A kvercetin védő hatása a hipoxia és a reoxigenáció által sérült endotélsejtekre

További információért forduljontina.xiang@wecistanche.com

Háttér: Az agyi kisérbetegség (CSVD) a klinikai szindrómák csoportja, amely lefedi az agy kisereinek összes kóros folyamatát, amely stroke-ot és súlyos demenciát okozhat. Mivel azonban a CSVD patogenezise nem tisztázott, így a kezelés is korlátozott. Az endothelsejtek diszfunkciója korábban jelentkezik, mint a klinikai tünetek, mint például a magas vérnyomás és a leukózis. Ezért az endoteliális sejtek kezelése új áttörést jelent majd.kvercetin, egy flavonoid, amely számos növényben megtalálható, és gyulladásgátló és antioxidáns funkcióval rendelkezik. Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja a kvercetin endoteliális sejtkárosodásra gyakorolt ​​védő hatását, és alapvető elméletet adjon a későbbi klinikai alkalmazáshoz.

Módszerek: Humán agyi mikrovaszkuláris endothel sejteket (HBMEC) in vitro tenyésztettünk, és hipoxiával és reoxigenációval (H/R) állítottuk fel az endothel sejtek sérülési modelljét. A kvercetin HBMEC-ekre gyakorolt ​​​​védő hatását a sejtéletképesség, a sejtmigráció, az angiogenezis és az apoptózis szempontjából vizsgálták. A kvercetin mechanizmusának további tanulmányozása érdekében,oxidatív stresszés az endoplazmatikus retikulum stresszt elemeztük. Mi több, a vér-agy gát (BBB) ​​integritását is tanulmányozták.

Eredmények: kvercetinelősegítheti a HBMEC-ek életképességét, migrációját és angiogenezisét, valamint gátolja az apoptózist. Ezenkívül a kvercetin aktiválhatja a Keap1/Nrf2 jelátviteli útvonalat, csökkentheti az ATF6/GRP78 fehérje expresszióját. További tanulmányok kimutatták, hogy a kvercetin fokozhatja a Claudin-5 és a Zonula occludens-1 expresszióját.

Következtetések: Kísérleteink azt mutatják, hogy a kvercetin képes megvédeni a HBMEC-ket a H/R-től, amely elősegíti a sejtproliferációt, a sejtmigrációt és az angiogenezist, csökkenti a mitokondriális membrán potenciális károsodását és gátolja a sejt apoptózisát. Ez összefügghet az antioxidációval és az endoplazmatikus retikulum stressz gátlásával. Ugyanakkor a kvercetin növelheti a BBB konnexin szintjét, ami arra utal, hogy a kvercetin képes fenntartani a BBB integritását.

Kulcsszavak: agyi kisér betegség, endothel sejtek, kvercetin, oxidatív stressz, endoplazmatikus retikulum stressz, vér-agy gát

BEVEZETÉS

Agyi kisér betegség(CSVD) egy olyan gyűjtőfogalom, amely magában foglalja az összes kóros folyamatot, amely az agy kis ereit érinti, és különböző etiológiájú klinikai, képalkotó és patológiás szindrómák csoportjára utal, amelyek az intracranialis arterioláktól a venulákig terjednek (átmérőjű).<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

kvercetinegy flavonoid, amely számos növényben jelen van, mint például a Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc erős antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatással rendelkezik, és védő hatást fejthet ki különféle kóros állapotokban, beleértve a szív- és érrendszeri betegségeket, az anyagcserezavarokat, a neurodegeneratív betegségeket, a cukorbetegséget, a rákot és az elhízást (Dok-Go et al, 2003; Comalada et al, 2005; Cho és mtsai, 2006). A kvercetinnel végzett előkezelés jelentősen megnövelte az endogén antioxidáns enzimek expressziós szintjét ischaemiás sérült állatok hippocampalis CA1 piramis neuronjaiban, erős antioxidáns és neuroprotektív hatást mutatva (Chen et al, 2017). A legújabb tanulmányok azt is megállapították, hogy a kvercetin neuroprotektív hatással bír az ischaemiás sérülésekkel szemben, miközben megőrzi a BBB integritását (Jin et al, 2019). Azonban az agyi mikrovaszkuláris endothelsejtekre (BMEC) gyakorolt ​​hatását hipoxia és reoxigenációs (H/R) sérülés esetén kevéssé tanulmányozták, és a kvercetin BMEC-eket védő célfehérjéről nem számoltak be.

