A kalpasztatin megakadályozza az angiotenzin II által közvetített podocita sérülést az autofágia fenntartása révén
Mar 17, 2022
további információ:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipont1, Marine Camus1, Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1, He'le`ne Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole He'nique1,Pierre-Louis Tharaux1és Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Párizs, Franciaország; és2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Párizs, Franciaország
A proteinuria erős prediktív értéke krónikus glomeruláris kórképekben szilárdan megalapozott, valamint az angiotenzin II patogén szerepe a glomeruláris betegségek progressziójában, megváltozott glomeruláris fi-filtrációs gáttal, podocita sérülésekkel és a glomerulusok hegesedésével. Itt azt találtuk, hogy a krónikus angiotenzin II által kiváltott magas vérnyomás gátoltautofágiakiáramlás az egér glomerulusaiban. Az Atg5 (egy autofágiában szerepet játszó fehérjét kódoló gén) deléciója specifikusan a podocitában felgyorsult dangio tenzin II által kiváltott podocitopátiát, fokozott albuminuria és glomerulosclerosis kialakulását eredményezte. Ez azt jelzi, hogy az autofágia kulcsfontosságú védelmi mechanizmus a podocitákban ebben az állapotban. Az angiotenzin-II által indukált kalpain aktivitás podocitákban gátoljaautofágiakiáramlás. Az endogén kalpain inhibitor transzgénikus expressziójával rendelkező egerekből származó podocitákcalpastatinmagasabb podociták jelennek megautofágiakiinduláskor, amely rezisztens volt az angiotenzin II-függő gátlással szemben. Emellett tartós autofágia iscalpastatinkorlátozott podocita károsodás és albuminuria. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a magas vérnyomás patogén hatással van a glomeruláris szerkezetre és funkcióra, részben a kalpainok aktiválása révén, ami a podocita autofágia blokkolásához vezet. Ezek az eredmények egy eredeti mechanizmust tárnak fel, amely szerint az angiotenzin II által közvetített magas vérnyomás gátolja az autofágiát a kalpain kalcium által kiváltott felszaporodásával, ami patogén következményekkel jár acalpastatintevékenység. Így megakadályozva a kalpain által közvetített csökkenéstautofágiaígéretes új terápiás stratégia lehet a magas renin-angiotenzin rendszer aktivitással összefüggő nephropathiák kezelésére.
KULCSSZAVAK: angiotenzin II;autofágia; calpastatin; magas vérnyomás; podocita
Fordítási nyilatkozat
Tekintettel az autofágia döntő szerepére a kialakulásábanvesebetegségek, farmakológiai modulációjaautofágiaígéretes stratégia lehet számos betegség megelőzésére és kezelésérevesebetegségek. Ezzel párhuzamosan azt találták, hogy a podocitákban a kalpain aktivitás túlzott aktiválása káros hatással van a podociták működésére, míg káros hatásmechanizmusait nem azonosították. Itt bizonyítékot szolgáltatunk arra, hogy a kalpain összekapcsolja az angiotenzin II káros hatását az angiotenzin II káros blokádjával.autofágiapodocitákban, és arra utalnak, hogy a kalpain-gátlás ígéretes terápiás célpont lehet a podocita betegségekben, részben a podocita autofágia fenntartása révén.
Kattintson ideCistanche deserticola ma krónikus vesebetegségre
A magas vérnyomás a cukorbetegség után a második helyen áll, mint a progresszív krónikus betegségek vezető okavesebetegség1-3, sőt a vérnyomás mérsékelt emelkedése is független kockázati tényező a végstádiumú vesebetegségben.4 Egyre több kísérleti tanulmány tárja fel a podociták fontosságát a vesebetegség kialakulásában.vesesérülés. A kísérletes hypertoniás nephropathiában a vese funkcionális csökkenésével a podociták progresszív elvesztése és a mikrovaszkuláris elváltozások korán jelentkeznek.5 A betegeknél az életképes podociták vizelettel történő kiválasztódása a preeclampsia érzékeny és specifikus markere,6,7 és a nephrosclerosisban szenvedő betegeknél szignifikáns a glomeruláris podociták kisebb sűrűsége, mint korábbanvesedonorok.8,9 Továbbá az angiotenzin II (AngII) glomeruláris betegségek progresszióját elősegítő kórokozó szerepe jól megalapozott, nemcsak hipertóniás állapotokban, hanem számos glomeruláris betegségben is.10–21
A glomeruláris hipertónia a glomeruláris kapillárisok megnyúlását, az endothel károsodását és a glomeruláris fehérje filtrációjának emelkedését eredményezi, ami glomeruláris összeomláshoz és glomerulosclerosishoz vezet. Közvetlen hatást fejt ki a glomeruláris struktúrákra is, és a kompenzációt célzó szabályozó jelzési válaszokat okoz. Az aktivált szisztémás és lokális renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer (RAAS) elősegíti a mezangiális hiperpláziát és a vaszkuláris permeabilitási faktorok szintézisét. Ezzel egyidejűleg a podociták kalcium jelátvitelt mutatnak22,23 és az AngII 1-es típusú receptor (AT1)-függő stimuláció hatására megváltoztatják alakjukat.24–28 Ezek az adaptív mechanizmusok hosszú távon maladaptívvá válnak, végül glomerulosclerosishoz vezetnek. Az AT1 közvetíti a RAAS kiemelkedő szerepét a vérnyomásban, valamint a só és víz homeosztázisában. Az angiotenzin-konvertáló enzim-gátlókat és az AT1-blokkolókat klinikailag alkalmazzák magas vérnyomás és szívelégtelenség kezelésére betegeknél. Érdekes módon mindkét blokkoló védő hatást is mutatvesefunkció.
Kimutatták, hogy az autofágia elengedhetetlen a sejt homeosztázisának fenntartásához, különösen a posztmitotikus sejtekben29, 30 és különösen a podocitákban.31–34Autofágiaegy lizoszómális asszociált degradációs rendszer a hosszú életű citoplazmatikus fehérjékhez és a diszfunkcionális organellumokhoz35, 36, és magában foglalja a fehérjék és organellumok megkötését az autofagoszómákban. Az autofagoszómák kialakulása számos gén indukciójától függ, köztük a Map1lc3a/b, a Beclin 1 és a Tags. 37 Egyre több bizonyíték van arra vonatkozóan, hogy az autofág útvonal diszregulációja szerepet játszik a vese öregedésének patogenezisében és számosvesebetegségek, például akut vesekárosodás, policisztás vesebetegség, öregedés és diabéteszes nefropátia.31,32,38–41
rendeleteautofágiaa podocitákban fiziológiás és mindenekelőtt kóros összefüggésben nem jól ismert. Nemrég kimutattuk, hogy a podocita autofágia fiziológiás körülmények között független a rapamicin (mTOR) szabályozásának mechanisztikus célpontjától, így ez a sejttípus kivétel.42 Az AT1 aktiváció serkenti a fehérjeszintézist és a fehérje forgalmát a sejtekben. Így arra jutottunk, hogy a RAAS aktiválása befolyásolhatja a fehérjeforgalom stimulációját és a proteosztázist is.
