csupasz egereket a GemPharmatechtől (Nanjing, Kína) vásároltunk. MC38 vagy CT26 rákos sejteket (1 × 106) szubkután oltottunk be minden egérbe. Amikor a daganat 100 mm3-re nő, a mikrofont véletlenszerűen foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS) csoportra (pl. naponta egyszer) és CAG-csoportra (pl. 50 mg/kg naponta egyszer) osztottuk. A tumor térfogatát tolóméréssel határoztuk meg a V=hossz × szélesség2 /2 képlet alapján. Amikor a PBS csoportba tartozó egerek tumor térfogata elérte az 1000 mm3-t, az egerek daganatát kivettük, lefényképeztük és lemértük.

Egysejtű disszociáció az egérből az egysejtű RNS/ATACseq

Az egerekből származó szilárd daganatokat Tumor Dissociation Kit segítségével emésztettük, hogy egysejtű egysejtet kapjunk. Single celEgysejtűek 1000 sejt/1000 sejt koncentrációval a 10×genomics krómvezérlőre feltöltött egysejtű egysejtűek a 10×genomics gyártó protokollja szerint. A reverz transzkripciós reagenseket, vonalkódos gélgyöngyöket és megosztó olajat összekevertük a sejtekkel a gén számára, hogy gélgyöngyöket állítsunk elő emulziókban (GEM) a reverz transzkripcióhoz. scRNA-seq adat előfeldolgozás és qua y ellenőrzés.

A GRCm38 (mm10) egér referenciagenom alapján a CellRanger V.4.0.0 csővezeték (10×Genomics) az egysejtű RNS feldolgozására szekvencia adatok minden kísérlethez (GSE197229). A digitális génexpressziós mátrixokat R-ben (V.4.{13}}.4) a Seurat (V.4.0.0) csomag segítségével zúztuk.21 A dBeforem analízis előtt a sejteket UMI-szám alapján szűrtük (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq adatok előfeldolgozása és minőségellenőrzése

Az egycellás ATAC-seq adatokat (GSE197229) a cell ranger-at (V.2.0.0) előfeldolgozta a count parancssorral. A további scATAC-seq adatfeldolgozáshoz és elemzéshez az ArchR (V.1.0.1) csomagot használtuk.24 Ezután az addArchRGethe nome ('mm10') függvényt használtuk a genom annotációjához, és létrehoztunk egy arrow fájl a cre ArrowFiles függvénnyel az alapértelmezett paraméterekkel. Ezután a filterDoublets függvényt használva töröltük a potenciális dubletteket, és létrehoztunk egy ArchR projektet az ArchRProject függvény használatával az alapértelmezett paraméterekkel. Ezután a Harmony csomag segítségével távolítottuk el a kötegelt hatást az addHarmony függvénnyel.25 A dimenziócsökkentéshez az ArchR addIterativeLSI függvényét használjuk a def t paraméterekkel való futtatáshoz. Az egycellás beágyazáshoz harmóniával választottuk ki a redukáltDims objektumot, és az addTSNE függvényt használtuk a „perplexity=30” paraméterrel a megjelenítéshez.

Az siRNA-seq és scATAC-seq adatok integrált elemzése

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Az előrejelzések pontosságának javítása érdekében a két adatkészlet jobb integrálása érdekében ismét integráltuk a scATAC-seq és scRNA-seq adatokat a „korlátozott integráció” móddal. Röviden, a scATAC-seq adatokat sejttípusokkal annotáltuk a scATAC-seq génpontszámai alapján. Ezután létrehoztunk egy korlátozott listát úgy, hogy a génexpressziós hasonlóságot csak ugyanabban a sejttípusban számítottuk ki mind a scATAC-seq, mind az scRNA-seq esetében. A t-SNE-vel végzett nem felügyelt klaszterezés 13 alsejtklasztert tárt fel, amelyeket ismert vagy feltételezett markerekkel jelöltek meg az online kiegészítő 1. táblázatban.