Vizsgálatunkban feltártuk a kvercetin védő hatását a humán agyi mikrovaszkuláris endotélsejtekre (HBMEC), amelyeket a H/R sértett tenyészetben. Ezzel egyidejűleg tovább tanulmányoztuk védő hatásának lehetséges mechanizmusát, hogy elméletibb alapot adjunk a kvercetin klinikai népszerűsítéséhez és új ötleteket adjunk a CSVD kezelésére.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Közegek, reagensek és antitestek

kvercetin(purity>98 százalékát a Best Biological Technology Co, Ltd.-től (Chengdu, Kína) szerezték be. A HBMEC-ket a Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) a Biological Industries-től (Kibbutz Beit Haemek, Izrael) szereztük be. A penicillint/sztreptomicint és a Dulbecco-féle módosított sas táptalajt (DMEM) a Hyclone-tól (GA, Egyesült Államok) vásároltuk. A mitokondriális membránpotenciál (JC-1) tesztkészletet, a BCA fehérje tesztkészletet, a 2,7-diklorid-hidrofluoreszcein-diacetátot (DCFH-DA) és az NP40 lizátumot a Beyotime Biotechnology-tól vásároltuk. (Shanghai, Kína). A foszfatázkészítményt és a Complete proteáz inhibitort a Roche-tól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. Az Apoptosis Kit a BD Biosciences-től (Sparks, MD, Egyesült Államok) vásárolta. Malondialdehid (MDA), Szuperoxid-diszmutáz (SOD), Intercelluláris sejtadhéziós molekula-1 (ICAM-1), Vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 (VCAM{{10}} )enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) volt (Cambridge, Abcam a dfrom1"一Egyesült Királyságtól vásárolta meg). Antitestek a Nuclear Factor E{13}}kapcsolódó 2-es faktor ellen (Nrf2), Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), Az aktiváló transzkripciós faktor 6 (ATF6), glükóz által szabályozott fehérje 78 (GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, Egyesült Államok) vásároltuk. Torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-nyúl IgG-t a Jackson cégtől (Pennsylvania, Egyesült Államok). Az SDS-PAGE gyorsadagoló készletet és az ECL kromogén oldatot az EpiZyme Biotechnology-tól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. Sejtkultúra és -sérülési modell HBMECs 1 0% FBS-t és 1% penicillin-sztreptomicint tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük 37 °C-on, 5% CO2-tartalmú inkubátorban. A sejtkárosodás esetén a HBMEC-eket 12 órás hipoxiával, majd 8 órás újraoxigénezéssel kezelték, és a specifikus eljárások a következők voltak (Warpsinski et al., 2020): A HBMEC-eket először a szérummentes tápközeggel inkubáltuk hipoxiás inkubátorban (1 százalék). 0,5% CO,94% N) 12 órán át, majd a tápközeget 10% FBS-t tartalmazó normál táptalajra cseréltük, miközben normoxia inkubátorban (95% O2,5% CO2) 8 órán át inkubáltuk. Quercetin-kezelés 2 mg kvercetint 331 µl DMSO-ban oldottunk fel, hogy 1 mmol/L koncentrációjú törzsoldatot kapjunk, és -20 fokon tároljuk. A munkaoldatot 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 mmol/l-re hígítottuk DMEM-mel, amelyben a DMSO százalékos aránya 0,1% alatt volt. Miután a sejtek megtapadtak, kvercetint adtunk hozzá a szérummentes tápközeggel, majd a lemezeket a hipoxiás inkubátorba helyeztük. 12 óra elteltével a sejteket eltávolítottuk, szérum tápközeggel kvercetinre cseréltük, és 8 órára normoxia inkubátorba helyeztük.

Sejtéletképességi vizsgálat

A hatásokkvercetina HBMEC-ek életképességét a Cell Counting Kit{0}} segítségével vizsgáltuk a kezelési útmutató szerint. Először felmértük a kvercetin biztonságos dózisát a sejtek számára az endothelsejtek károsodása nélkül, majd megvizsgáltuk a sejtkárosodás esetén kifejtett védőhatását. Minden kísérleti eredményt legalább háromszor megismételtünk.