Jelen tanulmányban az AngII jelátvitel podocitákban betöltött szerepére összpontosítottunkautofágiaszabályozás. Azonosítottuk azokat a kalcium-aktivált proteázokat, kalpaint, amelyek az AngII krónikus blokkoló hatását közvetítik a podocitákon.autofágia. Továbbá azt találtuk, hogy az endogén calpain inhibitorcalpastatinképes volt megakadályozni az AngII-függő autofágia gátlást és a podocita sérülést magas vérnyomás alatt.
Ezek az eredmények egy eredeti mechanizmust tárnak fel, amellyel az AngII által közvetített magas vérnyomás gátoljaautofágiakalcium által kiváltott kalpain toborzáson keresztül, ami patogén következményekkel jár a kalpasztatin aktivitás miatti egyensúlyhiány esetén.
MÓD
Állatok
CalpastatinA transzgenikus (CSTTg) egereket Dr. E. Letavernier biztosította.43 Az Atg5 gén podocita-specifikus megszakadásával rendelkező egereket (Nphs2.cre Atg5lox/lox) a korábban leírtak szerint31 hoztuk létre az Nphs2.cre egerek44 Atg5lox/lox-szal való keresztezésével. egerek45 a C57BL6/J háttéren. Nphs2.cre Atg5lox/lox egereket és kontroll hím alomtársakat használtak, 10 és 12 hetes kor közöttiek ebben a vizsgálatban. A hipertóniás modellt AngII (Sigma-Aldrich, A9525) sc infúziójával indukáltuk 1 mg/kg/perc dózisban 4-6 héten keresztül, ozmotikus minipumpákkal (Alzet Corp, 2006-os modell). Pumpákat ültettek be sc a háton a lapockák és a csípő közé. Az egerek só-kiegészítést (3% NaCl) kaptak az ételben. Atg5lox/lox (vad típusú [WT]) egereket használtunk kontrollként minden vizsgálatban. A dezoxikortikoszteron-acetát (DOCA) só esetében a nephron redukciós modellel felnőtt hím egereken egyoldali bal nefrektómiát végeztek. Két héttel a nephrectómia után DOC-pelleteket kaptak a 21-day release (Innovative Research of America) sc beültetéssel. A második pelletet 3 héttel az első beültetés után ültettük be. Minden egér ad libitum kapott 0,9 százalékos NaCl-t ivóvízben, és 6 hetes DOC beadás után elpusztultak.46 A kísérleteket a francia állatorvosi irányelvek és az Európai Közösség által a kísérleti állatokra vonatkozóan megfogalmazott irányelvek szerint végezték (L358-86/). 609EEC), és a francia Kutatási Minisztérium és a helyi egyetemi kutatásetikai bizottság (APAFIS-7646 és -22373) hagyta jóvá.
Primer podocita tenyésztési kísérlet
A differenciált primer podocitákat a korábban leírtak szerint tenyésztettük.47,48 Röviden, a frissen izolált vesekéreget kollagenáz I-gyel (Gibco, 17100-017) kevertük össze és emésztettük a Roswell Park Memorial Institute 164-ben0 (Life Technologies, 61870-044). A szöveteket ezután 70 mm-es és 40 mm-es sejtszűrőn (BD Falcon, 352340 és 352350) vezettük át. A 40 mm-es sejtszűrőhöz tapadt glomerulusokat foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0,5 százalékos szarvasmarha szérumalbuminnal (Eurobio, HALALB07-65) nyomás alatt injektálva távolítottuk el, majd kétszer mostuk. a PBS-ben. A frissen izolált glomerulusokat a Roswell Park Memorial Institute 1640-ben (Gibco, 61870036) 10% magzati borjúszérummal és 1% penicillinnel/sztreptomicinnel (Life Technologies, 15140122) kiegészített 6-lyukas edényekbe helyezték, hogy lehetővé tegyék a glomerulusokból a podocitumok eltávolítását. és növekedni. A podocita dúsítást Western blot analízissel ellenőriztük, a korábban leírtak szerint 31, 48, 49 (S1 kiegészítő ábra). A podocitákat bafilomicin A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) nélkül vagy jelenlétében tenyésztettük 4 órán keresztül. Az immunfluoreszcenciás kísérletekhez a primer podocitákat 4 edénycímkére szélesztettük (Dutcher, 055071). A podocitákat ezután 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 10 percig, és immunfluoreszcenciára dolgoztuk fel.
Calpain aktivitási vizsgálat
Az intracelluláris kalpainaktivitást primer podocitákban határoztuk meg a korábban leírtak szerint.50–52 Összesen 100,000 sejtet tenyésztettek ki 24-lyukú szövettenyésztő edényekben a Roswell Park Memorial Institute 1640-ben, kiegészítve 10 százalék magzati magzattal. borjúszérum és 1 százalék penicillin/sztreptomicin. A jelzett tenyésztési periódus után a táptalajt 4 mM CaCl2-t tartalmazó Krebs-Ringer HEPES-hidrogén-karbonát (KRH) oldattal (pH 7,4) 10 mM kalpain-inhibitorral vagy anélkül-1 cseréltük, és az adagolás előtt 10 percig inkubáltuk. 50 mM kalpain szubsztrát N-szukcinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metil-kumarin (Sigma-Aldrich, S6510). 90-perces inkubációs periódus után a kalpainaktivitást az FL fluoreszcencia különbségeként határoztuk meg (360 nm-es gerjesztésnél és 430 nm-es emissziónál mérve) kalpaininhibitorral és anélkül-1.