Pszeudoidejű leszármazási pálya

A rákos sejtek sejtvonal pályájára a Monocle2 (V.2.18.0) R csomag segítségével következtettünk.26 A monociták megtanulják az explicit főgráfot az egysejt genomikai adatokból a Reversed Graph Embedding segítségével, hogy rendezzék a sejteket, így megoldva a komplex megoldást. A biológiai folyamatokat robusztusan és pontosan.27 A ''differentialGeneTest'' függvény segítségével származtattuk a DEG-t az egyes klaszterekből, majd a sejtpályák felépítése után pszeudoidőben detektáltuk a differenciálisan kifejeződő géneket. Az összes pszeudoidő-függő gént a plot_pszeudotime_hőtérkép funkcióval jelenítettük meg, amely egy CellDataSet objektumot vett fel. A CellDataSet-en alapuló vonalpálya-rajzokat és sima kifejezési görbéket a plot_cell_trajectory, illetve plot{13}}gének_állapotban_állítottak elő.28

Egycellás másolatszám variációs hívás

A nagyméretű, klonális kromoszómális kópiaszám-variációkkal (CNV) rendelkező rosszindulatú sejtek azonosításához az inferCNV R csomag segítségével következtettünk az egyes sejtek genetikai profiljára a nagy génkészletek átlagos expressziója alapján a tumorgenom egyes kromoszómális régióiban, összehasonlítva normál sejtek.29 Minta-minta alapon az immunsejteket referenciaként használták a rákkal kapcsolatos sejtekben lévő CNV-k becslésére.

Dúsítási elemzés

A KEGG útvonal és a GO annotáció elemzését az R csomag clusterProfiler (V.3.11.1) segítségével végeztük a PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} paramétereivel. }.05, MingsSize=10 és MaxGSSize=500.20 A génkészlet-dúsítási elemzést (GSEA) 50 fémjel-génkészlettel (h.all.V.7.4.symbols. gmt) alkalmaztuk a jelentősen feldúsult génkészletek azonosítására. funkcionális útvonalak a GSEA szoftveren keresztül (V.4.1.0), névleges P-értékű szűrési kritériumokkal<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kvantitatív valós idejű PCR elemzés

Az MC38 és a HCT-116 sejteket hatlyukú lemezekre oltottuk 6 órán át, majd további 24 órán át CAG-val kezeltük. A sejteket háromszor mostuk hideg PBS-sel, és centrifugáltuk 18{18}}g-vel 5 percig 4 fokon. Ugyanakkor a daganatszövet őrlése után. A teljes RNS-t az MC38-ból, a HCT-116 sejtekből és a daganatszövetből vontuk ki a TRIzol reagens segítségével, a gyártó utasításai szerint. A reakciótérfogat 20 µl volt, amely a következőket tartalmazza: 1 µg RNS, 5 µL 5×Hiscript III qRT SuperMix és RNase Free dH2 O. A cDNS-t kvantitatív PCR-nek vetettük alá, 10 µL reakciótérfogattal 1 µl cDNS-sel, 5 µL 0,5 µL qPCR 5 µl primer keverékkel. (Forward and Reverse) és 3,25 µl RNáz-mentes dH2O-t. A primereket a GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Kína) szintetizálta a következő szekvenciák szerint (2. online kiegészítő táblázat).

