Az ektoin bőrfehérítő hatása az MSH-stimulált melanogenezis elnyomásán és az antioxidáns Nrf2 útvonalak aktiválásán keresztül az UVA-besugárzott keratinocitákban

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1, Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 és Hsin-Ling Yang 8,*

Absztrakt:Az ultraibolya A (UVA) besugárzás által kiváltott reaktív oxigénfajták (ROS) túlzott termelést okozmelanogenezisa bőrsejtekben, ami pigmentációhoz vezet. Kimutattuk az Ectoine, egy természetes bakteriális ozmolit depigmentáló és anti-melanogén hatását UVA-sugárzással besugárzott humán (HaCaT) keratinocitákban, és feltártuk a mögöttes molekuláris mechanizmusokat. A HaCaT sejteket alacsony koncentrációjú ektoinnal (0,5–1,5 µM) előkezeltük, és különböző depigmentációs és anti-melanogén paramétereket vizsgáltunk. Ez az előkezelés jelentősen csökkentette a ROS-termelést, a -melanocita-stimuláló hormon (-MSH) termelődését és a proopiomelanocortin (POMC) expresszióját UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekben. Is,antioxidánshem oxigenáz-1 (HO-1), NAD(P)H-dehidrogenáz [kinon 1] (NQO-1) és -glutamát-cisztein ligáz katalitikus alegység (-GCLC) fehérje expressziója volt a nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2) nukleáris transzlokációja közvetítette, amelynek leütése valóban rontotta ezt a hatást, ami azNrf2 útvonal fontosságát jelzi. Az ektoin közvetítette az Nrf2 aktiválását a p38, a protein kináz B (más néven AKT), a protein kináz C (PKC) és a kazein kináz II protein kináz (CKII) útvonalakon keresztül. Az Ectoine előkezelt és UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekből nyert kondicionált tápközeg csökkentette atirozináz, tirozinázzal rokon fehérje-1 és -2 (TRP-1/-2), ciklikus AMP (c-AMP) protein kináz, c-AMPresponse elemkötő fehérje (CREB) ), valamint a mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor (MITF) expressziója, amely a melanoma B16F10 melanomasejtekhez vezet, amelyek gátolják a melaninszintézist. Érdekes módon ez az anti-melanogén hatás az -MSH-stimulált B16F10 sejtekben csak 50-400 µM ektoinkoncentrációnál volt megfigyelhető, ami az ektoinnal (0,5-1 µM) kezelt keratinocitezin bőr kulcsszerepét jelzi.fehérítéshatások. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az Ectoine hatékony, depigmentáló és anti-melanogén hatású helyi natúrkozmetikai szerként használható.

Kulcsszavak:ektoin; keratinociták;melanogenezis; tirozináz; -MSH; Nrf2

A Cistanche antioxidáns hatással rendelkezik.

1. Bemutatkozás

Ha az emberi bőrt UVA sugárzásnak teszik ki, az ROS képződést vált ki, és a bőrsejtekben túlzott melanintermelést is eredményez. A ROS ellenőrizetlen termelése melanoma állapotokhoz is vezethet. A legtöbb bőrfehérítő szer arra irányul és próbálja minimalizálni amelanogenezisfolyamat az -MSH gátlásán keresztül éstirozinázprodukciók [1]. A legtöbb bőrtónus világosító krém hidrokinonból [2] vagy hidrokortizonból [3] áll, amelyekről ismert, hogy csökkentik a melanin-butár képződését, és súlyos mellékhatásokkal is járnak. Például pattanások, hámló és viszkető bőr, a bőr kék és fekete elszíneződése, ochronosis, égő és szúró bőrirritáció, sőt gyulladás is.A bőr azonbanfehérítéstermészetes forrásokból származó szerek, például a Kojic sav (Penicillium és Aspergillus fajokból származó gombaszármazék) szintén „kontakt dermatitiszt” okoz érzékeny bőrű egyéneknél. Ezeknél az egyéneknél a kojsav több mint 1 százaléka súlyos túlérzékeny mellékhatásokat okozhat [4,5]. Ezért csak néhány természetes eredetű bőrfehérítéstermékeket (oleozin, édesgyökér kivonat, aszkorbinsav, szójafehérje, N-acetil-glükózamin stb.) jelenleg is használnak a kozmetikai iparban [6]. A főként a depigmentáló tulajdonságokat célzó bőrápoló termékek azonban időnként nem összpontosítottak az UVA-sugárzás által kiváltott ROS-termelés által közvetített túlzott mértékű káros hatások ellensúlyozására.melanogenezisbőrsejtekben.