Western blot
Az elsődleges podocitákat 80 ml radioimmunprecipitációs vizsgálati pufferrel karcoltuk meg, amely foszfatázt és proteáz inhibitort tartalmazott. A fehérjekoncentrációt a BCA Protein Assay Kit-tel (Merck Biochemistry, 71285) mértük. Húsz mikrogramm fehérjét elektroforetizáltunk Criterion XT előregyártott gélen (12% Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). A fehérjéket polivinilidén-difluorid membránra vittük át (Thermo Fischer Scientific, 88518). 5 százalékos tejben 0,1 százalékos Tween trisz pufferoldatban (TBS-T) való blokkolást követően a membránokat nyúl poliklonális anti-LC3-mal (1:1 000, Cell Signaling Technology, 2575), nyúl poliklonális anti-ATG5-tel inkubáltuk. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), tengerimalac poliklonális anti-Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), nyúl poliklonális anti-kalpain 1 domén IV (1:1000, Abcam, ab3 ), nyúl poliklonális anti-kalpain 2 amino-terminális vége az I. doménnek (1:1000, Abcam, ab39165), egér monoklonális IgG1 anti-kalpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), nyúl antipodocin (1:1000, Abcam, ab50339), tengerimalac anti-nephrin (1:500, PROGEN, GP-N2) és patkány monoklonális anti-tubulin (1:5000, Abcam,ab6160) antitest. Mosás után a membránokat torma-peroxidázhoz kapcsolt antitesttel (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077) inkubáltuk. A specifikus jelek kimutatását az ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) segítségével LAS 4000 készüléken (Fuji) végeztük. A számszerűsítéshez az ImageJ szoftverrel (National Institutes of Health) denzitometriás analízist használtunk.
Vérnyomásmérés és fiziológiai felmérés
Az egerek szisztolés vérnyomását farokmandzsetta módszerrel (Visitech Systems Inc., BP-2000) rögzítettük. Minden egérről tíz mérést végeztünk, majd meghatároztuk az átlagértéket. A szisztolés vérnyomást a kiinduláskor (12 hetes korban), majd hetente mértük a kezelési időszak végéig. Valamennyi egeret metabolikus ketrecbe helyeztük, ahol szabadon hozzáférhetett a vízhez egy 6-órás vizeletgyűjtés céljából. A vizelet kreatinin és plazma karbamid koncentrációját spektrofotometriásan elemeztük kolorimetriás módszerrel (Olympus, AU400). A vizelet albumin kiválasztását specifikus enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal mértük az albumin mennyiségi meghatározására egérvizeletben (Crystal Chem, 80630).
Szövettan
Vesebegyűjtöttük és 4% PBS-pufferolt formalinban fixáltuk. A paraffinba ágyazott metszeteket (3- mm vastag) Masson-strichrome-mal megfestettük a vese morfológiájának értékelésére. A vesékben fellépő rendellenességeket az összetevő-rendellenességek jelenléte és súlyossága alapján osztályozták, beleértve a glomerulosclerosis, a mesangialis expanzió, a tubuláris atrófia vagy gipszet és a fibrózist. A szklerotikus glomerulusok arányát legalább 50 glomerulus vak vizsgálatával értékelték.veseszakasz.
Vesemetszetek és primer podociták immunfluoreszcens festése
A rögzített primer podocitákat TBS-T 3 százalékos szarvasmarha szérumalbuminban blokkoltuk, és egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk tengerimalac anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) és nyúl antitestekkel. -zöld FL fluoreszcens fehérje (GFP; 1:500, Abcam, ab290). A TBS-T öblítések után FL fluoroforhoz konjugált másodlagos antitestek szamár anti-tengerimalac IgG AF594-konjugált antitest (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) és szamár anti-nyúl IgG AF488-konjugált antitest Invitrogen, A21206) alkalmaztuk. A képek Zeiss 2 láb hosszúságú fluoreszcens mikroszkóppal, AxioCam HRccamerával és Axiovision 4.3 szoftverrel készültek.
Formalinnal fixált paraffinba ágyazott (FFPE)vese, a metszeteket (3 mm) paraffinmentesítettük és hidratáltuk, és az antigén-kinyerést fűtött citrát pufferben (pH 6) végeztük. A metszeteket ezután Tritonnal 0,1 százalék (Euromedex) permeabilizáltuk, és TBS-T 3 százalékos szarvasmarha szérum albuminnal blokkoltuk, majd egy éjszakán át 4 °C-on antitestinkubáltuk. Kecske anti-nefrint (1:100, PROGEN, GP) használtunk. -N2), tengerimalac anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), nyúl anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kecske anti-podocalyxin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556), és nyúl anti-Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) antitest. A másodlagos antitestek az Invitrogen Alexa488– és Alexa 568–konjugált antitestei voltak. A sejtmagokat kékre festettük Hoechst segítségével. A tárgylemezeket fluoreszcens rögzítőközeggel (Dako, S3023) rögzítettük. A mikrofényképek Zeiss Axiophot fotomikroszkóppal és Axiovision szoftverrel készültek. A Fidzsi-szigeteken félautomata kvantifikációt használtunk a nephrin-pozitív és PODXLþ területek számszerűsítésére glomeruláris metszetenként legalább 30 glomeruluson egérenként. A podocitaszámot a glomeruláris szakaszonkénti WT1þ sejtmagok számaként számoltuk legalább 30 glomeruluson egérenként.
Transzmissziós elektronmikroszkópos eljárás
A vesekéreg kis darabjait (1 mm3) 3 százalékos glutáraldehidben (Electron Microscopy Sciences) rögzítettük 1-3 0 napig, és háromszor mostuk PBS-ben. A mintákat 1%-os ozmium-tetroxidban 0,1 M (Electron Microscopy Science) 0,1 M PBS-ben (pH 7,4) utófixáltuk, és vízzel mostuk. A mintákat alkoholos minőségben és 100 százalékos propilén-oxidban dehidratáltuk (Electron Microscopy Science). A gyanta infiltrációját a következőképpen végeztük: keverjük össze az Epikote 812-t és a propilén-oxidot 1:1 arányban 30 percig, majd az Epikote 812-t és a propilén-oxidot 1:2 arányban keverjük egy éjszakán át szobahőmérsékleten. A mintákat 4 mm-es zselatin kapszulákba ágyaztuk 100 százalékos Epikote 812-ben, és 60 C-ra melegített kemencében polimerizáltuk. Ultravékony metszeteket vágtunk UFC7 ultramikrotommal (Leica MicrosystemsGmbH), és Gilder Grids 200 mesh-re (Electron Microscopy Science) helyeztük el. 7 százalékos uranil-acetáttal (LFG eloszlás) és Reynold-féle ólom-citráttal (LFG) ellenfestették. A mintákat JEM1011 transzmissziós elektronmikroszkópban (JEOL) vizsgáltuk Orius SC1000 CCD kamerával (Gatan), amelyet Digital Micrograph szoftverrel (Gatan) működtettünk a felvétel céljából.