Scratch Healing and Tube Formation Assay A migrációs kísérleteket sejtkarcolásos módszerrel végeztük. A kvercetin kezelés előtt egyenes, merőleges vonalat húztunk a tenyésztőlemez aljára, és 0 órán keresztül lefényképeztük a felvételhez, majd a sejteket kvercetin- és modellezőkezelésnek vetették alá, mielőtt fényképeket készítettünk a rögzítéshez. Az elülső és a hátsó területeket kétszer kontrasztáltuk.

A sejt angiogén képességét utánzó tubusképződést a Matrigel (9-12mg/ml) a tenyésztő lemez aljára helyeztük, majd a tetejére kvercetinnel és modellezéssel kezelt sejteket szélesztettünk, majd 8 óra múlva képeket készítettem. A vérerek elágazó generációját elemeztük és összehasonlítottuk az ImageJ segítségével.

Mitokondriális membránpotenciálok és apoptózis vizsgálat

A sejt apoptózis kimutatására a mitokondriális membránpotenciál változást és az apoptózis készletet használtuk. A mitokondriális membránpotenciál változását a HBMEC-ek JC-1 fluoreszcens szondával történő festésével mutattuk ki. JC-1(1×) festő munkaoldatot adtunk hozzá, és 37 fokos inkubátorban 20 percig inkubáltuk, majd kétszer mostuk JC-1(1×) festőpufferrel, és végül hozzáadtuk mindegyik mérőhelyhez PBS-hez. . Ezután a nagy tartalmú sejtleképezőt használtuk az elemzéshez.

A HBMEC-eket összegyűjtöttük a 6-lyuklemezekről, centrifugáltuk a felülúszó eltávolítására, majd hozzáadtunk 1 × Annexin V kötőoldatot a sejtek fújásához és összekeveréséhez, majd FITC Annexin V festéket adtunk hozzá, hogy sötétben, szobahőmérsékleten inkubáljuk 10 percig. perc, adjunk hozzá propidium-jodid(PI) festőoldatot 5 perccel a gép előtt, és Beckman áramlási citométert alkalmaztunk a kimutatáshoz.

ELISA

Miután a sejteket H/R-rel vagy kvercetinnel kezeltük, a felülúszót összegyűjtöttük. Az ICAM-1, a VCAM-1, az SOD és az MDA észlelése ELSA készletekkel történt a kezelési útmutató szerint.

Reactive Oxygen Species (ROS) vizsgálat A ROS képződés képességét a DCFH-DA szondával detektáltuk, amelyet nagy tartalmú sejtleképezővel értékeltünk ki, majd ImageJ segítségével fluoreszcenciával elemeztünk. Western blottolás

A HBMEC-eket tenyésztőlemezekről gyűjtöttük össze, NP40 lizátumot tartalmazó foszfatáz készítményt és komplett proteáz inhibitort használtunk a fehérjék sejtekből való extrahálására. Meghatároztuk a fehérjetartalmat és 30 ug fehérjét vettünk az immunblot kísérletekhez. Az SDS-PAGE gélt elektroforézishez használtuk, 5% zsírmentes száraz tejjel blokkolva, miután elektrotranszfert PVDF membránra 1 órán át szobahőmérsékleten végeztük. Ezután anti-Nrf2(nyúl, 1:1,000),anti-Keapl(nyúl,1:1,000),anti-ATF6(nyúl,1:1,000 ), anti-GRP78(nyúl,1:1,000), anti-ZO-1(nyúl,1:1,000), anti-Claudin-5( nyúl, 1:1,000) antitesteket egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A másnapi mosás után hígított kecske anti-nyúl másodlagos antitesteket (IgG HRP, 1:10, 000) adtunk hozzá, és 1 órán át inkubáltuk. Végül a detektálást háromszori TBST-ben történő mosás után fejlesztettük ki.

Proteomikai elemzés

A HBMEC-eket kvercetin (l umol/L) jelenlétében H/R-rel kezeltük. Ezt követően a sejteket sejtkaparóval óvatosan lekapartuk a tenyésztőlemezről, mélyhűtött edényekbe gyűjtöttük, gyorsan folyékony nitrogénbe helyeztük, majd -80 fokon 5 percig tároltuk. A proteomikai elemzéshez iTRAQ technológiát alkalmaztunk. p-értékű fehérjék<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 ill<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Statisztikai analízis