Az ektoin egy „természetes extremolit”, amelyet stresszes körülmények között számos mikroorganizmusfaj termel [7,8]. Ezt a vegyületet először az egyiptomi sivatagban élő Ectothiorhodospira baktériumfajokból izolálták. Az ect operon gének kaszkádja (ectA, ectB, ectC vagy ectD) részt vesz ennek a vegyületnek a termelésében. Az ektoin kémiai elnevezése 1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidinkarbonsav [9]. Nedvességmegkötőként az ektoin segíti a bőrsejtmembrán szerkezetének átalakítását [10], védelmet nyújt az UV-károsodás és szennyezés ellen [11,12], hidratálja a bőrt [13], késlelteti a bőr idő előtti öregedését [14] stb. A bőr védő funkcióira az Ectoine hasznosnak bizonyult az atópiás dermatitisz [15], az Alzheimer-kór [16] kezelésében, valamint a HIV replikáció gátlásában [17], a radio- és kemoterápiában [18], valamint a májcirrhosisban. 19].Az ektoinról a feltételezések szerint depigmentáló és bőrfehérítő tulajdonságait nemkívánatos mellékhatások okozzák [20]. Ezzel szemben az Ectoine által kiváltott molekuláris mechanizmusok nem ismertek. Ezért ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy felvázolja az ektoin által közvetített depigmentációs és anti-melanogén mechanizmusokat, amelyek az UVA-sugárzással besugárzott humán (HaCaT) keratinocitákban, mint sejtmodellrendszerben váltanak ki. A HaCaT sejtekből a tenyésztő tápközegbe (kondicionált táptalajba) származó bőrvédő szerek ektoinnal indukált váladékának hatását szintén egy tipikus melanoma sejtvonalon (B16F10) vizsgáltuk.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Reagensek és antitestek

Az ektoint (termékszám: 81619, tisztaság 95 százalék vagy annál nagyobb) a Sigma-Aldrich-től (Taufkichen, Németország) vásároltuk. A magzati szarvasmarha szérumot (FBS), a penicillint/sztreptomicint, a Dulbecco-féle módosított Eagle's-médiumot (DMEM) és az l-glutamint az Invitrogen/Gibco BRL-től (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. Az l-DOPA, a melanin, a 3-4, a 5-dimetil-2-il-2, a 5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) és az -MSH-t a Sigma Chemical Co.-tól szereztük be. (St. Louis, MO, USA). Az N-acetilciszteint (NAC) és a 20,{13}}diklór-fluoreszcein-diacetátot (DCFH2-DA) a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A JNK-hoz (SP600125), ERK1/2-höz (PD98059), p38-hoz (SB203580), PKC-hez (GF109203X) és CKII-hez szükséges összes farmakológiai inhibitort a Calbiochemtől (La Jolla, CA, USA) szereztük be. A PI3K/AKT inhibitort (LY294002) szereztük be. a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA). Minden antitest a POMC, CREB, -actin,tirozináz, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, Kelch-szerű ECH-asszociált fehérje-1 (Keap-1) és TRP-1, TRP-2 a Santa Cruz Biotechnology Inc.-től (Heidelberg, Németország) szereztük be. A -GCLC és HO{10}} elleni antitesteket a Gene Tex Inc.-től (San Antonio, TX, USA) szereztük be. A c-AMP protein kináz és CKII elleni antitesteket az Abcam cégtől (Cambridge, MA, USA) szereztük be. A hisztonokat, MITF, p-p38, p38, p-AKT és AKT a Cell Signal Technology-tól (Beverly, MA, USA) szereztük be. A fokozott kemilumineszcenciás (ECL) detektáló reagenseket a Millipore-tól szereztük be (Billerica, MA, USA). Az összes többi reagenst (HPLC minőségű) vagy a Sigma-Aldrich-től vagy a Merck & Co., Inc.-től vásároltuk. (Darmstadt, Németország).