Cisztanche-vesebetegség
Kvantitatív polimeráz láncreakció tömb
A frissen izolált glomerulusokat QIAzol Lysis reagensben (Qiagen) -80 fokon lefagyasztottuk. A fenol alapú módszerrel végzett teljes RNS extrakciót a gyártó ajánlásai szerint dolgoztuk fel. A cDNS-eket az RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) segítségével szintetizáltuk, és a valós idejű polimeráz láncreakciót (PCR) egy Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) segítségével hajtottuk végre RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330) segítségével. . A kvantitatív PCR-lemezeket Applied Biosystems StepOnePlus ciklusgépen futtattuk. Mindegyik tömb minőség-ellenőrzést tartalmaz a reverz transzkripció hatékonyságára és a genomiális DNS-szennyeződésre vonatkozóan. A kvantitatív PCR elemzést a 2-DDCT módszerrel végeztük a GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen.com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) segítségével, és kifejeztük. mint a génexpresszió Log2-szeres változása.
In silico proteomikai elemzés
A kalpain hasítási hely in silico előrejelzését a DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), a GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) és a CaMPDB (http://) segítségével végezték. calpain.org/) online eszközök. Az egérfehérje aminosavszekvenciáját az Uniprot-tól szereztük be (https://www.uniprot.org). Az eredményeket az S1 és S2 kiegészítő táblázatok folytatják.
statisztikai elemzések
Minden grafikon az egyéni értékeket és az átlag±SEM-et ábrázolja. A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism szoftver 9-es verziójával végeztük. A két csoport összehasonlítását parametricStudent t-próbával végeztük, amikor a minták megfeleltek az Anderson-Darling és D'Agostino normalitási teszteknek, valamint a varianciaegyenlőség F tesztjének. Egyébként nem paraméteres Mann-Whitney tesztet használtunk. A több csoport összehasonlítása 1-módszer vagy 2-módú varianciaanalízissel, majd többszörös összehasonlítási teszttel történt Simak korrekciójával. A P < 0.05="" értékeit="" szignifikánsnak="" tekintettük.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
1. ábra|Az angiotenzin II (AngII) D magas sótartalmú étrend (HSD) által kiváltott magas vérnyomás gátolja a glomerulárisautofágia. (a–c) Podocalyxin (PODXL; piros) és P62 (zöld) immunfluoreszcenciája vad típusú (WT) egerek glomerulusaiban (a,a0 ), (b,b0 ) WT egerek 6 hetes AngII þ HSD és (c,c0 ) Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekből, amelyek a P62 felhalmozódását mutatják a podocitákban magas vérnyomás alatt és podocita-specifikus ATG-ben{{1{{12 }}}}hiányos egerek. A nyilak P62þ pontokat jeleznek a WT-ben (a0 ). A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) ellenfestettük. Az ábra-alrészek alapjellel nagyobb nagyítást jeleznek. Rudak=50 mm. d) A P62þ terület kapcsolódó mennyiségi meghatározása a glomeruláris terület százalékában kifejezve. n=4 WT egér és n=5 WT AngII þ HSD-vel és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerek. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Mann-Whitney teszt: *P=0.0159. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.
EREDMÉNYEK
Az AngII D magas sótartalmú étrend által kiváltott magas vérnyomás gátolta a podocita autofágiát
A podociták magas szintűautofágiain vivo, amint azt az erős GFP expresszió mutatja transzgenikus egerekben, ahol a GFP fúziós LC3-mal (GFP-LC3 egerek) az autofágia kulcsmarkere (kiegészítő S2A ábra). Az autofágia egy dinamikus folyamat, állandó autofagoszómák képződésével és az autofagolizoszómák lebomlásával. Az autofagoszómális degradáció blokkolása klorokinnal a GFP pontok felhalmozódását eredményezte, ami magas autofág effluxot jelez a podocitákban (S2A és B kiegészítő ábra). Megerősítette, hogy a GFPþ pontok autofagoszómák, kettős immuno-FL fluoreszcenciával a GFP és az SQSTM1/P62 esetében, amely egy chaperon fehérje degradálódikautofágia(S2C és D kiegészítő ábra). A klorokin kezelés ismét a GFPþ P62þ pontok felhalmozódását idézte elő, ami fontos autofágiás kiáramlást mutatott podocitákban. Végül, a magas autofág effluxot in vitro megőrizték, amint azt a GFP-LC3 egerekből izolált primer podocitákban a GFP és a P62 expressziója, valamint a GFPþ és P62þ pontok erős felhalmozódása mutatja bafilomicin A1 kezelés alatt, amely egy másik blokkoló az autofagoszómális lebomláshoz (S2E-H kiegészítő ábra). .
A magas vérnyomás képességét a podocita autofág válaszok modulálására ezután AngII-vel infundált egerekben, magas sótartalmú diétával (HSD) 6 hétig, valamint nem hipertóniás kontrollokban értékelték. Amint az 1. ábrán látható, az AngII þ HSD P62 felhalmozódást indukált a glomerulusokban, ami erősen felhalmozódott a podocitákban, ami arra utal, hogy az AngII þ HSD felelős a podocitákértautofágiablokád (1a–d ábra). Érdekes módon a P62 felhalmozódása a podocitákban hasonló volt a podocita autofágiára hiányos egerekben megfigyelthez (Nphs2.cre Atg5lox/lox egerek). A hipertónia másik modelljében, a DOC-só modellben szintén megfigyeltük a P62 progresszív felhalmozódását a podocitákban a betegség lefolyása során (S3 kiegészítő ábra).
Az Atg5 specifikusan podocitákban történő deléciója fokozott albuminuriát, podocitaveszteséget és glomeruláris sérülést eredményez az AngII D HSD modellben
Ezután megvizsgáltuk, hogy vajonautofágiaA blokád csak a podocitákban (Nphs2.cre Atg5lox/lox egerek) befolyásolja a glomeruláris károsodást az AngII þ HSD modellben. Először megerősítettük, hogy az Nphs2. cre Atg5lox/lox egerek vérnyomása normális volt, normálisvesefunkciót, és 10 hónapos korig nincs glomeruláris szövettani elváltozás, amint azt korábban közöltük (S4 kiegészítő ábra).32 Ezután az Atg5lox/lox (WT) és az Nphs2. cre Atg5lox/lox egereket AngII-vel infundáltuk HSD-vel 6 hétig. Fontos, hogy a szisztolés vérnyomás hasonló volt a két csoportban az AngII infúziót követően a vizsgálat során (2a ábra), bár a vérnyomás mérésére használt farokmandzsetta módszer nem biztos, hogy képes feloldani a kis vérnyomáskülönbségeket. Az AngII infúzió HSD-vel jelentősen megnövelte a vizelet albumin-kreatinin arányát WT egerekben, és ez a hatás tovább nőtt Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekben (2b. ábra). A hipertóniás Nphs2.cre Atg5lox/lox egerek szignifikánsan megnövekedett glomeruláris szklerózist mutattak a WT alomtársakhoz képest (2c–e ábra). A mért proteinuriával összhangban a fehérjeszerű gipsz és a tubuláris dilatáció szignifikánsan gyakoribb volt az ATG5 podocita hiányában szenvedő egerekben (2f-h ábra).
