Az adenovírus-kapszidok bejegyzés utáni szortírozásának megértése; Esély a vakcina vektor tulajdonságainak megváltoztatására 1. rész

Absztrakt:

Az adenovírus-vektor-alapú genetikai vakcinák hatékony stratégiaként jelentek meg a SARS-CoV{2}} egészségügyi válsággal szemben. Ez a siker nem váratlan, mert az adenovírusok a genetikai vakcinák számos kívánatos tulajdonságát egyesítik. Erősen immunogének, alacsony és jól jellemzett patogén profillal rendelkeznek, technológiai megközelíthetőség mellett. Az adenovírus-vakcina vektorok javítására irányuló folyamatos erőfeszítések közé tartozik a ritka szerotípusok és nem humán adenovírusok alkalmazása. Ebben az áttekintésben a vírus kapszidjára összpontosítunk, és arra, hogy a genotípusok megválasztása hogyan befolyásolja a felvételt és az azt követő szubcelluláris válogatást. Leírjuk, hogy a kapszid tulajdonságok, például a bejutási folyamat során fennálló stabilitás megértése hogyan változtathatja meg a belépő részecskék sorsát, és ez hogyan változtatja meg az immunitás kimenetelét. Részletesen megvitatjuk, hogy a membrán lítikus kapszid fehérje VI mutációja hogyan befolyásolja a C faj vírusainak belépés utáni válogatását, és röviden megvitatjuk, hogy ezek a megközelítések szélesebb körű hatással lehetnek-e a vakcina és/vagy vektor fejlesztésére.

Kattintson a pure cistanchetermék

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Bemutatkozás

A vírusfertőzések, ellentétben az antibiotikumokkal kezelhető bakteriális fertőzésekkel, továbbra is veszélyt jelentenek az egészségre, mivel nagyon kevés vírusellenes gyógymód létezik. Ezért a vakcinázás az egyetlen széles körben alkalmazható stratégia az emberi (és állati) populációk vírusfertőzések elleni védelmére.

Egészen a közelmúltig a vírusfertőzések elleni védőoltást főként a gyermekkori betegségek megelőzésének összefüggésében, vagy az influenzafertőzés megelőzésének éves "influenza" elleni oltásának tekintették. A SARS-CoV{1}} egészségügyi válság 2020-as kitörésével a védőoltás ismét a közfigyelem középpontjába került, mivel ma már ez az egyetlen fenntartható kiút a járványból. Ebben az összefüggésben az adenovírus (Ad) vektor alapú vakcinák a két fő sikeres vakcinázási stratégia egyikeként jelentek meg. A sürgősségi jóváhagyást követően a Föld lakosságának nagy hányadába Ad vakcinákat fecskendeznek be, annak érdekében, hogy a SARS-CoV elleni planetáris immunitást megteremtsék.{5}}.

Az adenovírus vektor vakcinákat a COVID{0}} kitörése előtt nem használták széles körben, de sikerük nem váratlan. A vírusok általában nagyon alkalmas vakcinaplatformok. Biológiailag optimalizáltak és nukleinsavtranszportra adaptáltak, és immunválaszokat váltanak ki. Az adenovírusok számos olyan tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek miatt különösen ideális vakcinajelöltek. Alacsony és jól jellemzett patogén profillal rendelkeznek, magas fertőzőképességgel párosulnak. Technológiailag megközelíthetőek, és széles körben alkalmazták vektorizálásra. Magas termelési hozamuk és stabilitásuk lehetővé teszi az ipari termelést a jó gyártási gyakorlat (GMP) körülményei között, és praktikus jellemzőket (azaz tárolást) biztosítanak a regionális elosztáshoz, csökkentett költséggel [1]. Ezenkívül az Ad-sejtek antigénprezentáló sejtekbe történő bejuttatása hatékony, és természetesen veleszületett immunválaszt váltanak ki, amely adjuvánsként működik az oltás sikerének fokozásában [2,3].

A reklámbiológia megértése kulcsfontosságú volt az Ad-alapú (vakcina) vektorok fejlesztésében. Például a nem humán vagy ritka Ad szerotípusok használatát egyes jelenleg forgalomba hozott SARS-CoV-2 vakcinákban szándékosan választották ki, hogy megakadályozzák, hogy a már meglévő vektorimmunitás csökkentse a vakcina hatékonyságát. A vírusgén-deletált vektorok alkalmazása nagyobb vektorbiztonságot biztosít. A vírus életciklusának azonban még mindig sok olyan aspektusa van, amelyet nem vettek figyelembe az Ad-alapú vakcinavektorok kifejlesztésekor, és a ritka vagy nem humán genotípusokkal kapcsolatos ismeretek korlátozottak, beleértve a jelenleg SARS-CoV{8}} vakcinaként használtakat is. . Ezzel az áttekintéssel szeretnénk felhívni a figyelmet azokra a potenciális módosításokra, amelyek kihasználhatók a reklámvektorok gyógyászati ​​célú fejlesztése során, beleértve a vakcinázást is.

A vírus kapszidjára összpontosítunk, és arra, hogy a genotípusok megválasztása hogyan befolyásolja a felvételt és az azt követő szubcelluláris válogatást. Leírjuk, hogy a kapszid tulajdonságok, például a stabilitás megértése a belépési folyamat során hogyan változtathatja meg a belépő részecskék sorsát, és milyen eltérő immunitási eredményeket figyelhetünk meg. Példaként arra, hogyan változtatható meg a kapszid stabilitása és sorsa, részletesen tárgyaljuk, hogy a membrán litikus kapszidfehérje VI mutációja hogyan hat a C fajú vírusokra. Végül röviden megvitatjuk, hogy az ilyen megközelítések kiaknázhatók-e vakcinák és/vagy vektorok fejlesztésére.

1.1. Az adenovírusok a fertőző kórokozók sokféle családját alkotják

Történelmileg az Ad-ot először 1953-ban izolálták légúti fertőzésben szenvedő betegek adenoidjaiból [4], majd nem sokkal ezután az „adenovírus” kifejezést általánosan elfogadták [5]. Az Adenoviridae családnak több mint 120 tagja van, öt nemzetségre osztva – attól függően, hogy emlősöket (pl. Mastadenoviridae), madarakat (pl. Aviadenoviridae), hüllőket (pl. Atadenoviridae), kétéltűeket (Siadenoviridae) vagy halakat (Ichtadenoviridae) fertőznek-e meg. ) [6,7]. A Mastadenoviridae nemzetség több mint 70 típusú emberi Ads-t is tartalmaz [8,9], amelyeket hét fajba (A–G) sorolnak be morfológiai, biológiai és fizikai-kémiai tulajdonságaik szerint, az 1. táblázat szerint [10, 11].

Ezenkívül az Ads spontán rekombinációt is végezhet, ezáltal új fajokat hozva létre [12], mint az AdE4 esetében, amely az egyetlen emberi E faj vírusa, és valószínűleg a B emberi faj és egy majom Ad rekombinációjából származott [13]. ]. Bár a nem emberi Ads-ok által okozott emberi fertőzések természetesen ritkák, nem lehetetlenek [14,15]. A különféle nem emberi hirdetések emberi sejtek megfertőzésére (vagy transzdukálására) való képessége vonzó (vakcina) vektorplatformokká teszi őket. Ezek közé tartoznak a csimpánzokból [16–18], gorillákból [19], juhokból [20], tehenekből [21], kutyákból [21, 22] vagy az új világ majmából [23] származó hirdetések.

Az adenovírusfertőzések sejt- vagy szöveti tropizmusuktól függően különböző kórképeket okozhatnak, beleértve a légúti, szem-, húgyúti vagy gyomor-bélrendszeri betegségeket (lásd 1. táblázat). A szöveti tropizmus gyakran annak az eredménye, hogy a különböző reklámok különböző receptorokat használnak, és összefügghet a belső részecskék stabilitásával is [24]. A legtöbb Ads fertőzés enyhe vagy tünetmentes immunkompetens gazdaszervezetben. Az elsődleges Ad fertőzések többnyire gyermekkorban fordulnak elő, és erős védő immunitást eredményeznek. Ezzel szemben immunszupprimált egyéneknél az Ads ellenőrizetlen, súlyos és életveszélyes szisztémás fertőzéseket okozhat, amelyek súlyos sejttoxicitáshoz vezetnek, ami túlzott gyulladáshoz és többszörös szervi elégtelenséghez vezethet, ami magas mortalitást okoz [12].