2.2. Sejtkultúra

Immortalizált humán bőrkeratinocita HaCaT és egér melanoma B16F10 sejteket szereztünk be a Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Németország) és az American Type Culture Collection-től (ATCC, VA, USA). A sejteket 10% hővel aktivált FBS-sel, 1% sztreptomicin/penicillinnel és 2 mM L-glutaminnal kiegészített DMEM-ben tenyésztettük 5% CO2-val kiegészített, párásított inkubátorban 37 °C-on.

2.3. Sejtkezelések és UVA-besugárzás

Az UVA besugárzás előtt a sejteket ektoinnal (0,5–1,5 µM 24 órán át) vagy hordozóval (PBS) előkezeltük. Az inkubáció után a PBS-sel mosott sejteket 3 J/cm2 UVA sugárzásnak tesszük ki (27 percig, λmax, 365 nm, 320 nm alatt nincs kimutatható emisszió) az UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec, Cambridge, Egyesült Királyság) [21].

2.4. Intracelluláris ROS vizsgálat

A HaCaT sejteket 1,5 × 105 sűrűségben beoltottuk egy 8-lyukú Lab Teck kamrába, amely DMEM-et tartalmazott, 10% FBS-sel kiegészítve, és 80% konfluenciáig növesztettük. Ezeket a sejteket először 1,5 µM ektoinnal kezeltük, majd az előírt ideig 3 J/cm2 UVA besugárzásnak tették ki. A sejteket PBS-sel mostuk, és a DCFH2-DA módszert alkalmaztuk az intracelluláris ROS-termelés meghatározására. az Olympus Software megoldásszoftver használatával minden feltételhez [21].

2.5. Melanin mennyiségi meghatározása

Egy 6-üregű lemezre rágcsáló melanoma B16F10 sejteket oltottunk be 2,5 × 105 sejt/lyuk sűrűségben. 100, 200 és 400 µM ektoinnal előkezeltük őket 2 órán keresztül -MSH hiányában vagy jelenlétében. (1 uM). A melanin mennyiségi meghatározására használt protokoll egy korábban leírt módszert követett [21]. A melanintartalmat ELISA mikrolemez-leolvasóval mértük, 470 nm abszorbanciahullámhosszal.

A cistanche gátolja a melanint.

2.7. Western Blot

HaCaT (1 × 106 sejt/10 cm-es csésze) vagy B16F10 (1 × 106 sejt/10 cm-es csésze) sejteket különböző koncentrációjú ektoinnal (0,5, 1 és 1,5 µM) vagy -MSH-val (1) előkezeltünk. µM), majd UVA hiányában vagy jelenlétében besugárzás követi az előírt ideig. A PBS-sel mosott sejteket összegyűjtöttük, a fehérjetartalmat (nukleáris és citoszolos) izoláltuk a kezelés után. Ezt követően a sejteket Western blot módszernek vetettük alá, amelyet korábban különféle nukleáris és citoszolikus fehérjék expressziójának meghatározására használtak [21].

2.8. RNS extrakció és RT-PCR

Az ektoinnal előkezelt (1,5 µM, 24 óra) HaCaT sejteket TRIzol reagensnek (Invitrogen, Carlsbad) vetettük alá a teljes RNS izolálására ezekből a sejtekből. 1 µg teljes RNS-t és a SuperScript-III One-Step RT-PCR platina Taq kit (Invitrogen, Carlsbad) által szállított reagenseket használtuk a PCR kísérletben a Bio-Rad iCycler PCR készülékkel (Bio-Rad, Hercules, CA, Egyesült Államok). A Nrf2-hez használt előre és fordított primerek a következők voltak: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. A GAPDH-hoz használt előre és fordított primerek a következők: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. A kísérlet végén a PCR-terméket 1%-os agarózgéllel elemeztük. Ezután etidium-bromid festéssel tettük láthatóvá. Belső kontrollként GAPDH-t használtunk [22].

2.9. Immunfluoreszcencia vizsgálat

A HaCaT sejteket 1 × 104 sejt/lyuk sűrűségben tenyésztettük DMEM-kiegészítőben 10% FBS-sel egy 8-lyukú Lab Tek kamrában (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). A sejteket 1,5 µM ektoinnal előkezeltük a jelzett ideig, majd UVA hiányában vagy jelenlétében besugárzást végeztünk. A sejteket immunfluoreszcens vizsgálatnak vetettük alá, amely a korábban leírt módszert alkalmazza [21].