Célfelderítés egy célérzékeny akadálymentesítési profilalkotási megközelítéssel

A CAG-kötő fehérjék szűrését a korábban leírtak szerint végeztük.{1}} Röviden, a cél-reszponzív akadálymentesítési profilalkotás (TRAP) megközelítést alkalmaztuk a CAG-kötő fehérjék felfedezésére a sejtkörnyezetben a ligandumkötés által kiváltott lizin monitorozásával. a hozzáférhetőség proteom szinten változik. Röviden, két tál sejtet 10µM CAG-val, illetve dimetil-szulfoxiddal (DMSO) kezeltünk. 1-órás inkubáció után a sejteket M-PER pufferrel (Thermo Scientific) permeabilizáltuk, és a kapott lizátumokat formaldehid és borán-piridin komplex hozzáadásával kovalens jelöléssel látták el, amelyek együtt specifikusan fehérjeszerű lizin-maradékokat jelölnek szobahőmérsékleten a hozzáférhetőség profiljának meghatározásához. . Ezután a lizátumokat szerves oldószerrel kicsaptuk, és az összegyűjtött pelleteket 8 mol/l karbamidban újra feloldottuk, ditiotreitollal (DTT) redukáltuk 56 fokon 30 percig, majd jód-acetamiddal (IAA) alkileztük sötétben 30 percig. Megfelelő mennyiségű DTT-oldatot adtunk hozzá ismét, hogy reagáljunk a feleslegben lévő IAA-val. Ezt követően a proteomot ammónium-hidrogén-karbonát oldattal hígítottuk, amíg a karbamid végső koncentrációja el nem éri az 1 mol/l-t. Az összegyűjtött fehérje-emésztéseket C18 HLB oszlopokon (Waters, Milford, Massachusetts, USA) sómentesítettük, a dúsított peptideket szárítottuk, és 0,1%-os hangyasav (FA) vizes oldatban rekonstituáltuk. AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF rendszert (Waters) alkalmaztunk a minták elemzésére a CAG-kötődésre adott válaszként a lizin hozzáférhetőség változásainak kvantitatív profilozására a célfelderítés céljából. Az adatgyűjtéshez pozitív módú adatfüggőség-szerzést használtunk. Az adatok elemzése PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada) segítségével történt. Pontosabban a cys alkilezést választottuk fix módosításként, és a metionin oxidációt és a lizin dimetilezést, amelyet TRAP jelöléssel értek el, változó módosításként. Röviden, azokat a peptideket, amelyek TRAP-indukálta dimetilációt tartalmaznak, és jelentős mennyiségi változást mutattak CAG inkubációval és anélkül, cél-reszponzív peptidek közé soroltuk. Az egyes TRAP-jelölt peptidek bőségének aránya jelzi a hozzáférhetőség változásának mértékét, és szorosan összefügg a ligandumkötő affinitással. Student-féle t-tesztet végeztünk annak felmérésére, hogy a jelölt peptidek észlelt hozzáférhetőségi változásai statisztikailag szignifikánsak-e. Egy csoportközi p-érték (o<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Organoid kultúra

A humán vastag- és végbélrák organoidokat a Chongqing Kingbiotech konstruálta és tenyésztette.33 A sebészeti beavatkozás során nyert betegek szövetmintáit steril ollóval a lehető legkisebb darabokra aprították. A szövetdarabokat alaposan összekevertük Matrigel-lel (Corning, Cat#356231) körülbelül 1:4 arányban jégen. Az ezt követő feldolgozás a közzétett protokollokra vonatkozott. Röviden, a darab-Matrigel szuszpenziókat gyorsan beoltottuk a többüregű lemezbe, hogy félgömb alakú cseppeket képezzenek, és 15-20 percre 37 fokra helyezzük át, lehetővé téve a cseppek megszilárdulását. Adjon hozzá megfelelő mennyiségű táptalajt (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​minden egyes lyukba, és cserélje ki a táptalajt 2–4 naponta.

Humán CD8 T-sejtek izolálása és tenyésztése

Adjon azonos mennyiségű normál sóoldatot az egészséges emberek antikoagulánsokat tartalmazó perifériás véréhez a teljes vér hígításához. Adjon hozzá bizonyos térfogatú elválasztóoldatot egy 15 ml-es centrifugacsőhöz, lassan adja hozzá a hígított teljes vért a cső fala mentén az elválasztóoldat tetejéhez, és centrifugálja 750 g-vel 20 percig. Centrifugálás után pipettával óvatosan szívja be a középső fehér rétegben lévő monocitákat egy 15 ml-es centrifugacsőbe, adjon hozzá bizonyos mennyiségű PBS-t az újraszuszpendáláshoz, centrifugáljon 250 g-vel 5 percig, és dobja ki a felülúszót. Miután humán CD8 mágneses gyöngyöket adtunk a sejtcsapadékhoz, a CD8 T sejteket LS válogató oszlopon válogattuk. CD8 T-sejteket adtunk az 5 µg/ml CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) antitesttel, majd 10 ng/ml IL{15} antitesttel előzetesen bevont perforált lemezhez. } (Peprotech Cat# 212-12) és 5 µg/ml CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) funkcionális antitesteket adtunk hozzá, és 24 órán át tenyésztettük.

Kokultúra

Miután az organoidokat 24 órán át CAG-val inkubáltuk, a friss tápközeget kicseréltük, majd az organoidokat és az aktivált CD8 T-sejteket a mátrixgélben szuszpendáltuk, majd a szuszpenziót a hatlyukú lemezre adtuk és a 37. fokos inkubátorban 15 percig, majd 2 ml szérummentes komplett tápközeget adtunk hozzá 24 órára.