A legjobban tanulmányozott humán hirdetések a C típusú 2-es és 5-ös típusú vírusok, amelyek túlnyomórészt felső légúti és gasztrointesztinális fertőzésekben szenvedő betegeknél fordulnak elő [25], és amelyekre jelen áttekintés fő fókusza lesz. Az adenovírusok felelősek lehetnek alkalmankénti járványkitörésekért, mint például a B fajú vírusok, amelyek tüdőgyulladást okoznak (pl. Ad3, 7 és 14) immunkompetens egyéneknél [26] vagy az F faj Ad40/41 és az A faj Ad12, 18 és 31 vírusai. , amelyek megfertőzik a gyomor-bélrendszert (lásd [26,27]). A D fajú vírusok nagyon változatos csoportot alkotnak, hajlamosak a rekombinációra, és a szemfertőzések vezető okozói [28].

1.2. Az adenovírus-kapszidok metastabil struktúrák

Sokféleségük ellenére minden hirdetés hasonló szerkezeti és szervezeti keretet követ. Az adenovírusok burok nélküli DNS-vírusok, amelyek viszonylag nagy, 26–45 kb-os lineáris kétszálú DNS-genomot tartalmaznak [29–31]. A kapszid ~70-90 nm átmérőjű, ikozaéder formájú, 20 fazettával és 12 csúcsával [32]. A kapszid három fő szerkezeti fehérjéből (hexon, penton és rost) és számos kisebb cementfehérjéből áll (pl. IIIa, VI, VIII és IX a C típusú vírusokban), amelyek stabilizálják a szerkezetet. Számos Ad kapszid nagy felbontású szerkezetét krioelektronmikroszkóppal és röntgenkrisztallográfiával határozták meg [24,33–36]. Az ikozaéderes kapszid pszeudo-T25 szerkezettel rendelkezik, amely 720 exont tartalmaz különböző trimerekben, attól függően, hogy a kapszidban hol helyezkednek el. A kapszid 20 oldala kilenc összeállított exonból áll (úgynevezett GON a kilences csoporthoz), míg a 12 csúcsnál az exonok GOS-ben (a hat csoporthoz) állnak össze (további részletekért lásd [37,38] ). A pentamer penton alap a 12 csúcsba van beillesztve, és a kiálló trimerszál alapjául szolgál [39,40]. A fő és kisebb kapszidfehérjék közötti kölcsönhatás stabilizálja a kapszidot, főként a hatszögekkel való kölcsönhatás révén.

Például a GON-t IX stabilizálja [41]; A IX-et és a IIIa-t magukat a VIII-val való kölcsönhatás stabilizálja, ami összekapcsolja őket a GOS-szal, illetve a GON-nal [37]. A VIII-as molekulák körvonalazzák a GON-t, és segítenek stabilizálni a hatszögeket a kapszid belsejében. A Protein VI a hexont is stabilizálja azáltal, hogy megköti a hexontrimer központi üregét, amely a vírus belső lumenének van kitéve [42–44].

A kapszid körülveszi és védi a vírusgenomból álló vírusmagot, a vírusmag fehérjéket (azaz V, VII, Mu a C típusú vírusokban) és a terminális fehérjét (TP), amely kovalensen kötődik a vírus mindkét 5'-végéhez. az Ad genom. A kisebb kapszidfehérjék kölcsönhatásba lépnek a magfehérjékkel, kapcsolatot létesítve a kapszid és a genom között; azonban a magfehérjék közötti térbeli szerveződésük továbbra is kevéssé ismert. Kimutatták, hogy a V fenntartja a DNS-t a kapszidban azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a VI-vel (kapszid oldal) és VII-vel (genomoldal) [45–47], és valószínűleg hozzájárul a genom felszabadulásához a nukleáris póruson [48]. A VII a vírus DNS-hez kapcsolódó fő kapszidfehérje, és elősegíti annak kondenzációját a kapszidon belül [49–51]. A VII emellett megvédi a vírusgenomot a sejtes faktorokon keresztüli immundetektálástól [50,52–54]. Érdekes módon a IX-es és V-ös fehérje csak a Mastadenoviridae-ben [55,56] van jelen, a víruskapszidok pedig IX [57] vagy VII-es fehérje [58] nélkül is előállíthatók, ami némi rugalmasságot mutat a kapszid szerkezetében.

A humán Ads genomja kb. 45 fehérjét kódol (beleértve a szerkezeti fehérjéket is), időlegesen szabályozott transzkripciós egységekbe rendezve [59]. Az E1A transzkripciós faktor az első kifejezett fehérje, és szükséges a vírusgénexpresszió elindításához [60]. A genom emellett tartalmaz egy 5'-es beágyazási szekvenciát és minden végponton invertált terminális ismétlődéseket (ITR), amelyek a replikációhoz szükségesek [59,61–64]. Az adenovírusok egy adenovirális proteázt (AVP) kódolnak, amely a részecskébe csomagolva számos fehérjét dolgoz fel (pl. IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP és 52,55K a C típusú vírusokban) [65–67]. Ez a lépés szükséges az érett fertőző részecskék képződéséhez, és metastabil (azaz kevésbé stabil) kapszidok képződését idézi elő, amelyek a kapszid szétszedésére vannak előkészítve a sejthez tapadva és bejutva [68,69]

Az emberi Ads szerkezetében is vannak fajspecifikus különbségek, például a rostok hosszában és rugalmasságában, ami közvetlenül befolyásolja a receptorkötést [70–72]. Különbségek figyelhetők meg a penton összeszerelésben is. A B fajba tartozó vírusok pentonjai pentonok közötti érintkezést hozhatnak létre, ami alternatív és kevésbé stabil vírusszerű részecskéket eredményez, amelyek mentesek a genomtól és esetenként rostok nélkül. Az ilyen részecskéket dodekaédereknek nevezik, és az Ad vektorok alternatívájaként plazmidok vagy peptidek sejtátvitelét vizsgálják. A dodekaéderek jobban kiteszik a legtöbb Ad faj pentonjában jelenlévő RGD rövid peptid motívumot, amely a célsejtek megkötéséhez szükséges [73,74]. A kapszid-stabilitásbeli különbségek, amint azt alább tárgyaljuk, fontos tulajdonságok lehetnek, amelyek meghatározzák az Ad részecskék bejutási sorsát.

1.3. Az adenovírusok litikus életciklust követnek

Az Ad fertőzési ciklust máshol alaposan áttekintették [75–77]. Itt röviden az életciklus belépési szakaszára összpontosítunk, és ha másként nem jelezzük, a C faj vírusaira hivatkozunk, amelyek a legjobban tanulmányozottak (1. ábra). Az adenovírusok a kapszidrostot használják elsődleges sejtkötő molekulaként. A legtöbb Ads, beleértve a C fajú vírusokat is, a coxsackievírust és az Ad receptort (CAR) használja a célsejtek megkötésére [78–81]. Ezzel szemben egyes B fajú vírusok preferenciálisan kötődnek a CD46 receptorhoz [82] vagy a dezmoglein 2-hez [83], és bizonyos D fajú vírusokról kimutatták, hogy kölcsönhatásba lépnek sziálsavakkal [84, 85] vagy közvetlenül v integrinekkel (lásd 1. táblázat). 86].

Így a fajok közötti szálváltás vonzó stratégia a tropizmus megváltoztatására [87–89]. A rostmolekula elsődleges szerepe, hogy közvetítse a fizikai asszociációt a célsejtekkel, amit egy második kölcsönhatás követ a penton és az integrinek, például a v 5 között [90]. Ezt a kölcsönhatást a penton szekvenciában található RGD peptid motívum közvetíti [91]. Ennek a motívumnak a hiánya, akárcsak az F fajú vírusoknál, kevésbé hatékony sejtbejutással jár [92]. Az integrinkötődés integrin csoportosulását eredményezi a sejtfelszínen [93], amely jelátviteli kaszkádot indít el, ami az aktin citoszkeleton [94,95] átrendeződéséhez és a klatrin által közvetített endocitózison vagy mikropinocitózison keresztül történő endocitikus felvételhez [96,97] vezet. Az RGD kötődés a kapszidot is destabilizálhatja [98] azáltal, hogy csökkenti a penton és a hexon közötti érintkezést, elősegítve a kapszid bevonatának eltávolítását [99]. Ennek következtében az Ad részecskék elveszítik rostjaikat, és disszociált hexont és pentont találhatunk az endoszómában [100–102]. Az endoszóma egy dinamikus organellum, amely lebomló lizoszómákká érik, és az Ads-oknak gyorsan a citoszolba kell menekülniük. Az endoszóma savanyítása felgyorsíthatja a szökési folyamatot a kapszid további gyengítésével [100,103]. Az endoszóma behatolási folyamat a belső kapszidfehérje VI felszabadulására épül [103,104].