2.10. Statisztikai analízis

A tanulmányban használt összes eredményhez az átlag ± standard deviációt (átlag ± SD) használtuk. Minden adatot varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztünk, majd Dunnett-teszt páronkénti összehasonlításra, és három átlag ± SD-ként adtuk meg. vagy több független kísérlet. A statisztikai szignifikancia értéke * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" a="" kezeletlen="" kontrollsejtekkel="" összehasonlítva,="" és="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" az="" uva-nak="" kitett="" hacat="" sejtekkel="" vagy="" -msh-val="" kezelt="" b16f10="" sejtekkel="">

3. Eredmények

3.1. Ektoin-gátolt UVA-indukált ROS-képződés HaCaT-sejtekben

Először teszteltük az Ectoine citotoxikus hatásait (1A ábra) UVA-besugárzott HaCaT-sejteken. MTT-adataink azt mutatták, hogy a kezeletlen kontrollsejtekkel összehasonlítva az Ectoine előkezelt (0,5–1,5 µM) és 3 J/cm2 UVA-nak kitett HaCaT sejtek nem tudták szignifikánsan csökkenteni a sejtek életképességét (1B. ábra). Továbbá, az ektoinos előkezelés dózisfüggő módon gyengítette az UVA (3 J/cm2) által kiváltott sejthalált (1B. ábra). A fluoreszcencia adataink mellett, amelyek azt mutatták, hogy a kontroll sejtekhez képest a 3 J/cm2 UVA besugárzás és az ektoin önmagában végzett kezelések (1,5 µM) szignifikánsan, 5- és 2--szeresére növelték a ROS szintet, illetőleg. Az Ectoine előkezelés esetében azonban a ROS szint jelentősen lecsökkent, és arra következtethetünk, hogy az EctoineantioxidánsUVA sugárzás elleni hatás. Ez a ROS alapszintjét is indukálja a HaCaT sejtekben (1C, D ábra).

3.2. Ektoin elnyomott POMC és -MSH expresszió UVA-besugárzott HaCaT sejtekben

Az UVA-nak kitett keratinocitákat stimulálták a ROS-p53 által közvetített POMC-re, valamint a POMC-ből származó kispeptid hormonra, az MSH-ra [23]. Ezért meghatároztuk az -MSH, POMC és más kapcsolódó fehérjék inexpressziós mintázatait az Ectoine-nal előkezelt HaCaT sejtekben, majd UVA-nak (3 J/cm2) tesszük ki őket. A Western blot adatok azt mutatták, hogy az UVA által kiváltott -MSH és POMC expressziók fokozódását az ektoinos előkezelés csökkentette; mivel az UVA-besugárzás nélküli Ectoine-kezelés teljesen gátolta a nem besugárzott HaCaT-sejtek -MSH- és POMC-expresszióját (2A. ábra). Később teszteltük az Ectoine előkezelt és UVA-val besugárzott HaCaT sejtekből nyert „kondicionált közeg” (10 ml/100 mm-es lemez) hatását amelanogenezisA B16F10 melanoma sejtek. A 2B. ábrán ez a kondicionált közeg lefelé szabályozva láthatótirozináz, TRP-1, TRP-2, c-AMP protein kináz, p-CREB, CREB és MITF szintek a B16F10 sejtekben.

3.3. Az ektoin csökkentette a melanin és a tirozináz expresszióját az MSH-stimulált B16F10 sejtekben

A B16F10 melanoma sejteket először magasabb koncentrációjú Ectoine-nak vetettük alá, és a citotoxicitás hatását MTT assay segítségével határoztuk meg. A 3A. ábra azt mutatja, hogy az Ectoine nem volt szignifikáns hatással a B16F10 sejtek életképességére magasabb koncentrációkban (100-400 μM 72 órán keresztül). A sejtek életképessége azonban nem változott az Ectoine kezelés 24. és 48. órájában (az adatokat nem mutatjuk be). Ezért ezeket a koncentrációkat használták az Ectoine -MSH-stimulált hatásának meghatározásáramelanogenezisB16F10 sejtekben. A melanin mennyiségi meghatározására vonatkozó adatok azt mutatták, hogy a kontroll sejtekhez képest a -MSH-val (1 μM) önmagában végzett kezelés jelentősen, több mint 25 százalékkal növelte a melaninszintet. Az egyedüli -MSH-kezeléshez képest azonban a növekvő ektoinkoncentrációnak (100-400 μM 72 órával) kitett sejtek dózisfüggően, és jelentősen csökkentették a melanintartalom százalékos arányát, és a maximális leszabályozás csak 85 százalék volt (vagy -15 százalékos, mint a kezeletleneknél). kontroll) 400 μM ektoinos előkezelésnél figyelték meg (3B. ábra). Ezenkívül Western blot adataink azt is mutatták, hogy az -MSH stimulálttirozináz(24 óra) és p-CREB (2 óra) expressziója szignifikánsan lecsökkent az Ectoine előkezelések növekvő koncentrációjával ezekben a melanomasejtekben (3C. ábra).