Nyugat folt

Az MC38 és a HCT-116 sejteket hatlyukú lemezekre oltottuk 6 órán át, majd további 24 órán át CAG-val kezeltük. A sejteket háromszor mostuk hideg PBS-sel, és 180 g-vel centrifugáltuk 5 percig 4 °C-on. A teljes fehérjét 1% proteáz inhibitort tartalmazó WB-IP lízissel lizáltuk 30 percig jégen. A teljes fehérjét egy BCA fehérje mennyiségi mérőkészlettel határoztuk meg. A fehérjemintákat 10–12 százalékos SDS poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk el, és PVDF (polivinilidén-fluorid) membránokra vittük át 350 mA-en 90 percig. A PVDF membránokat 5% BSA-val blokkoltuk 1 órán át, a csíkokat a jelzett elsődleges antitesttel egy éjszakán át, és a másodlagos antitesttel 90 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Végül a csíkokat LumiGLO kemilumineszcens szubsztrát rendszerrel (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA) detektáltuk.

Áramlási citometria

A daganatszövet emésztése után elkészítettük az egysejtű szuszpenziót. A felületi festést FCM (Flow Cytometry) pufferben (1% FBS-t tartalmazó PBS) lévő felületi antigén antitestekkel végeztük, és jégen festettük megfelelő antitestekkel 30 percig. Az elhalt sejtek eltávolítására reaktív festékeket (eBioscience) használtak. Az intracelluláris citokinfestést BD sejtfixáló oldattal/extracelluláris membrán oldattal végeztük, majd a sejteket fixáltuk és permeáltuk, majd Perm/Wash pufferben (BD Biosciences) citokinek elleni antitestekkel festettük.

CTSB mutáns plazmidok transzfektáltak

A HCT-116 sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk 12 órán át, majd 36 órán át CTSB-WT-EGFP vagy CTSB mutáns plazmidokkal (Y75A, A77V és G198A) transzfektáltuk.

A CTSB transzfekciós zavara vagy túlzott expressziója MC38 sejtekbe vagy HCT-116 sejtekbe

MC38 sejteket (1×106/lyuk) oltottunk be 6-lyukú lemezekre 6 órán keresztül, majd CTSB-t interferáló RNS-sel (szekvencia: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT és Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) transzfektáltuk 48 órán keresztül, és az mRNS vagy fehérje expressziós szintjét. Ctsb-t és H2-k1-et észleltek. HCT-116 sejteket (1×106/lyuk) oltottunk be 6-lyukú lemezekre 6 órán keresztül, majd CTSB interferenciával (szekvencia: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) vagy túlzott expressziós plazmiddal transzfektáltuk 48 órán keresztül, és az mRNS-t. vagy CTSB és HLA-A fehérje expressziós szintjét mutatták ki.

Dokkoló technológia

A CTSB 3D struktúráját a Protein Database-ból (PDB ID: 2iPP), a CAG struktúráit pedig a PubChemtől töltöttük le. A dokkolási folyamatot az Autodock 2-ben hajtották végre durva dokkolással, szimulált lágyító algoritmus segítségével, majd ezt követően egy genetikai algoritmust alkalmazó finomítással.

Celluláris hőeltolódási vizsgálat

Az MC38 sejteket egy éjszakán át 10 cm-es lemezekre oltottuk, majd további 2 órán át CAG-val vagy 0,1 százalékos DMSO-val kezeltük. A sejteket összegyűjtöttük, hideg PBS-sel mostuk, és 180 g-vel centrifugáltuk 5 percig. A sejteket ezután egyenletesen centrifugáló csövekbe osztottuk (70 µl mindegyik csőben), és 3 percig melegítettük a következő hőmérsékleten: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 és 67 fok, a mintákat 3 percig hűtöttük. majd jégen tartották. Ezután a mintákat egy éjszakán át -80 fokos hűtőszekrénybe helyeztük. A mintákat szobahőmérsékleten 30 percig felolvasztjuk, majd 4 órán át -80 fokon hűtjük. Végül a mintákat 12, 000g-vel centrifugáltuk 25 percig, a felülúszót hozzáadtuk a töltőpufferhez, és Western-blot-eljárással elemeztük.