Az adatokat a normál eloszlással illesztettük, és az adatok kifejezésére átlag ± szórást használtunk. A statisztikai elemzéshez GraphPad Prism 8-at használtunk. Két független mintát t-próbával elemeztünk, és a mérési adatokat átlag ± standard deviációval (SD) írtuk le. A csoportok közötti összehasonlítást egytényezős varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük. p-érték<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

EREDMÉNYEK

Eredmények

A kvercetin hatása a sejtek életképességére

A kvercetin sejtek életképességére gyakorolt ​​hatásának teszteléséhez először megvizsgáltuk a kvercetin biztonságos dózisát a sejteken, amint az az 1A. ábrán látható, amely nem volt hatással a sejtek életképességére a következő időpontban: 0.1-10 umol/L . Ezt követően az endothelsejt-károsodás alapján hatékony dózis kereséséhez kimutattuk, hogy a kvercetin 0.1-1 μmol/L-nél elősegítheti a sejtek életképességét H/R-HBMEC-ekben, amint az az ábrán látható. 1B. A későbbi kísérleteket ebben a koncentrációtartományban végeztük. Érdemes megjegyezni, hogy amikor a gyógyszerkoncentráció elérte a 10 μmol/L-t, citotoxicitás jelentkezett. Úgy gondoltuk, hogy amikor a HBMEC-eket H/R károsítja, a tolerancia csökken. Ezért, amikor a gyógyszerkoncentráció valamivel magasabb volt, a sejtek károsodása megnőtt. Ezért citotoxicitás fordult elő, ha a gyógyszer koncentrációja 10 μmol/L.

A kvercetin hatása a sejtmigrációra és az angiogenezisre

A kvercetinnek az endothel sejtek migrációs és angiogén képességére gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára a HBMEC-ket H/R kezelésnek vetettük alá, miközben kvercetint adagoltunk. A sejtmigrációs képesség tesztelésére karcolásos tesztet végeztünk, amely azt mutatta, hogy a H/R kezelés gyengítette a H/R-HBMEC-ek migrációs képességét a kontrollhoz képest, és a kvercetin jelentősen elősegítheti a sejtmigrációt 0 koncentrációban. .1-1 μmol/L. A tubulogenezist az in vitro angiogenezist utánozták, és az ág hossza az angiogén kapacitást képviseli. Az eredmények azt mutatták, hogy a H/R kezelés csökkent angiogén kapacitást eredményezett, de a kvercetin 0.1-1 μmol/L visszafordíthatja ezt a sérülést, amint azt a 2. ábra mutatja.

A kvercetin hatása a sejtapoptózisra

A kvercetin endoteliális sejt apoptózist gátló potenciáljának tesztelésére mitokondriális membránpotenciált és apoptózist használtunk az értékeléshez. Amikor a sejteket apoptotikus események miatt megsérültek, a mitokondriális membránpotenciál lecsökkent, a citoplazma vörös fluoreszcenciája jelentősen csökkent, a zöld fluoreszcencia megnőtt, és végül a vörös/zöld (R/G) színt alkalmazták a mitokondriális membránpotenciál megváltozásának jelzésére. csökkenni fog, ha a mitokondriális membránpotenciál sérül. Eredményeink azt mutatták, hogy a H/R kezelést követően a sejtek mitokondriális membránpotenciálja csökkent, amit a megnövekedett zöld fluoreszcencia jelez. A kvercetin növekvő dózisaival a vörös fluoreszcencia folyamatosan javult, ami azt jelzi, hogy a kvercetin dózisfüggően növelheti a mitokondriális membránpotenciált (3A, C ábra). Továbbá áramlási citometriát alkalmaztunk a sejt apoptózis közvetlen vizsgálatára. Az eredmények azt mutatták, hogy a HBMEC-ek fokozott apoptózist mutattak a H/R kezelés után, míg a kvercetin 0.1-1 umol/L-nél egyértelműen gátolja az apoptózist (3B, D ábra).

A kvercetin hatása a sejtadhézióra

Amint az endothelsejtek károsodnak, néhány adhéziós molekula, például ICAM{0}} és VCAM-1 termelődik, amelyek mérgező anyagokat adszorbeálnak a BBB-be, és károsítják az agy parenchymáját (Hauptmann et al, 2020). ).A kvercetinnek a H/R-HBMEC-ek adhéziós molekulákat termelő képességére kifejtett hatásának vizsgálatára ICAM-1 és VCAM-1 mérést végeztünk ELISA-val. Vizsgálatunkban a H/R az ICAM-1 és a VCAM-1 szintjének növekedését eredményezte, de a kvercetin hozzáadása 0.1-1 umol/L koncentráció alatt csökkentette ezt a hatást (ábra). 4).