A felszabaduló VI-t egy N-terminális amfipatikus hélix jellemzi, amely az endoszóma belső lapjához kötődik, és pozitív membrángörbülést indukál, ami lokálisan korlátozott membránszakadást eredményez [75,103,105,106]. A sejtek reagálnak a vírus által kiváltott membránszakadásra, és helyi autofágia választ aktiválnak a sérült organellum eltávolítására [107–109]. A lebomlás elkerülése érdekében az Ads leállítja az autofágiát egy rövid PPxY peptid motívum révén a VI proteinben, amíg a részecske el nem éri a citoszol biztonságát [104, 108]. A C faj vírusairól kimutatták, hogy kiszöknek a korai endoszómákból [110]. Más fajok, köztük az A, B és D, először a lizoszómába jutnak, mielőtt a citoszolba szöknének [111–113], ami befolyásolhatja az említett vírusok által kiváltott immunaktivációt [114].

Miután az Ads elérte a citoszolt, kapcsolatba lép a dynein motorokkal, és retrográd transzportot használ a mikrotubulusok mentén, hogy elérje a mikrotubulus-szervező központot [115–117]. A motoros kötődést valószínűleg a hexon közvetíti [115], és savas alapozást igényelhet [118]. A sejtmag közelében a kapszidok transzportirányt váltanak, valószínűleg a kinezin motorfehérjékhez kötődve, és a sejtmag burkánál felhalmozódnak [115,117,119,120]. A nukleáris póruskomplexumhoz kötődnek, majd a kapszidok teljesen szétszednek, és a genomok felszabadulnak és importálódnak a sejtmagba [51,121–124]. A sejtmagba jutva a ciklus a genom transzkripciós aktiválásával és az azonnali korai E1A gén expressziójával folytatódik, amely transzkripciós faktorként szolgál az összes többi korai transzkripciós egység számára [60,125–130]. A replikációs enzimek expresszióját követően a vírusgenomok replikálódnak, és a replikációs központok perifériáján halmozódnak fel [131].

Ezután a késői expressziós egységből a strukturális fehérjék expresszálódnak a fő késői promoter irányítása alatt [132,133]. A késői gének expressziója az összes strukturális fehérje termelődésében és nukleáris felhalmozódásában csúcsosodik ki, ahol utódokká állnak össze és csomagolják az újonnan szintetizált genomokat. Az Ads következő generációjának nukleáris összeszerelése ezután részecskekilépést és sejtlízist eredményez [42,134–136]. Mint fentebb említettük, a kapszidok összerakását érlelés követi, azaz számos kapszidfehérje proteolitikus hasítása az AVP által, fertőző részecskék előállítására [66]. Ennek a folyamatnak a fontosságát példázza a hőmérséklet-érzékeny mutáns, a Ts1, amelyet kezdetben az Ad2-ben egy mutagenezis-szűrés során azonosítottak. A nem megengedő hőmérsékleten ez a mutáns nem képes becsomagolni az AVP-t, és az összeállított részecskék nem mennek át érlelésen, ami hiperstabil részecskéket eredményez [137]. A felelős AVP mutációt genetikailag bevitték az Ad5-be, megtartva ezt a fenotípust. A Ts1 kapszidok továbbra is képesek a sejtreceptorokhoz kapcsolódni és endocitizálódni, de azután az endoszómában maradnak, mivel nem képesek felszabadítani a VI proteint [103,138,139].

2. Adenovírus immundetektálása

Az adenovírusok széles körben elterjedtek, és a lakosság nagy többsége elsősorban gyermekkorában szembesült ezzel a vírussal. Az adenovírusok erősen immunogének, és minden találkozás specifikus anti-Ad immunitás kialakulását váltja ki, mind a veleszületett, mind az adaptív, amely egy életen át tarthat. Ez fontos a vírus elleni küzdelemben, és kevésbé károsítja az Ads-t az immunkompetens gazdaszervezetre, de akadályt jelenthet, amikor az Ads-t vektorként használják a vakcinázásban vagy a génterápiában [140,141]. Ha megértjük, hogy az Ad (és vektorszármazékai) hogyan aktiválják az immunrendszert, az lehetővé teszi számunkra, hogy javítsuk az oltások hatékonyságát és biztonságosságát. A klinikai vizsgálatokban részt vevő betegek in vivo megfigyelései egyértelműen azt mutatták, hogy az Ad-alapú vektorok erőteljes immunaktivációt válthatnak ki [142,143], néha végzetes következményekkel [144].

Ezenkívül különféle in vitro vagy állatmodellekkel végzett tanulmányok [145] azt sugallják, hogy magának a vírusrészecskének (azaz a kapszidnak és a beépült DNS-nek) kulcsszerepe van a kezdeti immunválasz aktiválásában. Itt röviden a belépő kapsziddal kapcsolatos immunválaszokra összpontosítunk; mélyebb áttekintésért lásd a korábban publikált áttekintéseket [146–149].

2.1. Az adenovírusok kiváltják a sejt belső immunitását

Az Ads vektorként való kifejlesztésével nyilvánvalóvá vált, hogy az Ads által kiváltott sejten belüli vagy veleszületett immunitás válasz a behatoló virionra. Érdekes módon mind a replikatív, mind a nem replikatív vírusok (azaz UV-inaktivált vírusok, nem replikatív vektorok vagy üres kapszidok) aktiválják az immunválaszt a fertőzött sejtekben, ami azt mutatja, hogy a kapszid kulcsszerepet játszik ebben a válaszban [145,150–156] .

Általában a sejtek több lépésben érzékelik a hirdetéseket a vírus teljes életciklusa során, és aktiválják a veleszületett immunitási útvonalakat (1. ábra). Ez az aktiválás azzal kezdődik, hogy az Ad rost kötődik a sejtfelszíni receptorhoz, a CAR-hoz, amely aktiválja a mitogén által aktivált protein kináz (MAPK) jelátvitelt, amely az NF-κB transzkripciós faktor aktiválásához vezet. Ez a trigger gyulladást elősegítő citokinek (IL-6, IL-8) termelődését eredményezi [157,158]. Ad fajtól függően azonban más receptorok használata módosíthatja a citokin expressziójában szerepet játszó jelátviteli kaszkád erősségét [159]. A vírus penton és a celluláris integrin közötti kölcsönhatás az immunaktiválás további kiváltója. Egy egér makrofágokon végzett vizsgálat kimutatta, hogy ez a kötődés aktiválja az IL-1 expresszióját az RGD-motívumon keresztül [160]. Ez az immunsejtekre korlátozódhat, mivel más sejtmodellekben (pl. HeLa, epiteliális sejtvonal) az integrin/RGD kölcsönhatás szerepe a kemokinekben és a gyulladást elősegítő citokinek termelésben nem igazolódott [151,161,162]. Ez arra utal, hogy magának az internalizációs folyamatnak fontosabb szerepe van az immunaktiválásban, mint az integrinekkel való kölcsönhatásnak. Valójában a penton integrinhez való kötődése a foszfoinozitid 3-kináz (PI3K) jelátvitelét is aktiválja, hogy fokozza a vírus internalizációját [163].

Ezenkívül kimutatták, hogy a PI3K aktiváció Ad fertőzés hatására gyulladást elősegítő citokinek, például TNF termelését váltja ki [164], és az internalizációs folyamatot az immunaktivációhoz szükségesnek írták le [165]. Ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy az immunaktiváció főként egy posztinternalizációs lépésben következik be, kiemelve a belépés utáni válogatás fontosságát (lásd [166]).

Az endoszómába kerülve az Ads intraluminális kórokozó-felismerő receptoroknak (PRR) van kitéve, mint például a TLR9, amely egy kétszálú DNS-érzékelő, amely az immunsejtekre korlátozódik. Az egér makrofágok a TLR9-en keresztül érzékelhetik az Ad vektorokat, hogy indukálják a gyulladást elősegítő citokinek termelését [167]. A TLR9-re akkor is szigorúan szükség volt az IFN/termeléshez, amikor rágcsáló plazmacitoid dendritikus sejteket (pDC) fertőztünk Ad-dal [168]. A TLR9 knock-out egérmodellekben azonban az IFN / még mindig termelődött, ami arra utal, hogy a pDC-től eltérő sejtekben az IFN termelés a TLR9 jelátviteltől függetlenül történik [168, 169].