2. ábra|Az Atg5 deléciója specifikusan a podocitákban az albuminuria jelentős növekedését eredményezi,vesesérülés és podocitaveszteség 6 hetes angiotenzin II (AngII) infúziós D magas sótartalmú diéta (HSD) után. (a) Szisztolés vérnyomás Atg5lox/lox és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekben 36 napos AngII þ HSD alatt. n=9 egér genotípusonként. Az értékek átlag±SEM formában vannak megadva. Kétirányú varianciaanalízis (ANOVA): ns. (b–m) genotípusonként n=10 egér. A (b,g,h,k)-ben az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. (b) AngII þ HSD (folytatás)
2. ábra|(folytatás) az albuminuria drámai növekedését eredményezte az Nphs2-ben. cre Atg5lox/lox egerek összehasonlítva az Atg5lox/lox kontroll egerekkel. Kétutas ANOVA: genotípus, P=0.013; idő, P=0.0018. (c–f) Reprezentatív képek a Masson-féle trikrómmal festett glomerulusszelvényekről Atg5lox/lox kontrollból és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekből 6 hét AngII þ HSD után. Bar =50 mm in (c,d). Bar =100 mm in (e,f). (g,h) Összehasonlítása (g) a szklerotikus glomerulusok arányának és (h) a tubuláris öntvények számának mikroszkopikus mezőnkénti összehasonlításával. Mann-Whitney teszt: **P=0,0026 hüvelyk (h), ***P=0,0003 hüvelyk (g). (i, j) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a Wilm's Tumor 1 (WT1; piros) és a Podocalyxin (PODXL; zöld) expressziójáról Atg5lox/lox kontroll és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerek glomerulusaiban AngII þ HSD után 6 hétig. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Rudak=50 mm. k) A WT1þ sejtek számának meghatározása glomeruláris szakaszonként. Mann-Whitney teszt: **P=0,0029 hüvelyk (l,m). Reprezentatív immunfluoreszcens képek a CD44 (zöld) expressziójáról glomerulusokban Atg5lox/lox kontrollból és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekből AngII þ HSD után 6 hétig. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Rudak=50 mm. (n,o) Reprezentatív transzmissziós elektronmikroszkópos fotomikroszkópos fotomikroszkópos felvételek az Atg5lox/lox kontrollból és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekből származó glomerulusok metszetein AngII þ HSD után 6 hétig, amely a podocita lábfolyamat elhalványulását (nyílhegyek) mutatja hipertóniás Nphs2-ben. cre Atg5lox/lox egerek. Rudak=1 mm. n=3 egér genotípusonként. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.kidney-international.org címen.
3. ábra|A kalpain expressziója és aktivitása podocitákban. (a) A kalpain-1, kalpain-2 és kalpain-4 expressziójának Western blot elemzése az elsődleges podocitákban. A tubulin expresszió normalizálásként szolgál. (b) A kalpainaktivitást angiotenzin II-vel (AngII; 100 nM) kezelt vagy nem kezelt primer podocitákon mértük 24 órán keresztül calpeptinnel (10 mM) vagy anélkül. n=5 független kísérlet. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Egyirányú varianciaanalízis (ANOVA): kezelés, P=0,0035. Sidak többszörös összehasonlító tesztje: *P=0.0128 az AngII-re az alapvonalra, ##P=0.0056 az AngII-re þ calpeptin versus AngII-re. (c) A kalpain aktivitást vad típusú (WT) vagy primer podocitákon mértükcalpastatinAngII-vel (100 nM) 24 órán keresztül kezelt vagy nem kezelt transzgenikus (CSTTg) egerek. n=7 független kísérlet. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Kétutas ANOVA párosítva a kezeléshez: genotípus, P=0.0483. Sidak többszörös összehasonlító tesztje: ***P=0.0009 a WT AngII-re az alapvonalra, *P=0.0420 a CSTTg AngII-re az alapvonalra, #P=0.0424 a WT-re és a CSTTg-re AngII. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.
A glomerulusonkénti podocitaszám szignifikánsan csökkent Nphs2-ben. cre AngII þ HSD-vel kezelt Atg5lox/lox egerek (2i–k ábra). Podocitasérülés Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekben AngII infúzióval þ HSD-vel, még fokális és szegmentális glomerulosclerosisig is fejlődött, amint azt a parietális epiteliális sejt (PEC) aktivációs marker CD44 expressziója mutatja a glomerulusokban (2l és m ábra). Az elektronmikroszkópos elemzés az ATG5-hiányhoz kapcsolódó jelentős változásokat azonosított HSD-vel járó krónikus AngII infúzió során, beleértve a lábfej kiürülését hipertóniás Nphs2-ben. cre Atg5lox/lox egerek. Ezzel szemben a WT egerek podocitáiban még 10 hetes HSD-vel végzett AngII infúzió után is kevés ultrastrukturális hibát találtak (2n és o ábra), ami azt jelzi, hogy a podociták autofágiás aktivitása szükséges az AngII þ HSD által kiváltott károsodásokkal szembeni ellenállásukhoz. Összességében eredményeink azt mutatták, hogy az AngII þ HSD modellbenautofágiaA gátlás súlyosbítja a podocita sérülését és elvesztését, és ezt követően fokális és szegmentális glomerulosclerosist indukál.
Az AngII D HSD aktiválja a kalpain aktivitást a podocitákban, ami hozzájárul az autofágia blokádhoz
Mivel a kalpain aktivitást (i) több sejttípusban aktiválja az AngII, és (ii) több sejtet hasít.autofágiaArra voltunk kíváncsiak, hogy az AngII þ HSD által közvetített autofágia blokád a megnövekedett AngII által kiváltott kalpain aktivitásnak tulajdonítható-e. Először azt találtuk, hogy az elsődleges podociták a kalpainok 3 mindenütt előforduló formáját fejezik ki (3a ábra). Ezután kimutattuk, hogy az AngII stimulálja a calpain aktivitást az elsődleges podocitákban. A kalpain aktivitásának ezt a növekedését egy szelektív kalpaininhibitor blokkolta (3b. ábra). Egy beüthető egeret használtunk kiegészítővelcalpastatintranszgén expressziója (csökkent kalpainaktivitáshoz vezet)43, hogy felmérjük a kalpainok szerepét az AngII þ HSD által közvetítettvesesérülés és autofágia blokád. A CSTTg egerekből származó elsődleges podociták csökkent kalpainaktivitást mutattak az AngII-re adott válaszként, összehasonlítva a kontroll egerek podocitáival (3c. ábra). És így,calpastatina podocitákban a túlzott expresszió csökkentette az AngII által közvetített kalpain aktivációt.