3.4. Az ektoin fokozta a HO-1, NQO-1 és -GCLC fehérjék expresszióját a HaCaT sejtekben

Az idő hatásának a Nrf2 ektoin által közvetített nukleáris transzlokációjára és a HO-1, NQO-1 és -GCLC fehérjék ezt követő downstream expressziójára való hatásának meghatározására a HaCaT sejteket 1,5 µM ektoinnal kezeltük, és a sejtfehérjéket összegyűjtöttük. 0.5, 1, 2, 4, 8 vagy 12 órával az Ectoine-kezelés után. A Western blot adatok azt mutatták, hogy a -GCLC fehérje kivételével 1,5 µM ektoin okozta a HO-1, Nrf2 és NQO-1 fehérjék maximális expresszióját a 4 órás időpontban. -GCLC-t egy 8 órás időpontban mutattunk be (5A. ábra). Az időgörbéből nyert adatok arra késztetnek bennünket, hogy teszteljük az ektoinkoncentráció hatását a expressziójáraantioxidánsfehérjéket 4 órás időpontban. Az 5B. ábra azt mutatja, hogy mindhárom antioxidáns fehérje maximális expressziót mutatott 1,5 µM Ectoine koncentrációnál. Később az Ectoine előkezelés hatásait tesztelték a Nrf2 és a Keap-1 arány expressziójára az UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekben. A nyugati adatok elemzése azt mutatta, hogy az 1,5 µM ektoinnal végzett előkezelés a Nrf2/Keap-1 arányának növekedését mutatta UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekben (5C. ábra). Konzisztens adatokat láttunk az NQO fokozott expressziójával kapcsolatban is. -1, HO-1 és -GCLC fehérjék ektoinnal előkezelt HaCaT sejtekben, amelyeket 3 J/cm2 UVA-val sugároztak be (5D. ábra). Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy az ektoinos előkezelés védő szerepet játszik az UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekben.

3.5. Különféle jelátviteli útvonalak vettek részt az Nrf2 aktiválásában ektoinnal kezelt HaCaT sejtekben

Meghatároztuk a Nrf2 ektoin által közvetített nukleáris transzlokációjában részt vevő jelátviteli útvonalakat. A HaCaT sejteket PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS és CKII jelátviteli utak farmakológiai inhibitoraival előkezeltük, majd 1,5 μM Ectoine-nal. A nukleáris Nrf2 Western blot adatai azt mutatták, hogy a p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC és CKII útvonalak részt vesznek ebben a mechanizmusban (6A. ábra). A kapott információkból meghatároztuk az Ectoine előkezelés hatását ezen utak szerepére az antioxidáns fehérjék expressziójában. A 6B. ábra azt mutatja, hogy a MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII és PKC útvonalak farmakológiai gátlása csökkentette az NQO-1, HO-1 és -GCLC expresszióját.antioxidánsfehérjék a HaCaT sejtekben. Ezenkívül az AKT, p38 foszforilációjához, valamint a PKC és CKII expressziójához szükséges idő az ektoinnak való kitettség során azt jelzi, hogy a p-AKT kivételével a p38 foszforilációja, valamint a PKC és CKII expressziója a későbbiekben ment végbe. csak időpontok (30 perc elteltével) (6C. ábra). Az AKT esetében a foszforilációt a 15 perces időponttól figyelték meg, amely 30 percnél érte el a csúcsot (6C. ábra). Az AKT esetében a foszforilációt a 15 perces időponttól figyelték meg, amely 30 percnél érte el a csúcsot (6C. ábra). Ezek az összesített eredmények arra utalnak, hogy a p38, AKT, PKC és CKII jelátviteli útvonalak aktiválták az antioxidánsok ektoin által közvetített nukleáris transzlokációját. Nrf2, ami antioxidáns fehérjék expressziójához vezet.