A vírusgenomok (vagy vektorgenomok) elérhetővé válnak az érzékelésre a vírus endoszomális kiszabadulása során vagy azt követően. Amint elérik a citoszolt, a cGAS citoszol kétszálú DNS-érzékelő érzékeli őket [168,170]. A vírusgenom felismerésekor a cGAS elősegíti az IRF3 transzkripciós faktor foszforilációját és nukleáris transzlokációját az IFN / expresszió meghajtása érdekében, vírusellenes állapotot indukálva. Az endoszómális áthaladás vírus által kiváltott endoszomális membránkárosodást igényel, hogy megkönnyítse a vírusrészecskék endoszómális kijutását. A membránrepedés tehát jelentősen hozzájárul az immunaktivációhoz, amit kiemel az a tény, hogy a menekülési hibás Ts1 mutáns nem képes teljes és hatékony immunválaszt aktiválni [161,162,170,171]. Az Ad membrán behatolása utáni gyulladásos válaszban kulcsszerepet játszik a tankkötő kináz, a TBK1, amely a vírusgenom cGAS/STING útvonalon keresztül történő downstream citoszolos érzékelésének része [168,170].

Az adenovírus membránkárosodása a katepszin B felszabadulását is eredményezi az endo-lizoszomális kompartmentből, oxidatív stresszt okozva, ami aktiválja az NLRP3 gyulladást, ami IL-1 érését eredményezi [114]. A C faj vírusai kiszöknek a korai endoszómákból, míg a B faj vírusai a késői endoszómákig terjednek, feltehetően a receptorhasználat különbségei miatt. A késői endoszómában/lizoszómában bekövetkező savasodás nagyobb valószínűséggel aktiválja a lizoszómális savhidrolázokat. Mindkét faj gyulladásos aktivációt vált ki [172], de valószínűleg az endoszómában való tartózkodási idő miatt válaszaik mértéke eltérő. Globálisan a B faj vírusai erősebb veleszületett és adaptív immunaktivációt indukálnak, mint a C faj vírusai [113,173,174]. Ez magyarázatot adhat arra, hogy a B faj vírusai miért patogénebbek, és miért okoznak járványokat immunkompetens gazdaszervezetekben [26]. Továbbá azt sugallja, hogy a sejtek képesek megkülönböztetni a penetrációs kompartmentet (azaz endoszómát a lizoszómához képest [109]), és módosítani tudják az immunitás hatékonyságát. Az Ad escape folyamat során az endoszómális membrán károsodása önmagában is veszélyjelzés lehet. Amint azt az alábbiakban részletesen tárgyaljuk, a membránkárosodás az intraluminális glikánok citoszolikus expozícióját eredményezi, amelyeket a sejt veszélyjelzésként észlel (lásd a [109]-ben). A kitett glikánok galektinek általi kimutatása ezt követően aktiválja az autofágiát, beindítva a vírusellenes immunitás második ágát [108].

2.2. Az adenovírusok adaptív immunválaszt váltanak ki, és felforgatják a vírusellenes autofágiát a sejtek bejutásakor

Az Ads vagy vektoraik által kiváltott veleszületett immunválaszok ezt követően adaptív immunitássá alakulnak át a kemokin szekréció révén, amely vonzza az immunsejteket (neutrofileket, természetes ölősejteket és makrofágokat), és megerősíti a hatékony antigénprezentációt [153, 154]. Az adenovírusok erősen immunogének, és fő immunogénjeik a fő kapszidfehérjék (hexon, penton és rost), amelyek beindítják a B-sejtek semlegesítő antitestek fajspecifikus termelését [175–177].

A semlegesítő antitestek többnyire a hexonfehérje hipervariábilis hurkái ellen irányulnak [178–180], és jelentős korlátozást jelentenek az Ads ugyanazon szerotípusból származó vektorokként való használatában. Ezt a problémát kevésbé szeroprevalens vagy nem emberi hirdetések használatával sikerült megkerülni [181–185]. A vektorellenes immunitás ellenére, amikor az Ads-t vakcinaplatformként használják (pl. az Ebola elleni immunvédelem kiváltására a klinikai vizsgálatok során), akkor is erős B-sejtes választ indukálnak, lehetővé téve a kívánt vakcina immunogén elleni antitestek termelését, amelyek tartósak lehetnek. legfeljebb 6 hónapig [186]. Ezenkívül a már meglévő vektorimmunitás leküzdhető magasabb vektordózisokkal, mint a SARS-CoV-2 vakcinavektor esetében, amely a magas szeroprevalenciájú AdC5-ön alapul [187].

A semlegesítő antitestekhez hasonlóan az Ad-fertőzések is tartós T-sejt-immunitást váltanak ki, főként a CD4 plusz aktiválása révén. Ez a védelem még mindig megtalálható a felnőtteknél, ami a gyermekkortól származó hosszan tartó immunitásra utal [188–190]. Ezenkívül a CD8 plus aktivációját a citotoxikus válasz fenntartása érdekében is leírták [191–193]. Ez a T-sejt aktiválás nem feltétlenül szerotípus-specifikus, és keresztvédelmet tesz lehetővé a különböző Ad alcsoportok és szerotípusok ellen [192–194].

Ezenkívül az Ad-fertőzött, őssejt-transzplantált betegekben a CD4 plus és a CD8 plus erős aktiválódását írták le [195]. Ez az aktiválás a hexon peptidek ellen irányul, és az Ad virémia kiürüléséhez vezet, hangsúlyozva mind a CD4 plusz, mind a CD8 plusz T-sejt aktiválás fő szerepét az immunvédelemben. Míg ez a T-sejt-alapú immunitás az Ad részecske ellen irányul, az Ads erős sejtes immunitást is kivált a vakcina antigén elleni T-sejt-válasz alapján, ami előnyös a hosszan tartó immunitás szempontjából, ha rekombináns Ad vektorokat alkalmaznak vakcinaplatformként [196,197 ]. Fontos, hogy a klinikai vizsgálatokból származó adatok megerősítették, hogy amikor az Ad-ot vakcinaplatformként használják (a kívánt antigénnel transzgénként), mind a citotoxikus CD8 plusz T-sejt, mind a CD4 plusz T-sejt aktiválódását indukálja, ami memória-immunitás kialakulásához vezet a vakcina ellen. expresszált transzgén [184,186,198–202].

A T-sejt aktiválása a víruspeptidek prezentációján alapul a fő hisztokompatibilitási komplexen (MHC) keresztül. Röviden, az MHC I. osztályú antigénprezentációja a proteaszómális degradáció eredménye, és a kapott peptidek CD8 plusz T-sejt aktivációt indukálnak, lehetővé téve a citotoxikus T-sejt válasz indítását és proliferációját. Az MHC II. osztályú antigénprezentáció lizoszómális proteolízis eredménye, és a kapott peptidek CD4 plusz T-sejt aktivációt indukálnak a bemutatáskor, kiváltva a B-sejtek későbbi aktiválódását [203]. Ma már jól jellemezték, hogy az autofágia elősegíti a peptid prezentációját az MHC II. osztályú molekulák számára [204]. Nem meglepő, hogy az autofágia az egyik legrégebbi védekező mechanizmus a fertőzésekkel szemben, és fontos része a sejtrepertoárnak a behatoló kórokozókkal szemben, részt vesz mind a veleszületett, mind az adaptív immunválaszokban. Közvetlenül le tudja kötni a kórokozót (xenofagia), és részt vesz annak immunrendszer felé történő bemutatásában [205–207]. A makroautofágia (gyakrabban autofágia) egy konzervált lizoszómális lebomlási útvonal, amely számos alapvető élettani folyamatban vesz részt, mint például a homeosztázisban és a veleszületett és adaptív immunitásban [208–210]. Az autofágiát egy kettős membrán vezikula, az úgynevezett "autofagoszóma" képződése jellemzi, amely elnyeli a lebomlásra szánt citoplazmatikus rakományokat (azaz organellumokat, aggregátumokat és kórokozókat) (2. ábra). E folyamat során a rakományt tartalmazó autofagoszómák egyesülnek a lizoszómákkal, hogy lebontsák és újrahasznosítsák.

Az autofágián keresztüli antigénprezentációt mind az I., mind a II. osztályú MHC esetében leírták [204]. Az autofágia indukálása után az intracelluláris antigének bekebeleződnek az autofagoszómákba, egyesülve az MHC II. osztályt tartalmazó kompartmentekkel, hogy külső patogén anyagot biztosítsanak számukra (2. ábra) [211]. Az autofágia szerepét ebben a bizonyos MHC II. osztályú antigénprezentációban először Epstein-Barr vírusfertőzésnél írták le, ahol az autofágia gátlása csökkent CD4 plusz T-sejt aktivációhoz vezetett [212,213]. A mai napig a példák számos vírust tartalmaznak, beleértve a herpes simplex vírust [214], az influenza vírust [215] és az 1-es típusú humán immunhiány vírust (HIV{11}}) [216], és valószínűleg az Ads-re is kiterjed (lásd alább). Az MHC II. osztályú bemutatása összhangban van az autofágia folyamatával, mivel ez egy citoszolikus védekezési mechanizmus. Az autofágia az extracelluláris antigének MHC II. osztályú keresztprezentációjában is szerepet játszik [214]. Valójában az extracelluláris ovalbumin MHC-prezentációja hatékonyabb, ha az autofágia gépezet (és különösen az ATG5) működőképes, és az extracelluláris anyag felvétele során kimutatták, hogy az autofágia egy nem kanonikus formája, az LC3-asszociált fagocitózis. LAP) [217].