Legközelebb értékeltükautofágiaCSTTg egerek podocitáiban. GFP-LC3 transzgénnel CSTTg egereket hoztunk létre. Az LC3-GFP riporter lehetővé tette az autofagoszómák GFPþ/P62þ pontként történő számlálását. A P62 aggregátumokban halmozódik fel a sejtekben, ha az autofág efflux blokkolva van. Az alapállapotban kevesebb GFPþ P62þ pontot (4a, b és e ábra) és kevesebb P62-felhalmozódást (4c, d és f ábra) számoltunk a CSTTg GFP-LC3 egerek podocitáiban, mint a normál GFP-LC3 egerek podocitáiban. , ami megnövekedett autofágiás effluxra utal a magas kalpasztatint tartalmazó egerek podocitáiban.
4. ábra|Az autofágiás efflux értékelése a podocitákbancalpastatintranszgenikus (CSTTg) egerek. (a,b) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a zöld FL fluoreszcens fehérje (GFP) (zöld) és P62 (piros) expressziójáról 12-hetes GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerek glomerulusaiban. A nyílhegyek GFPþ P62þ autofagoszómákat jeleznek. (c,d) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a P62 (zöld) és a Podocalyxin (PODXL; piros) expressziójáról a glomerulusokban 12-hetes GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerekből. Az ábra-alrészek alapjellel nagyobb nagyítást jeleznek. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Rudak=50 mm. e) A podocitánkénti LC3þ P62þ pontok számának meghatározása. Mann-Whitney teszt: **P= 0.0065. f) A P62þ terület számszerűsítése glomeruláris metszetenként. Mann-Whitney teszt: *P=0.0420. Az (e,f), n=5 GFP-LC3 egér és n=8 CSTTg GFP-LC3 egér. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.
Az autofág efflux az LC3 citoplazmatikus formájának, az LC3-I-nek az autofagoszómálisan hasított és foszfatidil-etanolaminnal kapcsolt LC3 formájává, LC3-II-vé történő átalakulásának mérésével követhető a Western-bloton. . A CSTTg egerekből származó podociták megnövekedett LC3-I-ből LC3-II konverziót és csökkent P62-expressziót mutattak mind bafilomicin A1 jelenlétében, mind hiányában (5a. és b. ábra), ami fokozott autofágiás kiáramlást jelez podociták a calpastatin túlzott expressziójával. Végül, a GFPþ P62þ pontok felhalmozódása a podocitákban klorokin beadása után fontosabb volt a CSTTg GFP-LC3 egerekben, mint a GFP-LC3 egerekben, ami megerősítette, hogycalpastatina túlzott expresszió autofágiás kiáramlást indukál a podocitákban in vivo (5c-e ábra). Összességében adataink arra utalnak, hogy az AngII serkenti a kalpain aktivitást a podocitákban, azazautofágiakalpain gátolja a podocitákban, és az endogén calpain aktivitás gátlása a kalpasztatin túlzott expressziójával elegendő a podociták autofágiás kiáramlásának stimulálásához.
A CSTTg egerek védettek az AngII D HSD által kiváltott podocita sérülésektől
A CSTTg egerek nem mutattak semmitveseváltozás legalább 12 hónapos korig (S5 kiegészítő ábra). Elemeztük a podocita sérülést CSTTg egerekben az AngII þ HSD kezelés során. Bár a WT egerekben enyhe glomerulosclerosis és podocita sérülés alakult ki 4 hetes magas vérnyomás után, amint azt a podocalyxin és a nephrin abnormális expressziója mutatja, a CSTTg egerek kevesebb szklerotikus glomeruláris léziót mutattak (6a és b ábra), és megőrizték a podocalyxin és a nephrin6 c- ábra. . Ilyen különbségeket figyeltek meg a podocita fenotípusban egy olyan szakaszban, amikor a podocita magok sűrűsége nem különbözött a WT és a hipertóniás CSTTg egerek között (6i–k ábra).
5. ábra|Az autofagoszómális degradáció blokkolása megerősítette a podocita autofágikus kiáramlásának növekedésétcalpastatintranszgenikus (CSTTg) egerek. (a) Western blot analízis az LC3, a Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 és az ATG5 expressziójáról vad típusú (WT) vagy CSTTg egerekből származó primer podocitákban. A tubulin expresszió normalizálásként szolgál. A podocitákat bafilomycin A1-gyel (BafA1; 100 nM) kezeltük vagy nem kezeltük 4 órán keresztül a tenyésztés leállítása előtt. (b) Az LC{{10}}II/tubulin és P62/tubulin arányok mennyiségi meghatározása. n=10 WT egér és n=8 CSTTg egér. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Kétirányú varianciaanalízis a kezeléshez párosítva: LC3-II/tubulin esetén: genotípus, P=0.{{30}}008; kezelés, P < 0,0001;="" p62/tubulin="" esetében:="" genotípus,="" p="0.0884;" kezelés,="" p="">< 0,0001.="" sidak="" többszörös="" összehasonlító="" tesztje:="" lc3-ii/tubulin="" esetén:="" ***p="">< 0,0001="" wt="" plusz="" bafa1="" és="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" csttg="" plus="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" a="" wt="" þ="" bafa1="" és="" a="" csttg="" þ="" bafa1="" esetében;="" p62/tubulin="" esetén:="" ***p="">< 0,0001="" a="" wt="" plusz="" bafa1="" esetén="" a="" wt="" þ="" bafa1="" esetében,="" ***p="">< 0,0001="" a="" csttg="" plusz="" bafa1="" esetén="" a="" csttg="" þ="" bafa1="" esetén.="" (c,d)="" reprezentatív="" immunfluoreszcens="" képek="" a="" zöld="" fl="" fluoreszcens="" fehérje="" (gfp;="" zöld)="" és="" p62="" (piros)="" expressziójáról="" 12-="" hetes="" gfp-lc3="" és="" csttg="" gfp-lc3="" egerek="" glomerulusaiban.="" az="" ábra-alrészek="" alapjellel="" nagyobb="" nagyítást="" jeleznek.="" a="" sejtmagokat="" hoechst-tel="" (kék)="" festették.="" rudak="50" mm.="" az="" egereket="" klorokinnal="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" kezeltük="" 4="" órával="" a="" leölés="" előtt.="" a="" nyílhegyek="" gfpþ="" p62þ="" autofagoszómákat="" jeleznek.="" e)="" a="" podocitánkénti="" lc3þ="" p62þ="" pontok="" számának="" meghatározása.="" n="5" egér="" genotípusonként.="" az="" értékek="" egyedi="" diagramok="" és="" átlagok="" formájában="" jelennek="">±SEM. Páratlan t-próba egyenlő SD-vel: *P=0.0302. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.