Immunhisztokémiai festés

A tumorszövet paraffin metszeteit 20 percre xilolba merítettük a viaszmentesítés érdekében, majd 100 százalékos, 75 százalékos és 50 százalékos etanolba 10 percre. Miután a szeleteket nátrium-citrát antigénjavító oldattal antigénjavításnak vetettük alá, az endogén hidrogén-peroxidot 3 százalékos hidrogén-peroxiddal inaktiváltuk. 5%-os kecskeszérummal 1 órán át végzett blokkolást követően az anti-Ki67 antitestet (1:200) adtuk hozzá, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. Hozzáadtuk az anti-egér/nyúl HRP-vel jelölt polimert (100 µl), és a mintákat 37 fokon 30 percig inkubáltuk, majd 100 µl DAB munkaoldatot, és szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk. 1 perces hematoxilinnel történő festés után a mintákat 50 százalékos, 75 százalékos és 100 százalékos etanolban és xilolban mostuk 5 percig, és semleges gumit használtunk a film lezárására. A filmet mikroszkóp alatt megfigyelték és lefényképezték.

Statisztikaielemzés

A statisztikai elemzés a GraphPad Prism szoftverrel (V.8.{1}}) történt. Az összes eredményt három független kísérlet átlag±SEM értékében fejezzük ki. Egyirányú varianciaanalízist, majd Dunnett-féle post hoc tesztet használtunk a különbségek értékelésére, ha kettőnél több csoport volt. A két csoport közötti szignifikáns különbség értékelésére Student-féle t-próbát használtunk. A statisztikai szignifikanciát p<0.05.

EREDMÉNYEK

Az átültetett vastagbélrák növekedését egerekben gátló CAG egysejtű multi-omika elemzése

Annak vizsgálatára, hogy a CAG-nak van-e daganatellenes hatása, először MC38 rákos sejteket ültettünk át C57BL/6 egerekbe. Megállapítottuk, hogy a CAG szignifikánsan gátolta a daganatok növekedését (online kiegészítő S1A, B ábra). Ezt követően CT26 sejteket ültettünk át BALB/c egerekbe, és megállapítottuk, hogy a CAG gátolja a daganatok növekedését is (online kiegészítő S1C, D ábra).

Annak érdekében, hogy jobban feltárjuk azt a specifikus mechanizmust, amellyel a CAG gátolja a tumornövekedést, scRNA-seq és scATAC-seq technikákkal elemeztük (1A. ábra). A sejtpopulációt négy csoportra osztottuk: rákos sejtek, fibroblasztok, mieloid sejtek és limfociták (1B ábra, online kiegészítő S2A, B ábra). Azt találtuk, hogy a rákos sejtek (52 százalék) és a fibroblasztok (41 százalék) főként a daganatos szövetekben infiltrálódnak, míg az immunsejtek csak 7 százalékát teszik ki. Ezután a rákos sejteket nyolc részhalmazra, a fibroblasztokat pedig három alcsoportra osztottuk (1C–E. ábra). Ezt követően az egyes sejtpopulációkban erősen expresszált gének dúsítási analízise azt mutatta, hogy a rákos sejtekben az MHC-I molekuláris útvonalak feldúsultak, csakúgy, mint a T-sejtek és NK-sejtek daganatellenes jelei (online kiegészítő S2C ábra). Ezután négy sejtcsoportot is találtak scATAC-seq és scRNA-seq integrációs analízissel (2D-G ábra). Az összehasonlítást követően azt találtuk, hogy a rákos sejtek (C01, C03 sejtek), CD8 plusz T sejtek, Spp1 plusz TAM sejtek és fibroblasztok (F01 és F02 sejtek) megjelentek az ATAC szekvenálásában (1F, G ábra), és további erősen expresszálódnak. transzkripciós faktorok feldúsultak ezekben a sejtekben (1H. ábra). Ezekkel az elemzésekkel azt feltételezzük, hogy a tumornövekedés CAG általi gátlása szorosan összefügg ezekben a sejtekben bekövetkező változásokkal.