Amint jelen vannak a LAP-some-ban, néhány extracelluláris antigének az MHC II. osztályú prezentáción keresztül exponálhatók [218]. Az autofágia bizonyos mértékig szerepet játszik az MHC I. osztályú prezentációban is, bár az epitópok túlnyomó többsége olyan mechanizmuson keresztül jelenik meg, amely szigorúan az antigén feldolgozó (TAP) komplexhez kapcsolódó transzportertől függ [219]. Az autofágia által közvetített TAP-független prezentáció eddig csak TAP depléciós körülmények között volt kimutatható [219,220]. Az, hogy ez a bemutatási mód valóban létezik, továbbra is vitatott [221], és máshol is tárgyalják [204,222,223].

Az MHC-prezentációk megelőzése érdekében az Ads genomjuk nagy részét, nevezetesen az E3-régiót, arra fordítja, hogy aláássa az MHC-prezentációs rendszert a sejtekben [224–228]. A legtöbb (vakcina) vektorban ezek a gének hiányoznak, és a legújabb kutatások azt sugallják, hogy az MHC általi fokozott antigénprezentáció javíthatja az Ad vakcina hatékonyságát [229,230]. Az autofágia döntő szerepet játszik az Ad antigének feldolgozásában az MHC II. osztályú prezentációhoz Ad-indukált immunitásban [108,229].

Montespan et al. kimutatták, hogy az Ads autofágiát indukál az endoszómák behatolásakor, és hogy az autofágia által kitisztított részecskék e folyamat során történő bejutása hatékonyan jelenik meg az immunrendszer számára [108]. Ez a megfigyelés összhangban van Klein et al. megmutatja, hogy az onkolitikus Ads összefüggésében a vírusantigéneket az autofágia JNK-függő formája érleli [229]. Az autofágia azonban a rák összefüggésében kettős szerepet játszik. A homeosztázis fenntartójaként az autofágia korlátozza a tumor beindulását [231], míg előrehaladott rák esetén az autofágia túlélési folyamatként működik, és elősegíti a tumor növekedését [232, 233]. Így az onkolitikus vektorokkal összefüggésben a tumorspecifikus autofágia jellemzőit gondosan értékelni kell.

3. Adenovírusok mint (vakcina) vektorok

A vírus vektorizálása magában foglalja a vírus természetes tulajdonságainak kiaknázását, ugyanakkor minimálisra csökkenti a kapcsolódó biológiai kockázatot. Ebben a tekintetben az Ads kiváló vektorjelöltjei a vakcinafejlesztésnek [234]. Az adenovírus vektorok stabilak, könnyen előállíthatók magas titerre, és nagy klónozási kapacitással rendelkeznek. Ez lehetővé teszi egy transzgén beépítését, azaz egy választott antigén expresszálását. Széles fertőzőképességi spektrummal rendelkeznek, nem osztódó sejteket transzdukálnak, genomjuk pedig nem integratív [1]. A fent leírtak szerint gyulladásos választ is kiváltanak az antigénprezentáló sejtekben (APC), amely adjuváns funkciót tölt be a hatékony vakcinázáshoz szükséges immunválasz erősítésére [2,3,142,235,236].

Ezenkívül az ad-eredetű vektorokat széles körben használták preklinikai és klinikai vizsgálatokban biztonságosságuk bizonyítására [237,238]. A replikációs ciklus nemkívánatos részének kiküszöbölése érdekében a vírusreplikációt gátolni kell, hogy megakadályozzuk a sejtlízist és a vírusszaporodást. Az adenovírus-vektorok fejlesztése az 1990-es évek elején kezdődött, mint a terápiás megközelítések széles skálájának platformja, mint például a génterápia, az onkolitikus vektorok és a vakcinafejlesztés. A legtöbb korai vektorfejlesztés a C faj vírusainak módosított változata volt.

3.1. Adenovírus vektor fejlesztés, generációs megközelítés

Az Ad vektor első generációját úgy hozták létre, hogy a vírusgenomból törölték az E1 és E3 régiót, amelyek különösen a közvetlen korai transzkripciós faktort kódolják, megakadályozva ezeknek a vektoroknak a replikációját. Ezeknek a vektoroknak a klónozási kapacitása körülbelül 8 kb volt ahhoz, hogy szabályozó szekvenciákkal rendelkező transzgént inszertáljanak [239–241]. Az első generációs vektorokat humán embrionális vese (HEK) sejtekben állították elő, amelyeket stabilan transzformáltak az Ad5 vírusgenom egy részével, amely kiegészíti az E1 régiót transzban [242–247]. Ennek a rendszernek az egyik legnagyobb hátránya, hogy lehetővé teszi a spontán rekombináció után a replikáció-kompetens genomok helyreállítását [248]. Az E3 további deléciója, amely nem szükséges a vektortermeléshez, megnöveli a transzgénkazetta méretét [243], és elősegíti a jobb immunválaszt [240].

Sajnos az első generációs Ad vektorok nem voltak teljesen transzkripciósan inertek, és még mindig erős immunválaszt váltottak ki az alapszinten expresszálódó víruskapszid fehérjékkel szemben [141,249,250]. Ez a lentivektor immunitás hozzájárult a vektor toxicitásához és a transzdukált sejtek rövid távú eliminációjához [145]. Az Ad vektorok második generációjából ezenkívül eltávolították az E2 és E4 régiókat a vektor genomjából. Az E2 a replikációs enzimeket és az E4 további szabályozó fehérjéket kódolja [251–253]. Ez lehetővé tette a 10,5 kb méretű transzgénszekvenciák számára a helyet, beleértve legfeljebb négy expressziós kazettát [254]. Hasonlóképpen, a kiegészítő deléciók erősen csökkentették a nem kívánt rekombinációt és meghosszabbították a transzgén expresszióját [255]. Ez valószínűleg egy csökkent aberráns vírusgénexpresszió eredménye volt, amely tovább csökkenti a vektorellenes immunitást [141,250,251]. A harmadik generációs adenovírus vektorok fogalmilag különböznek egymástól. Egy csomagolt vektorgenomból és egy nem csomagolt vírusgenomból (helper vírus) állnak, amely vektorrészecskéket termel. Az ilyen vektorokat „segítőfüggő”, „gutless” vagy „nagy kapacitású” (HC-Ad) vektoroknak is nevezik. A lehető legnagyobb klónozási kapacitással rendelkeznek, és akár 36 kb méretű szekvenciákat is hordozhatnak [256–258]. A nagy kapacitású hirdetésekből hiányzik a vírust kódoló szekvencia, kivéve az ITR-eket és a rövid beágyazási jelet, amely lehetővé teszi a genomcsomagolást, és amely hiányzik a segítő vírusból [259–262]. Ez a stratégia lehetővé tette számunkra, hogy végre legyőzzük a legtöbb vektorellenes immunitást, lehetővé téve a transzgének hosszú távú expresszióját [263–267]. A HC-Ads azonban nem része a jelenlegi vakcinavektor-repertoárnak.