6. ábra |CalpastatinA túlzott expresszió megakadályozza az angiotenzin II (AngII) D magas sótartalmú diéta (HSD) által közvetített podocita sérülését. (a, b) Reprezentatív képek a Masson-féle trikrómmal festett glomerulusszelvényekről vad típusú (WT) és calpastatin transzgenikus (CSTTg) egerekből 6 hetes AngII þ HSD után. Rudak=50 mm. (c,d,f,g) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a (c,d) podocalyxin (PODXL) és (f,g) nephrin (NPHS1) expressziójáról WT és CSTTg egerekben 6 hetes AngII þ HSD és (e) után ,h) kapcsolódó számszerűsítések. Rudak=50 mm. (i, j) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a Wilm's Tumor 1 (WT1; zöld) és PODXL (piros) expressziójáról WT és CSTTg egerek glomerulusaiban 6 hetes AngII þ HSD után és (k) a WT1 þ számának számszerűsítése. sejt glomeruláris szakaszonként. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Rudak=50 mm. Az (e,h,k) értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. n=9 WT egér és n=7 CSTTg egér. Páratlan t-teszt egyenlő SD-vel: **P=0,0095 in (e), *P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k). A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.
Hasonlóképpen, 6 hét magas vérnyomás után a GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerek podocita sérülést mutattak, de a léziók hangsúlyosabbak voltak a GFP-LC3 egerekben (7. ábra). A vizelet albumin-kreatinin aránya magasabb volt a GFP-LC3 egerekben 4 hét AngII þ HSD után (7a. ábra). A podocitaszám nem különbözött a két genotípus között, de a nephrin expressziója szignifikánsan csökkent a GFP-LC3 (kontroll) egerekben (7b–e ábra). Összefüggésbencalpastatin- közvetített védelem, az ultrastrukturális analízis enyhe és fokális podocita lábfolyamat kiürülést mutatott az AngII þ HSD-vel kezelt GFP-LC3 egerekben, a CSTTg egerek lábfolyamatának jobb megőrzésével, bár a lábfolyamatok számának globális számszerűsítése a glomeruláris alagsorban a membrán (GBM) hossza statisztikailag nem különbözött, valószínűleg azért, mert modellünkben a podocita sérülés fokális és szegmentális (7f – h ábra). Megjegyzendő, hogy a makrofágok és a T-limfociták beszűrődése bejutvesenem különböztek a csoportok között (S6 kiegészítő ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutattákcalpastatinmegakadályozta az AngII þ HSD által kiváltott podocita sérülést.
A calpastatin túlzott expressziója helyreállítja az autofágiás kiáramlást egerek podocitáiban az AngII D HSD kezelés után
Végül azon töprengtünk, vajoncalpastatin-mediált glomeruláris védelem az AngII þ HSD modellben az autofágia fenntartását vonja maga után podocitákban. Érdekes módon a CSTTg és GFP-LC3 CSTTg egerekben megakadályozták az AngII þ HSD által kiváltott P62 felhalmozódását a podocitákban (8a–d ábra), ami azt jelzi, hogy a kalpasztatin megakadályozta a podociták blokádjátautofágia. Megjegyzendő, hogy az autofagoszómák GFPþ P62þ pontjainak száma hasonló volt a hipertóniás GFP-LC3 és GFP-LC3 CSTTg egerek podocitáiban, ami arra utal, hogy az AngII þ HSD inkább a podocita autofág kiáramlás lelassulását indukálta, nem pedig a teljes leállást (8. ábra). g).
A kalpain hasítási helyének in silico előrejelzése podocita fehérjékben
Számos in silico eszközt használtunk a potenciális kalpain célpontok előrejelzésére a podocitákban (S1 és S2 kiegészítő táblázatok). Három online adatbázist hasonlítottak össze: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 és DeepCalpain.56 Az in silico elemzés számos podocita fehérjét azonosított, köztük a nephrint és a podocint, amelyeket a kalpainok hasíthatnak. És így,calpastatinA -mediált glomeruláris védelem összefüggésbe hozható a kalpain enzimaktivitás csökkenésével, ami egyes podocita fehérjék lebomlásához vezet.
Ezenkívül legalább 3autofágiaa rokon fehérjék a kalpainok közvetlen célpontjai. Az ATG5-öt a kalpainok hasítják, ami az ATG12-ATG5 komplex képződésének zavarához vezet.57,58 A kalpaininhibitorok in vivo beadása megakadályozta a Beclin-1 autofágia fehérje hasadását is.59 In silico elemzés az autofágiával rokon fehérjék feltételezett hasítási helye alátámasztja azt a hipotézist, hogy a kalpain az autofágiával kapcsolatos fehérjék enzimatikus hasításán keresztül szabályozhatja az autofágiát.
Cisztanche-vesefunkció
Az endoplazmatikus retikulum (ER) mRNS expressziója és az oxidatív stressz markerek AngII plusz HSD-vel kezelt egerek glomerulusaiban
Az endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt és az oxidatív stresszt kvantitatív PCR-rel értékeltük glomerulusokban az AngII þ HSD kezelés során (1. táblázat). Kiinduláskor nem észleltünk változást a WT és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerek glomerulusaiban elemzett gének mRNS expressziójában (S7 kiegészítő ábra). 6 hét magas vérnyomás után az Nphs2-ből származó glomerulusok. cre Atg5lox/lox egerek eltérő mRNS-profilt mutattak az ER-stressz és oxidatív stresszútvonalak génjeiben a Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 és Hsp90b1 fokozott expressziójával a WT glomerulusokhoz képest, ami arra utal, hogyautofágiaA podociták kimerülése kedvezett az AngII þ HSD által kiváltott ER stressznek és az oxidatív stressznek. Ezzel szemben a CSTTg egerekből származó glomerulusok az ER stressz és az oxidatív stressz útvonalak számos génjének lelassulását, valamint néhány pro-apoptotikus gének expresszióját mutatták (9. ábra).