3.6. Az ektoin által közvetített anti-melanogén hatást elnyomták a Nrf2 leütése miatt

Az Nrf2 szerepe az ektoin által közvetített anti-melanogenezisa Nrf2 elnémításával határoztuk meg a HaCaT sejtekben. A Western blot adatai azt mutatták, hogy az 1,5 μM ektoinnak kitett Nrf2 knockdown sejtek minimális NQO-1, HO-1 és -GCLC expressziót mutattak.antioxidánsfehérjéket (7A. ábra). Később megvizsgáltuk a Nrf2 knockdown hatását az -MSH-szintek expressziójára UVA besugárzott (3 J/cm2) HaCaT sejtekben. A Western-blot-eredmények azt mutatták, hogy az siRNS-sel transzfektált sejtek kontrollálásához az UVA-besugárzás jelentős szerepet játszott az -MSH-szintek expressziójának fokozásában olyan sejtekben, amelyek nem voltak kitéve ektoinnak (7B. ábra). Az 1,5 μM Ectoine azonban elnyomta ezt a hatást. A másik esetben az siNrf2-vel transzfektált sejtek a -MSH-szintek expressziójának csökkenését mutatták mind a kezeletlen, mind a kezelt sejtekben (7B. ábra). Az -MSH adatokhoz hasonlóan fluoreszcencia adataink is azt mutatták, hogy az UVA besugárzás jelentősen megnövelte a ROS termelést az Ectoine-nal kezeletlen kontroll siRNS sejtekben (7C, D ábra). Ez a hatás azonban szignifikánsan elnyomta, ha a sejteket 1,5 µM ektoinnak tették ki. Másrészt a Nrf2-vel transzfektált és UVA-sugárzással besugárzott HaCaT-sejtek körülbelül 8--szeres növekedést mutattak a ROS-szintben azokhoz a Nrf2-vel transzfektált sejtekhez képest, amelyeket nem sugároztak be UVA-val, de ektoinkezelésnek voltak kitéve (7C., D. ábra). Mindezek az adatok azt jelzik, hogy a Nrf2 ektoin által közvetített védő szerepet játszik az UVA-sugárzással besugárzott HaCaT-sejtek melanintermelésének minimalizálásában. Antioxidánsok 2020, 9, x PEER REVIEW. . Mindezek az adatok azt jelzik, hogy az Nrf2 ektoin által közvetített védő szerepet játszik az UVA-besugárzott HaCaT sejtekben a melanintermelés minimalizálásában.

cistanche előnye: fehérítő bőr

4. Megbeszélés

Különféle bőr-fehérítésszerek használatosak a kozmetikai iparban. Ezen szerek közül sok kémiai eredetű, és különböző mellékhatások, köztük rákos megbetegedések okozásának korlátaitól szenved [24–26]. Ezért a biztonságos és természetes bőrfehérítő szerek azonosítása az óra szükséglete. Az ektoint (1A. ábra) arckrémek és egyéb kozmetikai szerek hatóanyagaként használják. Ez bőrhidratáló szerként működik, és késlelteti a bőr korai öregedését is [27]. Szinte az összes ismert bőrfehérítő szer a leszabályozást célozza megtirozinázUV-besugárzott sejtekben az enzimaktivitás csökkenti amelanogenezisbőrsejtekben.Yao et al. bemutatta afehérítésA bioszintetizált ektoin tulajdonságait, és azt javasolták, hogy ez egy feltételezett fehérítőszer. Vizsgálatuk során az Ectoine magas koncentrációját (500 µM) tesztelték fehérítő hatása miatt egér melanóma (B16F0) és humán melanoma (A2058) sejtvonalakon, és arra a következtetésre jutottak, hogy az Ectoine biztonságos és potenciális szer kozmetikai és klinikai alkalmazásra [20]. Ebben a tanulmányban azonban tovább teszteltük az alacsony koncentrációjú ektoin (0,5–1,5 µM) jótékony hatását UVA-besugárzott HaCaT-sejtekre, és megfejtettük a mögöttes molekuláris mechanizmusokat. Vizsgálatunkban kimutattuk, hogy az Ectoine a Nrf2/ARE útvonalon keresztül nemcsak az antioxidáns génexpressziót váltotta ki, hanem az UVA-besugárzott HaCaT-sejtek -MSH-szintjét is csökkentette a POMC elnyomása révén. Az -MSH-szint csökkenése korrelált a tirozináz enzim aktivitásának csökkenésével, ami a melanintermelés csökkenéséhez vezetett. Tudomásunk szerint ez az első jelentés, amelyet az Ectoine által UVA-besugárzott HaCaT sejtekben kiváltott mechanizmus igazolt. Ez a tanulmány felvázolta azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyeket az Ectoine mutat ki HaCaT sejtekben, mint sejtmodellrendszerben.