3.2. Az adenovírus, mint vakcina vektor

Mielőtt megvizsgálnánk, hogyan hasznosították az Ad vektorokat, érdemes megemlíteni, hogy maguk a B 4-es és 7-es típusú Ad-faj vírusai elleni vakcinázást az 1970-es évek elején fejlesztették ki [268]. Ez az orális élő vakcina 2011 óta kötelező az Egyesült Államokban a katonai újoncok számára, és drámaian csökkent a fertőzések aránya, gyakorlatilag elérve a nullát [269–271]. Ez rávilágított az Ads mint vakcina belső hatékonyságára és biztonságára, és megnyitotta a teret az Ads oltási platformként való használatához. Eddig több mint 200 reklámalapú vakcina került klinikai vizsgálatokba [272]. Sokan közülük olyan fertőző kórokozók ellen irányulnak, mint a HIV{10}} és az Ebola [230,273,274]. Az adenovírus-alapú vakcináknak nincsenek hátrányai. Egy nemrégiben kifejlesztett HIV elleni vakcina, amely a C faj Ad5 vírusán alapul, a HIV-1 gag, pol és nef géneket expresszáló vektorok keverékét használta [275,276]. A vektorok biztonságosak, immunogének és jól tolerálhatók voltak. Sajnos az így létrejött STEP klinikai vizsgálatot idő előtt le kellett állítani [277–279]. Ez a vakcina nemcsak hogy nem véd a HIV-fertőzés ellen, hanem az epidemiológiai adatok azt sugallják, hogy az Ad elleni oltás ebben az esetben növelte a HIV-fertőzés kockázatát [280–282]. Az Ad5 elleni már meglévő immunitást potenciális posztoltási kockázati tényezőként azonosították [283,284]. Ezt a megfigyelést azonban nem erősítették meg hasonló vizsgálatok [285 286], és mechanikailag tisztázatlan marad [287 288]. A HIV mellett reklámalapú vektor vakcinákat fejlesztettek ki az ebola (Ad-EBOV) elleni küzdelemben, amely Nyugat-Afrikában visszatérő fenyegetés [289]. Minden Ad-EBOV vakcina az Ebola glikoproteint (GP) használja vakcina antigénként. A rágcsálókon és főemlősökön végzett kezdeti preklinikai vizsgálatok Ad5-öt használtak, és 3 hónapon át tartó védelmet mutattak neutralizáló antitestek termelődésével és CD8 plusz aktivációval [273,290–292]. Ez a vakcina II. fázisú klinikai vizsgálaton ment keresztül; azonban a vakcinázott populáció Ad5 elleni előzetes immunitása a kiváltott neutralizáló antitestek szintjének eltéréséhez vezetett [293–297]. A probléma megoldására a kevésbé elterjedt D Ad26 fajon alapuló vakcinákat fejlesztettek ki [186 298 299].

Az Ad26 azonban kevésbé immunogén emberben, ami csökkenti az oltás hatékonyságát, és egy kanyaróvírus-alapú vakcina (MVA) alkalmazásával elsődleges oltást igényel. Ez az oltási rendszer elérte a III. fázisú klinikai vizsgálatokat [289 300 301]. A nem humán reklámvektorok alkalmazása is fejlesztés alatt áll [184]. A csimpánz ChAd3 vakcinaplatformként történő alkalmazása az EBOV elleni vakcina platformként védettséget mutatott rágcsálókban és csimpánzokban [302 303], és az ezeket a vektorokat alkalmazó klinikai vizsgálatok a fejlődés különböző lépéseiben járnak [17 300 301 304–306].

Egészen a közelmúltig a HIV{0}} és az EBOV vakcina volt a két fő példa a reklámvektor-alapú vakcinák alkalmazására, de nem ők az egyetlenek. Különböző kísérletek történtek Ad vakcina vektorok alkalmazására különféle kórokozók, például Mycobacterium tuberculosis [307–310], dengue-láz vírus [311–313], hepatitis B és C [314–320], veszettség [321–324] vagy influenza ellen. [325–328]. Hatékonyságuk azonban mindig elmaradt a várakozásoktól (további részletekért lásd [18,142,300,329]). Az EBOV vakcinajelölt maradt az egyetlen gyakorlatilag alkalmazott Ad vakcina, és bizonyos korlátozásokkal használják a Kongói Demokratikus Köztársaságban. Ez a vakcina az Ad26 típuson (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO) alapul, és 2020 májusában 20 339 ember kapta meg az első adag oltást, és 9560-an voltak teljesen beoltva [230 301 330].

Az adenovírus-vektoros vakcinák nagy nyilvánosságot kaptak a SARS-CoV-2 világjárvány hatására. A helyzet sürgőssége lehetővé tette fejlődésük hasznosítását, beleértve a korábbi, regionálisan korlátozott SARS-CoV-1 járványokat okozó koronavírusok elleni vakcinákkal szerzett tapasztalatokat is [331]. A koronavírus-spike (S) glikoproteint a koronavírus-fertőzések elleni immunitás szempontjából a legjobb vakcina-antigénként azonosították [332,333]. A mai napig négy Ad vektor vakcina, amelyek mindegyike a tüske antigént kódolja, fejlett állapotban van, és a világ nagy részén sürgősségi használatra engedélyezték. Az alkalmazott vektorstratégiák kissé eltérőek voltak, de alapvetően az első generációs vektorok használatát foglalják magukban. A C faj Ad{9}}alapú vektorok (Ad5-nCoV), a már meglévő immunitás leküzdése nagy vektordózissal (CanSino) [187,334], a kevésbé elterjedt D-fajú vírusok használatáig terjednek. Ad26, stabilizált tüske-glikoproteint (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) használva [335]. Egy másik megközelítés a ChAdOx1-S-(AZD1222), egy csimpánzokból származó reklámvektor [336,337]. Az egyetlen használatban lévő, heterológ prime-boost stratégián alapuló vakcina a vektorimmunitás leküzdésére (Gam-COVIDVac/Sputnik V) először Ad{26}}alapú vektort alkalmaz, majd az emlékeztető injekcióban Ad5 vektort [338,339]. A klinikai vizsgálati adatok minden esetben nagyon ígéretesek voltak, magas szintű indukált védő immunitást mutatva, és több országban engedélyezték a sürgősségi alkalmazást az Ad-alapú vakcinák használatára. Ezenkívül a különböző országokban folyamatban lévő oltási kampányokkal kapcsolatos epidemiológiai felmérések azt sugallják, hogy az Ad-alapú SARS-CoV{33}} vakcinák alkalmazása elsöprő sikerrel jár.

4. Az adenovírus (vakcina) vektor hatékonyságának modulálása, a kapszid vezet az utat

Az adenovírus (vakcina) vektor tervezésénél több tényezőt is figyelembe kell venni. Ezek közé tartozik a kódolt antigén hosszú és tartós expressziójának fenntartása és egy immunológiai kontextus aktiválása (adjuváns hatás), amely lehetővé teszi az antigénexpresszió hatékony transzlációját egy tartós adaptív immunitássá, amely az immunogén ellen irányul, de nem maga a vektor ellen. Az immunológiai összefüggést a vakcinavektor által a beadás során kiváltott veleszületett immunaktiváció biztosítja. Ebben az összefüggésben fontos az a hatékonyság, amellyel a veleszületett immunérzékelők észlelik a vektort, és ez meghatározza az adaptív válasz amplitúdóját. A fenti szakaszokban leírtak szerint a veleszületett immunérzékelés főként a belépés utáni szinten történik, az Ad endoszóma behatolásával egyidejűleg. A (vakcina) antigén hatékony expressziója a vektor-clearance szintje és a vektor genomok sejtmagba való sikeres szállítása és expressziója közötti egyensúlytól függ. A kapszid display vektorok kifejlesztésével a transzgén expressziója nem szükséges az immunaktiváció kiváltásához. Ez a stratégia egy érdeklődésre számot tartó epitóp Ad-kapszid fehérjékbe való beépítésén alapul, lehetővé téve annak közvetlen kitételét az immunrendszerrel. Még ha ennek a megközelítésnek is vannak előnyei, a legtöbb vakcinavektor genetikailag kódolt génekre támaszkodik. A kapszid-megjelenítési vektorokkal kapcsolatos további információkért kérjük, olvassa el ezeket a véleményeket, [340,341].

A vírusvektorral szembeni már meglévő immunitás (pl. 30–90 százalék a C fajú Ad5 vírussal szemben, a földrajzi helytől függően) csökkentheti a vektorfelvételt, valamint csökkentheti az antigénexpressziót és az ebből eredő immunválaszt [342–344]. Számos stratégiát dolgoztak ki a vektorellenes immunitás csökkentésére, és nemrégiben felülvizsgálták [249]. Röviden, a neutralizáló antitestek főként az exonok hipervariábilis hurkát ismerik fel, és ennek következtében szerotípus-specifikusak [178–180]. Ezért ezek a hipervariábilis hurkok helyettesíthetők egy másik, kevésbé elterjedt szerotípushoz [178,345]. Ez megakadályozza a vektor semlegesítését és inaktiválását. Mivel az Ad5 a leginkább szeroprevalens típus, ritka szerotípusok, például Ad26, Ad35 vagy nem emberi Ads használatával szintén elkerülhető ez a probléma [177,346–350].

Mindazonáltal a ritka típusok alkalmazásának fő hátránya az alacsonyabb immunogenitásuk, ami kevésbé hatékony a vakcina kifejlesztésében [298]. Ezért a vektorellenes immunitás csökkentésére irányuló stratégiákat párhuzamosan kell kidolgozni a vektor immunogenitását fokozó stratégiákkal a leghatékonyabb vektor elérése érdekében. Még akkor is, ha a vektorral szembeni neutralizáló antitestek kezdeti szintje alacsony, az adott vektortípussal végzett vakcináció olyan választ válthat ki, amely megakadályozza annak jövőbeni használatát. Az anti-vektor válasz beindítása a belépés utáni szinten is megtörténik, amikor a vektorrészecskéket szétválogatják és magukat antigénként dolgozzák fel. A vakcinázás sikeréhez immunológiailag kedvező kontextus kialakítása a vektorimmunitás fokozott aktiválásának rovására mehet. A reklámvektorok felvétel utáni sorsát meghatározó paraméterek megértése lehetőséget adhat a vektortervezésre.