A Cag elősegíti a tumorsejtek antigén prezentációját

A CAG daganatellenes mechanizmusának elemzéséhez először elemeztük a daganatos sejtpopulációt, és nyolc alcsoportra osztottuk a rákos sejteket (2A, B ábra, online kiegészítő S3A ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a PBS-csoporthoz képest a C05-csoport sejtek jelentősen csökkentek, míg a C07-csoport sejtek növekedtek (2C. ábra). Mindeközben, hogy ellenőrizzük a tumorsejt-klaszterezés pontosságát, összehasonlítottuk a limfociták és a mieloid sejtek CNV-jét referenciasejtekként. Az eredmények azt mutatták, hogy a rákos sejtek CNV-je szignifikánsan magasabb volt, mint az immunsejteké (online kiegészítő S3B ábra). A rákos sejtek alcsoportjainak elemzése során azt találtuk, hogy az Isg15, Irf7, Ifit3 és Ifi47 interferonválasz gének erősen expresszálódnak a CAG csoport C07 és C08 sejtpopulációiban a PBS csoporthoz képest (online kiegészítő S3C ábra). A tumorsejt-populáció elemzése azt találta, hogy az antigénprezentációval kapcsolatos útvonalak jelentősen feldúsultak több sejtpopulációban. Ezért azt feltételezzük, hogy a CAG elősegítheti a rákos sejtek antigénprezentációját, hogy daganatellenes szerepet játsszon (2D. ábra). Ezután kiválasztottuk az antigénprezentációval kapcsolatos géneket, és megállapítottuk, hogy a CAG-csoport expressziós szintje szignifikánsan magasabb volt, mint a PBS-csoportban (2E ábra, online kiegészítő S3D ábra). Azt is megállapítottuk, hogy a CAG elősegítette az antigénprezentációt a tumorszövetekben (2F, G ábra).

Ezután scATAC-seq segítségével elemeztük a CAG-t elősegítő tumorsejt-antigén prezentáció mögött meghúzódó specifikus okokat. Azt találtuk, hogy a tumorsejtpopuláció erősen expresszálta a Fos, Junb, Jund, Fosb és Fosl1 transzkripciós faktorokat (2H, I. ábra). Ezt követően elkészítettük a transzkripciós faktorok és a megfelelő gének közötti kölcsönhatás térképét annak magyarázatára, hogy a CAG elősegíti a tumorsejt-antigénprezentáló rokon gének expresszióját (2J. ábra). A tumorszövetekben azt is megállapítottuk, hogy a Junb, Fos, Jund és Fosb transzkripciós faktorok szignifikánsan túltermelődnek a PBS-csoportban CAG-kezelés alatt (2K-N ábra, online kiegészítő S3E-I ábra). Eddig azt találtuk, hogy a CAG elősegítheti az antigénprezentáló rokon gének transzkripciós faktorainak expresszióját, ezáltal fokozva a rákos sejtek antigénprezentáló funkcióját. Azonban továbbra sem világos, hogy ezek a rákos sejtek hogyan reagálnak az immunsejtek válaszaira.

Annak a jelenségnek a feltárására, amellyel a CAG elősegíti a rákos sejtek antigénprezentációját, pályaanalízist végeztünk, hogy megvizsgáljuk, hogyan változtatják meg egymást a rákos sejtek az immunsejt-válaszokra adott válaszként. Azt találtuk, hogy idővel a C07 rákos sejtek C05, C06 és C08 sejtekké alakultak át, és a géndúsítás azt is megmutatta, hogy a rákos sejtek átalakulnak antigénprezentációvá (3A–E. ábra).

A CAG fokozza az immunsejtek pusztító funkcióját

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CAG képes tumorsejt-antigéneket prezentálni, tehát a tumorsejt-antigén-prezentáció fokozása az immunsejtek működésének fokozásához vezet? Ennek kiderítésére limfocitákat és mieloid sejteket elemeztünk. Az eredmények azt mutatták, hogy a CAG elősegítette a CD8 plusz T sejtek beszűrődését a tumorszövetekben, és a CD8 plusz T sejtek és NK sejtek infiltrációja is fokozódott, amit áramlási citometriával detektáltunk (online kiegészítő S4A-F ábra). Azt is megfigyeltük, hogy a CAG fokozta az Ifitm2, Cxcr6 és S100a6 gének expresszióját CD8 plusz T sejtekben,

Fcer1g, Gzmb, AW112010 és Zfp36i2 gének NK sejtekben, valamint Nfkbia és Junb gének CD4 plusz T sejtekben (online kiegészítő S4G ábra). Az Ifng és a Gzmb expressziója a CD8 plusz T sejtekben szintén szignifikánsan fokozódott, amint azt áramlási citometriával kimutattuk (online kiegészítő S4H ábra, I). Megállapítottuk továbbá, hogy a CAG kezelést követően a CD8 plusz T sejtek felszínén csökkent a Lag3, Tigit és Havcr2 gátló receptorok expressziója, valamint a Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 és Pdcd1 gének expressziója, ami a A CD8 plusz T sejtek aktiválása szignifikánsan megnövekedett (online kiegészítő S4J ábra). Annak további igazolására, hogy a CAG fokozta a CD8 plusz T sejtek pusztító funkcióját azáltal, hogy elősegíti a fokozott tumorantigén prezentációt, CT26 sejteket ültettünk át meztelen egerek transzplantált daganataiba, és megfigyeltük, hogy a CAG nem tudja hatékonyan gátolni a daganatok növekedését (online kiegészítő S4K-M ábra). ).