A kvercetin gátolja az oxidatív stresszt

A kvercetin erős antioxidáns kapacitású flavonoid, ezért a ROS kimutatására DCFH-DA szondát alkalmaztunk. megfigyeltük

megnövekedett ROS-képződés a H/R hatásnak kitett HBMEC-ekben, amit a kvercetin kezelés jelentősen csökkent {{0}}.1-1 umol/L koncentrációnál Eközben az oxidatív stressz szintváltozásait észleltük. SOD és MDA termékek ELISA-val, és az eredmények azt mutatták, hogy a kvercetin 0.1-1 μmol/L koncentrációban képes volt csökkenteni az SOD-t és az MDA-t, amelyeket a H/R emelt, így jelezve, hogy a kvercetin csökkentheti a a HBMEC-ek oxidatív stressz okozta károsodása (5. ábra).

A kvercetin szabályozhatja a Keap1/Nrf2 és az ATF6/GRP78 fehérjéket

A kvercetin HBMEC-eken lévő védőmechanizmusának további feltárása érdekében elemeztük az expressziós szinteketoxidatív stresszés az endoplazmatikus retikulum stresszel kapcsolatos fehérjék. Ismert, hogy a Keap1/Nrf2 szabályozza az antioxidáns válaszokat in vivo. Az oxidatív stresszsérülés az endothel sejteket stresszreakcióra kényszeríti, ami megnövekedett Keapl/Nrf2 szintet eredményez (Warpsinski és mtsai, 2020). A jelen vizsgálatban a H/R a celluláris antioxidáns válaszmechanizmusok aktiválását és a Keapl és Nrf2 emelkedett szintjét eredményezte, amit tovább erősíthetett a 0.{7}} umol/L kvercetin a HBMEC-ek antioxidáns kapacitásának fokozása érdekében. Az .ATF6/GRP78 az egyik út, amely szabályozza az endoplazmatikus retikulum (ER) homeosztázist. Az ER-stressz súlyosbíthatja az endoteliális sejtkárosodást (Nie et al, 2020). Vizsgálatunkban az ER-stresszt a H/R aktiválta, és az ATF6 és GRP78 szintje emelkedett. A kvercetin l umol/L-ben képes volt jelentősen csökkenteni mindkettő fehérjeszintjét, gátolni az ER stresszt és megvédeni a HBMEC-eket a H/R sérüléstől (6. ábra).

A kvercetin képes megőrizni a BBB integritását

A BMEC-ek a BBB szerkezetének gerincét képezik, és a H/R sérülést követő haláluk vagy apoptózisuk befolyásolja a BBB integritását és funkcionalitását (Ding et al, 2019). Ebben a cikkben az endothel sejtek működését az expresszió változásainak kimutatása tükrözi. a BBB-hez kapcsolódó ZO-1 és Claudin-5 fehérjék. A kontrollcsoporthoz képest ZO-1 és Claudin-5 kifejezése

csökkent a H/R sérülés, ami azt jelzi, hogy a BBB sérült, és ezt a károsodást a kvercetin visszafordíthatja 0.5-1 μmol/L koncentrációban, ami azt jelzi, hogy a kvercetin képes fenntartani az endothelsejtek működését (7. ábra).

Proteomikai elemzés

A H/R sérült HBMEC-ek differenciális expressziós fehérjéinek (DEP) megtalálásához kvercetin jelenlétében vagy anélkül, ITRAO-t használtunk a proteomikai analízis elvégzésére. Fehérjék kiállító ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 ill<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

VITA

A CSVD, mint növekvő egészségügyi és társadalmi-gazdasági teher, gyorsan felkeltette a figyelmet. Meglepő módon azonban a CSVD patogenezise jelenleg homályos, és nincs egyértelmű kezelési séma sem. Tekintettel arra, hogy a CSVD későbbi szakaszai súlyos kimenetelűvé, például stroke-hoz és demenciához vezethetnek, a korai elváltozások kezelésének célzott kezelése hatékonyan késleltetheti a CSVD progresszióját (Cannistraro et al, 2019). Kimutatták, hogy a CSVD korai patológiás változásai az endothelsejtek diszfunkciójában rejlenek, és a diszfunkcióját stabilizáló gyógyszerek javíthatják az agyi fehérállomány sebezhetőségét CSVD-léziókban (Rajani et al, 2018). Tekintettel az endoteliális sejtek CSVD-ben betöltött szerepére, a hagyományos kínai orvoslás endothelsejtekre gyakorolt ​​védőhatásainak vizsgálatát tűztük ki célul HBMEC-ek segítségével.