4.1. A stabilitás a fajokban rejlik

A receptor által közvetített felvétel és az endo-lizoszómális kompartmentből való kilépés az Ad fertőzés és a vektortranszdukció jellemzői. A kezdeti felvételt a vírusrost és a pentonmolekulák sejtreceptorokkal való kölcsönhatása határozza meg. A rost és a penton minden hirdetésben közösek, de fajuktól függően különböző sejtreceptorokhoz kapcsolódnak (1. táblázat). A C fajú vírusok CAR-t használnak, és a belépő részecskék egy korai endoszomális kompartmentből szöknek ki [79]. Ha a C fajba tartozó vírusokat (Ad5) úgy alakítják ki, hogy egy B faj vírusából (Ad16) származó rostmolekulát tartalmazzanak, a kapott részecske (Ad5F16) ezután egy lizoszómális kompartmentből távozik (amint azt a LAMP1 lizoszómális markerrel történő festés mutatja) a korai vírus helyett. endoszóma [351]. A lizoszómákból való késleltetett menekülés az összes vizsgált B faj vírusára jellemző [111 352 353].

Ezenkívül a hibrid Ad5F16, valamint a B fajú vírusok erősebb gyulladásgátló választ váltanak ki, mint a C faj vírusai [159,351]. Ez az intraluminális TLR9-en keresztüli fokozott detektálásnak tulajdonítható az immunsejtekben [354]. Ezenkívül a lizoszóma membránkárosodása a korai endoszóma károsodástól eltérően erős oxidatív stresszt okoz. A lizoszóma szakadás során lizoszómális hidrolázok, például katepszin B szabadulnak fel, amelyek károsíthatják a mitokondriumokat, így erősítik a károsodási választ a gyulladásos aktiváció révén [355–357]. Az Ad felvételi folyamat destabilizálja a kapszidot, lehetővé téve a vírus VI fehérje felszabadulását [103,106]. A felszabaduló VI fehérje ezután behatol a membránon az endo-lizoszómális kompartmentből, hogy lehetővé tegye a vírus számára a citoszolhoz való hozzáférést. A C és B fajok összehasonlítása azt mutatja, hogy mindkét vírus egyformán hatékony a citoszolba való bejutásban és a genombejuttatásban, de eltér a szökési kinetikájukban [111]. Figyelemre méltó az a tény, hogy egy egyszerű rostcsere átviheti a belépési és immunogén tulajdonságokat a B fajról a C fajra. Bizonyítékot nyújt arra, hogy meghatározott tulajdonságokkal rendelkező hibrid vektorok tervezhetők. Úgy tűnik, hogy a mögöttes különbség az, hogy a protein VI felszabadulása késik a B fajú vírusokban (vagy a hibrid vírusban), és savanyítást vagy más, ismeretlen szétszerelési indítékot igényelhet.

Mivel ebben az esetben a protein VI felszabadulása késik, ez a megnövekedett kapszidstabilitást tükrözheti. Valójában a C típusú Ad5 vírusokról kimutatták, hogy felszabadítják a rostmolekulát a sejtkötéskor, amiről azt feltételezték, hogy gyengíti a kapszidot, és elindítja a szétszerelési folyamatot a VI. protein felszabadulásához. Ebben az összefüggésben a rost nélküli Ad5 kevésbé stabilnak bizonyult, mint a natív részecskék [358]. Ezzel szemben a nem érett, hiperstabil Ts1 Ad2/5 nem bocsát ki rostot vagy protein VI-t, és gyengén indukálja a gyulladást, mivel nem váltja ki a TLR9-et és nem okoz membránkárosodást [114,138,359,360].

Azt, hogy a B fajjal történő szálcsere megakadályozza-e a rostok kezdeti felszabadulását, és stabilabbá teszi-e a C faj kapszidját, nem vizsgálták, de valószínű. A kapszid stabilitás lényeges meghatározója lehet a belépés utáni kapszid sorsnak, és kibővítve olyan tulajdonság, amely a vektortervezésben hasznosítható. A B faj vírusai stabilabbak lehetnek egy másik receptor használata vagy egy egyedi rost-penton kölcsönhatás miatt. Ezzel szemben az Ad40/41 F típusú vírusok megfertőzik a gyomor-bélrendszert, és megnövekedett kapszidstabilitásuk tropizmusuk és a zord bélkörnyezethez való alkalmazkodásuk miatt [24,361]. A bél belső hőmérséklete néhány fokkal meghaladja a C faj vírusai által megcélzott felső légutakat (37 ◦C vs. 33 ◦C) [362]. Így az Ad40/41 eleve hőstabilabb, támogatja a fertőzési folyamatot [24], ami szintén megnehezíti a szaporodásukat [24,361,363].

Ezenkívül hiányzik belőlük az RGD motívum a penton molekulában, ami tovább csökkenti a sejtbejutást [92]. Nem ismert, hogy ezek az egyedi kapszid tulajdonságok a lizoszómális kompartmentből való kilépésben vagy részleges szétszerelésben/protein VI felszabadulási hibákban jelentkeznek-e a belépéskor. Ezzel szemben ezek a tulajdonságok kontextust adhatnak az orális vakcina alkalmazások fejlesztéséhez. A B fajú rostokkal ellentétben az F faj rostokat hordozó vektorai csökkent immunaktivációt mutatnak [364], ha standard környezeti feltételek mellett alkalmazzák őket. Ha egy adott emberi Ad fajt kiragadunk a kontextusból, és vakcina vektorként alkalmazzuk, érdemes lehet megvizsgálni ennek a vektornak a természetes tropizmusát, és nyomokat keresni a viselkedésének előrejelzéséhez. A jelenleg használt Ad26-on alapuló vakcinavektor egy D-fajú vírus, melynek természetes tropizmusa a szem és a gyomor-bél traktus [365]. A D fajú vírusok, beleértve az Ad26-ot is, kevésbé immunogének, mint az Ad5 [366], és kimutatták, hogy a késői endoszomális kompartmentbe szállítanak, valószínűleg késleltetett protein VI-felszabadulást okozva.

Következésképpen a késői endoszómális kompartment savasodásának blokkolása tovább csökkentette annak immunogenitását [113]. Ellentétben az emberi hirdetésekkel, az oltásban és a vektorizálásban is használt nem emberi hirdetések ismerete nagyon korlátozott. A csimpánzból származó hirdetések, beleértve a ChAd3-at is, szoros rokonságban állnak a D faj vírusaival [367 368]. Érdekes módon az Ad5 vektorok immunogénebbek, mint a csimpánzból származó Ad vektorok, és nagyobb a transzdukciós potenciáljuk. Ez a megfigyelés nem volt összefüggésben a penton RGD motívum vagy a szál különbségeivel, és mechanikai oka továbbra is ismeretlen [369]. A kapszidstabilitás lehetséges különbségeit nem vizsgálták. Egy másik vektorként használt, nem emberi hirdetés a 2-es típusú kutyahirdetés (CAV{11}}). Ennek a vektornak az a figyelemre méltó tulajdonsága, hogy szelektíven transzdukálja a neuronokat, de nem veszi körül a gliasejteket, ellentétben az Ad5 kontrollvektorral, annak ellenére, hogy mindkét vektor ugyanazt a receptort használja [370–372]. Ez a képesség összefüggésbe hozható a megnövekedett kapszid stabilitással, ami csak az idegsejtekben teszi lehetővé a bevonat eltávolítását. A kutyák testhőmérséklete ~2 ◦C-kal magasabb, mint az embereké, ami potenciálisan megnövekedett CAV{16}} kapszidstabilitást eredményez [373], hasonlóan az F fajhoz tartozó vírusokhoz. A CAV-2 gyengén vált ki veleszületett immunválaszt, ami összhangban van a célsejtek hatékony szétszedésének hiányával [372]. Így a CAV2 vektorok egy másik példa lehet arra, amikor a természetes tropizmusához vagy gazdaszervezetéhez kapcsolódó biofizikai tulajdonság új vektortulajdonságokat biztosíthat.