Ezt követően a mieloid sejteket elemeztük, és megállapítottuk, hogy az Spp1 plusz TAM sejtek növekedtek a CAG kezelés után, míg a C1qc plusz TAM sejtek száma csökkent és az Il1b plusz monociták száma nőtt (online kiegészítő S5A-D ábra). A CAG kezelés után az Spp1 plusz TAM és a C1qc plusz TAM sejtek érzékenyebbek voltak a gyulladást elősegítő TAM transzformációra. A dúsítási elemzés azt találta, hogy főként a Tnf-, Ifn-g-re és a gyulladásos válasz jelátviteli útvonalára összpontosított (online kiegészítő S5E-H ábra). A fent említett eredmények alapján arra következtetünk, hogy a CAG fokozza az immunsejtek felismerését és elpusztító funkcióját azáltal, hogy elősegíti az antigénprezentációt a rákos sejtekben. A CAG szabályozásának módja azonban nem világos.

A CAG célfehérje CTSB felfedezése csapdával

Ezután megvizsgáljuk azt a specifikus CAG célfehérjét, amely daganatellenes szerepet játszik. A rákos sejteket azért választottuk kutatási tárgynak, mert azt találtuk, hogy a CAG fokozhatja a rákos sejtek antigénprezentációját, ezáltal fokozva az immunsejtek pusztító funkcióját. Először a CAG biotinszármazékát szintetizáltuk, és azt találtuk, hogy csak az 3-OH képes reagálni (online kiegészítő S6A ábra). Ezután megvizsgáltuk, hogy a CAG-biotin elősegíti-e az antigénprezentációval kapcsolatos gének expresszióját az egér MC38 tumorsejtvonalban. Az eredmények azt mutatják, hogy a CAG-biotin nem befolyásolta a H2-K1, Cd74 és Anxa1 gének expresszióját (online kiegészítő S6B-D ábra).

Ezért a korábbi TRAP célkeresési módszert alkalmaztuk a laboratóriumban.32 CAG-ot és DMSO-t egyaránt az MC38 sejtvonallal inkubáltunk (4A. ábra). A CAG jelölt célfehérjeként azt a fehérjét választottuk, amelynek FC értéke nagyobb vagy egyenlő, mint 2 és ap kisebb vagy egyenlő, mint 0,05. Azt az elvet követve, hogy a kis molekulák fehérjékhez való kötődése a lizin alacsony jelölési hatékonyságához vezet, a CTSB-t választottuk a vizsgálathoz (4B. ábra). Ezután celluláris hőeltolódási vizsgálatot (4C. ábra) és mikroméretű termoforézist (MST) (4D. ábra) alkalmaztunk a CAG és a CTSB közötti kötődés ellenőrzésére, és azt találtuk, hogy a CAG és a CTSB közötti affinitás 26,6 nM (4D. ábra). Ezt követően megjósoltuk a CAG és a CTSB közötti kötőhelyeket a CTSB fehérje kristályszerkezete alapján a PDB könyvtárban. Azt találtuk, hogy a CAG mindkét végén és a CTSB ALA77 és GLY198 helyein lévő hidroxilcsoportokat hidrogénkötés köti, míg a CAG és CTSB TYR75, PRO76 és ALA173 helyeit van der Waals erő (4E. ábra) . A CAG és a CTSB közötti kötőhely ellenőrzésére a CTSB mutáns plazmidját transzfektáltuk HCT-116 sejtekben. Az eredmények azt mutatják, hogy az A77V-nél és a G198A-nál és a CAG-nál lévő mutáns plazmid közötti affinitás több százszor nagyobb, mint a WT-plazmidé (4F., G. ábra). A következő részben megvizsgáljuk azt a specifikus mechanizmust, amellyel a CAG daganatellenes szerepet játszik a CTSB-n keresztül.

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】