Először meghatároztuk az Ectoine szubletális koncentrációját, valamint az UVA sugárzás hatását a HaCaT sejtek életképességére. MTT-adataink azt mutatták, hogy az ektoin alacsony koncentrációja (0,5–1,5 µM) nem volt jelentős hatással a HaCaT sejtek életképességére (1B. ábra). Az ektoinos előkezelés növelte a 3 J/cm2 UVA-besugárzott HaCaT sejtek életképességét (1B. ábra). Ezen megfigyelések alapján folytattuk további kísérleteinket 1,5 µM Ectoine előkezeléssel és UVA besugárzással 3 J/cm2 dózisban.

Az UVA besugárzás által kiváltott ROS termelés a bőr keratinocitáiban jól ismert tény [28]. Ezért azt is teszteltük, hogy az Ectoine előkezelésnek milyen jótékony hatásai vannak az UVA-sugárzás által kiváltott ROS termelésben HaCaT sejtekben. DCF-fluoreszcencia intenzitási adataink azt mutatták, hogy az 1,5 µM ektoinnal végzett előkezelés jelentősen csökkentette az UVA sugárzás által kiváltott ROS termelő inkeratinociták mennyiségét. Az is megfigyelhető volt, hogy 1,5 µM Ectoine a HaCaT sejtekben a ROS-szintek alapszintű növekedését okozhatja, amely statisztikailag szignifikánsnak bizonyult (1D, E ábra).

Rousseau et al. beszámolt arról, hogy a POMC-t a humán epidermális keratinociták és a melanociták választják ki, és stimuláljákmelanogenezis[29]. Ezt szem előtt tartva teszteltük az UVA besugárzás és az ektoin előkezelések hatását a melanogenezishez kapcsolódó fehérjékre HaCaT sejtekben. Western blot adataink azt mutatták, hogy UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekben az -MSH és POMC fehérjék expressziójának dózisfüggő lelassulását az Ectoine-nal végzett előkezelés okozta. Ezzel szemben az ektoinos előkezelés eltérő hatással van a sejtek expressziós mintázatára.melanogenezis-asszociált fehérjék. Nevezetesen, szinte minden tesztelt fehérje (Tirozináz, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkináz, CREB és MITF) csökkent expressziót mutattak az Ectoine előkezelés növekvő koncentrációjával UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekben (2A, B ábra). Ezek az adatok azt a tényt jelzik, hogy az Ectoine anti-melanogén tulajdonságokkal rendelkezik az UVA-besugárzott HaCaT sejtekben.

Az Ectoine anti-melanogén hatékonyságát tovább tesztelték B16F10 sejtekben, egy jól ismert melanoma sejtvonalonmelanogenezistanulmányok [30]. Vizsgálatunk egyik figyelemre méltó megfigyelése az volt, hogy a HaCaT sejtekkel ellentétben magas ektoinkoncentrációra (100-400 µM) volt szükség a melaninszintézis elnyomásához az -MSH-stimulált B16F10 sejtekben (3B. ábra). Western blot adataink azt mutatták, hogy az Ectoine dózisfüggően csökkentette a expressziójáttirozinázés p-CREB proteinek -MSH-stimulált B16F10 sejtekben, ami a fent említett hatáshoz vezet (3C. ábra). Ezért azt is megvizsgáltuk, hogy ezek a magas ektoinkoncentrációk befolyásolhatják-e a B16F10 sejtek életképességét. MTT-eredményeink azt mutatták, hogy az ektoin magas koncentrációja (100-400 µM) nem volt hatással a B16F10 sejtek életképességére (3A. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a keratinociták kulcsszerepet játszanak az ektoin által közvetített anti-melanogenezisés depigmentáló hatások.