4.2. A kapszid szerkezet finomhangolása, a Protein VI példája C fajban Ad2/5

Ha a kapszid stabilitás és a protein VI felszabadulás határozza meg a virális kapszid downstream sorsát, akkor felmerül a kérdés, hogy ez módosítható-e az Ad vektorokban, azaz új tulajdonságokat tulajdoníthatunk-e a vírusvektoroknak (3. ábra). A legtöbb tudásunk arról, hogy az Ads hogyan hatol be az endo-lizoszómális kompartmentbe, az Ad2/5 C típusú vírusokból származik. A fehérje VI, mint membránlítikus faktor felfedezése elengedhetetlen volt e folyamat megértéséhez [103,106]. A Protein VI egy N-terminális amfipatikus hélixet kódol, amely a fehérje tényleges membránlítikus része. A vírustermelés során a VI fehérje prekurzor fehérjeként expresszálódik, amely az amfipatikus hélixen keresztül kapcsolódik a hexon trimerekhez [42,374]. A komplex a VI protein N- és C-terminálisán kódolt transzport szignálokon keresztül importálódik a sejtmagba, amelyeket a vírus összeállítása és érése során eltávolítanak a vírusproteázok. A C-terminális 11 aminosavból álló peptid a proteázt is aktiválja, így intelligens módon összekapcsolható a vírusösszeállítás az amfipatikus hélix árnyékolásával. A Ts1 Ad2/5 mutáns vírusban a proteáz csomagolási hibája van, és a kapszidfehérjék egyike sem kerül feldolgozásra, beleértve a VI-t is. A kapott részecskék hiperstabilak, megtartják a rostokat, és nem juttatják el a VI-t.

Ennek eredményeként a Ts1 részecskék lizoszómákba rendeződnek a receptor által közvetített endocitózis során. A fehérje VI pontos elhelyezkedése az érett vírusban nem világos, de a hasított N-terminális a periperszonális exonok belső hexonfelületén lokalizálódik [37,104,375]. A VI fehérje két pontmutációja, a G33A és az S28C növeli az Ad5 kapszid stabilitását (3A. ábra) [376,377]. Az első mutáns megelőzi a VI fehérje N-terminális proteáz hasítási helyét, és rontja a feldolgozást. A kapott részecskék részben éretlenek, és endoszóma lízishiba jellemzi őket, ami arra utal, hogy a VI protein N-terminálisa stabilizálja a virionon belüli fehérje-fehérje kölcsönhatásokat [376]. A második mutánst azért választottuk ki, mert képes volt intramolekuláris diszulfidhidakat képezni [377].

A vírus részben feldolgozatlan fehérjéket tartalmazott, beleértve a VII fehérjét is, de meglepő módon nem mutatott semmilyen fertőzőképességi hibát, annak ellenére, hogy megnövekedett stabilitása. Nem ismert, hogy valamelyik vírusnak megváltozott-e az immunaktivációs profilja. A VI fehérje másik pontmutációja, amely befolyásolja a vírus sorsát, a protein VI L40Q mutáció, amely közvetlenül az amfipatikus hélixben található (3A. ábra) [378,379]. Az ezzel a mutációval rendelkező vírusok normálisan érnek, de részben hiányosak az endoszóma lízis lépéséhez. A fent említett mutánsokkal ellentétben az L40Q virionok kevésbé stabilak, mint vad típusú társaik. Késleltetés helyett a VI fehérje, valamint a penton idő előtt szabadul fel az L40Q kapszidból. Az L40Q virionok kevésbé fertőzőek, és részleges lizoszóma-válogatásnak vannak kitéve. Az L40Q mutáció azonban nem szünteti meg teljesen a membrán lízisét, és egyes vírusok a citoszolba szöknek, ami az L40Q vektor fertőzőképességének mintegy négyszeres csökkenését eredményezi [379,380]. A megfigyelések arra utalnak, hogy az amfipatikus hélix kölcsönhatásaival hozzájárul a részecske stabilitásához. Nem ismert, hogy az L40Q mutáció megváltoztatja-e az Ad5 vektorok immunogén tulajdonságait, és hogyan. A legújabb megfigyelések arra utalnak, hogy a VI-fehérje felszabadulását a kapszidból a VII-es proteinnel való belső versengés váltja ki az exonok azonos vagy átfedő kötőhelyeiért [375].

Következetesen a VII-es fehérjét nem tartalmazó mutáns vírus nem tud kiszabadulni az endoszómából, és az endoszóma lízisében hibás [58]. A belső kapszid (azaz VI-fehérje) és magfehérjék (azaz V- és VII-fehérje) szerkezeti és dinamikus szerveződésének további megértése a részecskében és a sejtbe jutás során nagyban segít megérteni, hogy mi határozza meg a kapszid (reverzibilis) stabilitását.

Az Ad vektorok immunaktiválásának hatékonyságának szabályozása kiemelten fontos a vakcinák fejlesztése szempontjából, és az antigének MHC-prezentációjának kiterjesztése javítaná az oltóanyag-fejlesztést [381]. Amint korábban említettük, az autofágia szabályozza az immunaktivációt, és peptidekkel táplálja az MHC-t. Az autofágia az egyik legrégebbi sejtes védekező mechanizmus a fertőzésekkel szemben, de az Ads, mint adaptált humán kórokozók nem fejlesztettek ki olyan mechanizmusokat, amelyek elkerülnék az autofágiát a bejutáskor. Ehelyett úgy tűnik, hogy magukévá teszik az autofágia aktiválását, és a felelősséget a fertőzés elősegítésére fordítják. A Protein VI központi szerepet játszik a sejt autofágia válaszának szabályozásában. A VI protein általi adenovírus membrán lízis a galektin 3 és galektin 8 felszaporodásához vezet, amelyeket a sejt veszélyjelzésként ismer fel (3B. ábra) [108,109,382]. Az Ad penetrációs helyek galektinek általi kimutatása szelektív autofágiát aktivál a fertőzött sejtben, amint azt az autofágia receptorok (pl. NDP52 és p62) toborzása és az LC3 punctae képződése illusztrálja [108].

Érdekes módon az Ad5 vektor részecskéinek sikerül kiszabadulniuk a felszakadt endoszómából, és eljuthatnak a sejtmagba. Az autofágia gátlása nem befolyásolja a vírusok fertőzőképességét, de késlelteti genomjuk eljuttatását a sejtmagba, ami azt mutatja, hogy az Ads eltéríti a sejtes gépezetet a haszon érdekében [108]. Az endoszómából való menekülés tehát lehetővé teszi a vírus számára, hogy elkerülje az autofágia általi lebomlását egy aktív folyamaton keresztül. Ezt a folyamatot egy másik protein VI mutáns, az M1 mutáns fedezte fel. Minden emberi hirdetés (és számos nem emberi hirdetés) egy erősen konzervált PPxY peptid motívumot kódol a VI-os proteinben. Az M1 mutánsban ez a motívum PGAA-ra változott (3. ábra) [104]. Mind a vad típusú, mind az M1 mutáns hatékonyan felszabadítja a VI-fehérjét a belépéskor, és az endoszómális membrán felszakadása után autofágiát vált ki. Az M1 mutáns vírus azonban nem tud hatékonyan kijutni a citoszolba, és az EM-felvételek azt mutatták, hogy az M1 mutáns vírusok felszakadt endoszómákba szorulnak, és az autofágia célpontja.

Következésképpen az M1 mutáns vírus erős fertőzőképességi hibával rendelkezik, amely az autofágia farmakológiai és genetikai gátlásával helyreáll. A tanulmány kimutatta, hogy a vad típusú vírusok a PPxY motívumukat használják az ubiquitin ligáz NEDD4.2 toborzására, és elég hosszú ideig korlátozzák az autofagoszómák érését ahhoz, hogy a citoszolba kerüljenek. Ezenkívül ez a tulajdonság lehetővé teszi a vírus számára, hogy korlátozza antigén megjelenését [108]. Fontos, hogy az egerekbe injektált M1 mutáns vektor sokkal erősebb anti-vektor immunitást és csökkent CD8 plusz választ eredményezett a kódolt transzgénre, ami azt mutatja, hogy egy egyszerű kapszid módosítás mélyreható hatással lehet az Ad5 kapszid immunogenitására. Nem ismert, hogy a többi protein VI-mutáció befolyásolja-e az immunogenitást. Azonban a PPxY motívum jelenléte az L40Q vírusban magyarázatot adhat arra, hogy a vektor miért őriz meg viszonylag magas fertőzőképességet a membrán lízis defektusa ellenére [379,380]. Mivel az endoszóma lízis kevésbé hatékony, és az L40Q vektorok részben a lizoszómális kompartmentben kötnek ki, elképzelhető, hogy a kiváltott immunválasz mégis eltér a vad típusú, Ts1 vagy M1 Ad5 kapszidoktól.