A kvercetin egy flavonoid, amely számos növényben jelen van (Nawrot-Hadzik et al, 2019). Erős antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatása van, és védő hatást fejt ki különféle kóros állapotokban. Ebben a tanulmányban kimutattuk, hogy a kvercetin javíthatja a H/R sérülést, és számos kísérleti adat megerősíti azt a következtetésünket, hogy a kvercetin elősegítheti a sejtek életképességét, a sejtmigrációt, az angiogenezist, növelheti a mitokondriális membránpotenciált és gátolja az apoptózist.

Tekintettel arra, hogy a kvercetin erős antioxidáns hatással rendelkezik, megvizsgáltuk azt a mechanizmust, amellyel a kvercetin megvédi a HBMEC-eket az antioxidáció szempontjából. A ROS szintet jelentősen megnövelheti az oxidatív stressz (Wu et al., 2018), és a ROS felhalmozódása számos betegséget okozhat, beleértve a szív- és érrendszeri betegségeket, az endothel diszfunkciót és az öregedéssel összefüggő betegségeket, valamint a neurodegeneratív betegségeket (Chen et al, 2015; Jakaria és mtsai, 2018; Santos és mtsai, 2018). Ezenkívül oxidatív stressz lép fel a lipid-peroxidáció során, ami MDA-t termel, amely tönkreteszi a szervezet oxidatív antioxidáns egyensúlyát és növeli az endothelsejtek károsodását (Yang et al, 2021).

A Keapl/Nrf2-t jelenleg a legfontosabb ön-antioxidatív stressz-útvonalnak tekintik, és ennek az útvonalnak az aktiválása jelentősen javíthatja az endothelsejtek diszfunkcióját. A ROS különösen elősegíti az Nrf2 jelátviteli útvonal aktiválását (Selimoglu-Buet et al, 2017). Kimutattuk, hogy a kvercetin csökkentheti a ROS és az MDA képződését, miközben növeli a Keapl és Nrf2 fehérje expresszióját, ami arra utal, hogy a kvercetin gyengítheti az endothelsejtek sérülését azáltal, hogy csökkenti az oxidatív stresszválaszokat a Keapl/Nrf2 jelátviteli útvonal aktiválásával.

Nem csak, hogy a tartós ER-stressz aktiválja a kibontott fehérjeválaszt, és megváltoztatja az antioxidáns gének expresszióját, ami endotélsejt-apoptózishoz vezet (Tang et al, 2019). Ezen túlmenően, az oxidatív stressz a fehérje feltekeredésének zavarát is okozhatja az ER-ben, ER stresszt válthat ki, és súlyosbíthatja az endoteliális sejtkárosodást (Hetz, 2012). Az ER-stressz a következő három úton aktiválható: a PKR-szerű ER-kináz (PERK), az 1-es enzimet igénylő inozit (IRE1) és az aktiváló ATF-6, amelyek megvédik a sejteket az ER-stressztől homeosztatikus körülmények között (Hetz et al. ,2020). De ha külső káros ingerek befolyásolják, ez a három útvonal aktiválja az ER stresszválaszt és sejtapoptózist indukál. Ezenkívül a vizsgálatok kimutatták, hogy az ER stresszválasz gátlása visszafordíthatja a H/R által kiváltott endoteliális sejt diszfunkciót (Chen és mtsai, 2020). Vizsgálatunkban a kvercetin csökkentheti a H/R által okozott megnövekedett ATF6/GRP78 tartalmat, gátolhatja az endoplazmatikus retikulum stresszválaszát, és védi az endothel sejteket.