A Nrf2 transzkripciós faktor szerepe a bőrsejtek anyagcseréjében jól dokumentált [31]. Ezért tovább teszteltük a Nrf2/Keap-1 útvonal által játszott mechanizmusokat a keratinociták Ectoine által közvetített hatásaiban. A 4A. ábra azt mutatja, hogy az Ectoine dózisfüggően és szignifikánsan megnövelte az Nrf2/Keap{7}} arányt, maximális hatás mellett 1,5 µM ektoinkoncentrációnál volt megfigyelhető. Azt is megfigyelték, hogy az 1,5 µM ektoin kedvezett a Nrf2 fehérje nukleáris transzlokációjának, a nukleáris fehérje frakcióból a 2 órás időpontban megfigyelt Nrf2 maximális expressziójával (4B. ábra). A HaCaT sejtek immunfluoreszcens festéséből nyert adatok is alátámasztják ezt a hatást (4D. ábra).

Humán melanocitákban és keratinocitákban Marrot et al. és mások megmagyarázták az Nrf2 védekező útvonal jelentőségét a fotooxidatív stresszválaszokban [32]. Vizsgáltuk az ektoinközvetített antioxidáns fehérje expresszió hatását is HaCaT sejtekben. Időgörbe adataink azt mutatták, hogy mindhárom antioxidáns fehérje (HO-1, NQO-1, -GCLC) és Nrf2 ektoinközvetített expressziója kétfázisú módon fejeződik ki az idő növekedésével ({{ 8}},5–12 óra) megfigyelhető hatással 4 órás időpontban (5A. ábra). Ebből egy koncentrációgörbe, amely az ektoinkoncentráció hatását méri aantioxidánsA fehérje expresszióját szintén 4 órás időpontban határoztuk meg. Az 5B. ábra azt mutatja, hogy a kezeletlen sejtekhez képest az Ectoine kezelés dózisfüggően növelte a HO-1, NQO-1, -GCLC fehérjék expresszióját. Megmértük azt is, hogy az ektoin-koncentráció hogyan fejtett ki védő hatást az UVA sugárzásnak kitett HaCaT sejtekben. A Western blot adatok azt mutatták, hogy az Ectoine dózisfüggően növelte az antioxidáns fehérjék expresszióját, és drámai mértékben megnőtt a Nrf2/Keap-1 arányban is (5C, D ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az ektoin előkezelés (1,5 µM, 4 óra) potenciálisan képes antioxidáns fehérje expressziót indukálni a HaCaT sejtekben, ami ellensúlyozhatja az UVA expozíció által okozott káros hatásokat.

antioxidáns cistanche

5. Következtetések

A fenti adatokból arra a következtetésre jutottunk, hogy az ektoin alacsony koncentrációja (0,5–1,5 µM) csökkentheti az -MSH- és a melanintermelést a POMC és a POMC elnyomása révén.tirozinázpathwayin UVA besugárzott HaCaT sejtek, jelezve annak anti-melanogenezishatékonyság. Ezenkívül az Ectoine részt vett a HaCaT sejtekben az intracelluláris ROS termelés elnyomásában is. A HaCaT sejtekkel ellentétben az ektoin magas koncentrációja (50-400 µM) hasonló hatást tudott mutatni a B16F10 melanomasejtekben, ami azt jelzi, hogy a keratinociták kulcsszerepet játszhatnak az ektoin által közvetített anti-melanogenezisés bőr-fehérítéshatása a bőrsejtekre. A legfontosabb, hogy az ektoin által közvetített jótékony hatások az Nrf2 útvonal aktiválásán keresztül, amely indukálja aantioxidánsfehérjék HO-1, NQO-1 és -GCLC. Kimutatták, hogy az AKT az első jelátviteli útvonal, amely elindítja az Nrf2 aktiválását, amelyet a többi útvonal (p38, PKC és CKII) követ. Végül, az Nrf2 elhallgatása közvetlenül bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy az Nrf2 kulcsszerepet játszik az intracelluláris ROS, valamint az -MSH termelés szabályozásában. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az Ectoine fő fehérítő mechanizmusát a ROS-p53/POMC{10}}MSH út gátlása indokolja UVA-sugárzással besugárzott HaCaT sejtekben. Ezért az Ectoine vagy származékai a hidratáló krémek és lotionok hatóanyaga lehet. amelyeket potenciális és természetes alapú bőrként használnakfehérítésszerek a kozmetikai iparban.

antioxidáns citanche-kiegészítő