A BBB fő összetevőjeként az endothel sejtek funkciói közé tartozik integritásuk megőrzése. A BBB diszfunkciója folyadékok, fehérjék és egyéb plazmakomponensek szivárgását okozza a perivaszkuláris szövetekbe, tovább rontva az agyi értágulatot és a tápanyagszállítást (Wardlaw et al, 2019). Amikor az endothelsejtek megsérülnek, és a BBB integritása megsemmisül, így az endothelsejtek védelme tovább tudja fenntartani a BBB integritását. A Claudin-5 nagymértékben expresszálódik a BMEC-ekben, és részt vesz a szabályozáshoz szükséges szoros kapcsolódási láncok gerincének kialakításában. BBB permeabilitás (Yang et al, 2020). Az endothelsejtek az aktin citoszkeletonhoz horgonyozódnak olyan állványzatú fehérjékkel, mint a ZO-1, szoros kapcsolatokat hozva létre az endotélsejtek között, amelyek fenntartják a BBB feszességét (Zhang et al, 2020). Vizsgálatunkban a claudin-5 és a ZO-1 kifejezését használtuk a BBB integritásának reprezentálására. Eredményeink azt mutatták, hogy a claudin-5 és a ZO-1 fehérjeszintje csökkent a H/R sérülésnek kitett HBMEC-ekben, ami azt jelzi, hogy a BBB integritása megszakadt, és a kvercetin csökkentheti ezt a sérülést a claudin{{ 9}} és ZO 1 fehérjeszint.

Továbbá, hogy megtaláljuk a kvercetin lehetséges célpontjait a HBMEC-eken, az i-TRAQ-t sejtekbe jelöltük. A proteomikai analízist követően a leggyakoribb, differenciálisan expresszált fehérjék felső 20-át vizsgáltuk. Ezek közül az INSRR, DUSP3,

Az ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI endothelsejtekkel kapcsolatosak. Az INSRR-t tumor endoteliális markernek tekintik, és túlzott expressziója elősegítheti az angiogenezist (Nowak-Sliwinska et al, 2019). A rekombináns ANXA2 csökkentheti az endothel permeabilitását hipoxiás és gyulladásos faktorsérülési állapotokban, jelezve, hogy az ANXA2 részt vehet az endothelsejtek feszességének fenntartásában (Li et al, 2019). A humán cervicalis metszetek festése során a DUSP3 erős expresszióját találták az endothel sejtekben, és a kísérletek azt is kimutatták, hogy a DUSP3 szükséges az alapvető fibroblaszt növekedési faktor által kiváltott mikrovaszkuláris növekedéshez (Amand et al. 2014). Kimutatták, hogy az endothelsejtekben a HBAl expressziója szabályozza az érrendszeri tónust és funkciót (Sangwung et al., 2017). A PGK1-ről úgy gondolják, hogy csökkenti az atherogenezist is (Zhang és mtsai, 2020). Mi több, a VTN kritikus fontosságú a trombusképződés szempontjából érsérülés esetén (Bowley és mtsai, 2017). A GPI feldúsult a rheumatoid arthritises betegek ízületi szövetének mikrovaszkuláris endothel sejtjeiben hipoxiás környezetben, és szabályozza a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor szekrécióját a rheumatoid arthritis szinoviális fibroblasztjaiból, hogy angiogenezist indukáljon (Lu et al, 2017). A varicocele által közvetített meddőséghez kapcsolódó expresszált fehérjék kimutatták, hogy a Nrf2 az ANXA2 upstream szabályozója (Panner Selvam és mtsai, 2021). A PGK1 gátlása aktiválhatja a Keapl/Nrf2 útvonalat, és serkentheti a sejtvédő antioxidáns választ (Bollong et al, 2018). A két fehérje a kvercetin potenciális célpontja lehet a Keapl/Nrf2 útvonalon keresztül. További vizsgálatok igazolhatják e fehérjék szerepét a kvercetin H/R-HBMEC-ekre gyakorolt ​​hatásában.

Kétségtelen, hogy a kvercetin védő hatást fejthet ki az endotélsejtekre. A konkrét cselekvési célok azonban még további vizsgálatot igényelnek, és továbbra sem ismert, hogy vannak-e további cselekvési utak.

Összefoglalva, ez a tanulmány kimutatta, hogy a kvercetin az endothelsejtek védelmével fenntartotta a vér-agy gát integritását. Molekuláris szinten a kvercetin szerepet játszhat az endothelsejtek védelmében azáltal, hogy megvédi az oxidatív stresszt a Keapl/Nrf2 útvonalon keresztül, és gátolja az endoplazmatikus retikulum stresszt az ATF6/GRP78 útvonalon keresztül. Ez a tanulmány lefekteti a TCM alapjait a CSVD kezelésére az endothelsejtek védelmével.