Összességében ezek az eredmények azt mutatjákcalpastatinA túlzott expresszió megakadályozhatja a glomeruláris károsodást az AngII þ HSD által kiváltott ER és az oxidatív stressz csökkentésével.
VITA
Jelen tanulmányban kimutattuk, hogy az AngII þ HSD által kiváltott hipertóniában a podocita autofágia jelentősen csökkent. Ezenkívül az Atg5 podocita-specifikus deléciójával rendelkező egerek hajlamosabbak voltak az AngII þ HSD által kiváltott glomerulosclerosisra és a podocita elvesztésére, ami azt mutatja, hogyautofágiapodocitákban megakadályozza a hypertoniás nephropathia kialakulását, kiemelve az autofágia kritikus szerepét az AngII þ HSD által kiváltott podocita sérülésben. Keveset tudunk a celluláris autofágiát szabályozó extracelluláris ingerekről, és ezek az eredmények rávilágítanak a podocita autofágia AngII általi patofiziológiai szabályozására.
A legtöbb humán glomerulopathiában a podocita lábfolyamat kiürülése a proteinuriához vezető glomeruláris sérülések ismertetőjele. Az autofágia valószínűleg alapvető szerepet játszik a podocita működésének fenntartásában, mivel ezek a terminálisan differenciált sejtek nagy arányban mutatnakautofágiastressz hiányában is. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az AngII elősegíti az autofágiát azáltal, hogy reaktív oxigénfajtákat hoz létre egy feltételesen halhatatlanná tett egérpodocita sejtvonalban.60 A reaktív oxigénfajok termelése valóban az autofágia általános indukálója számos sejttípusban, és az ilyen eltérések okai a mi megállapításainkkal: homályos. Ez utóbbi vizsgálattal ellentétben rágcsáló primer tenyésztett podocitákat használtunk, amelyek megtartják a podocin és a nephrin expresszióját és in vivo megközelítéseket, és nem egér sejtvonalakat. Megerősítjük azokat a korábbi jelentéseket, amelyek szerint a posztmitózisos podociták szokatlanul magas konstitutív szintet mutatnakautofágia. Az LC3-II megnövekedett mennyiségének mérése AngII stimuláció után lizoszómális inhibitorok jelenlétében vagy hiányában szükséges annak meghatározásához, hogy az autofágiás efflux megnövekedett vagy blokkolt-e. A korábbi tanulmányok figyelmen kívül hagyták ezt a jelenséget.60
7. ábra |CalpastatinA túlzott expresszió megakadályozza az angiotenzin II (AngII) D magas sótartalmú étrend (HSD) által közvetített podocita sérülését zöld FL fluoreszcens protein (GFP) – LC3 egerekben. (a) Az AngII þ HSD az albuminuria drámai növekedését eredményezte GFP-LC3 egerekben a CSTTg (kalpasztatin transzgenikus) GFP-LC3 egerekhez képest. n=8-13 egér genotípusonként. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Kétirányú varianciaanalízis: genotípus, P=0.0429; idő, P=0.0165. Sidak többszörös összehasonlító tesztje: *P=0.0453 GFP-LC3 versus CSTTg GFP-LC3 egereknél a 28. napon. (b,c) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a Wilm's Tumor 1 (WT1; zöld) és a nefrin expressziójáról (NPHS1) (piros) 18-hetes GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerek glomerulusaiban 6 hetes AngII infúzió þ HSD után. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Rudak=50 mm. A (d) NPHS1þ terület glomeruláris szakaszonkénti és (e) a WT1þ sejtek számának meghatározása glomeruláris szakaszonként 18-hetes GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerekben 6 hetes AngII infúzió þ HSD után. n=19 GFP-LC3 egér és n=25 CSTTg GFP-LC3 egér. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Páratlan t-teszt egyenlő SD-vel: **P=0,0010 in (d), P= 0,1158 in (e). (f, g) GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerekből származó glomerulusok transzmissziós elektronmikroszkópos felvételei 6 hetes AngII þ HSD után. A nyilak jelzik a lábfej elhalását. Rudak =1 mm. h) A lábfolyamatok számának meghatározása a glomeruláris alapmembrán (GBM) mikrométerére vonatkoztatva. n=3 egér genotípusonként. Az értékek egyedi diagramokként és átlagos SEM-ként jelennek meg. Mindegyik diagram a GBM mikrométerenkénti podociták átlagos számát mutatja 1 folytonos GBM-en. Páratlan t-próba egyenlő SD-vel: P=0.7512. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.
Itt egy AngII perfúzión és HSD-n alapuló hipertóniás modellt használtunk. A podociták AT1 receptorokat mutatnak, és szabadon szűrt peptideknek vannak kitéve, mint például az AngII.13,16,26,61–65. Feltételezzük, hogy a RAAS-gátlás megfigyelt renoprotektív hatásai – legalábbis részben – ennek a podocita-nak a blokkolásának tulajdoníthatók. konkrét RAAS. Hasonlóképpen, in vivo vizsgálatok megerősítették az AngII hatását a podocita sérülésekre, és az AT1 podocita-specifikus géncélzása azt mutatta, hogy az AT1 receptorok aktiválása a glomerulusban kísérleti lupus nephritis esetén elegendő a felgyorsításhoz.vesehipertónia hiányában sérülés.66,67 Calpain által közvetítettautofágiamodellünkben a diszreguláció a podocitákon történő közvetlen AngII-AT1 jelátvitelhez köthető, vagy a magas vérnyomás következménye. Erre a kérdésre korai választ adhatunk. Valójában a DOC-só modellben P62-felhalmozódást is találtunk a magas vérnyomású egerek podocitáiban (S3 kiegészítő ábra). Ez azt sugallja, hogy ebben a modellben a podocitákban autofágia blokád lép fel, amely feltételezhetően független az AngII-től.68 A kalpainaktivitás és az autofágiás efflux kalpainaktivitással kapcsolatos podocita-sérülését értékelő egerekben szelektíven, AT1-hiányos egerekben a podocitákban történő autofágiás efflux értékelésére lenne szükség annak körülhatárolására, hogy van-e ilyen szabályozás. A podocita autofágia az AngII közvetlen vagy közvetett hatásaitól függ.
8. ábra |Calpastatina túlzott expresszió megakadályozza az angiotenzin II (AngII) D magas sótartalmú diéta (HSD) által kiváltottautofágiaalulszabályozás a podocitákban. (a, b) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a P62 (zöld) és a Podocalyxin (PODXL; piros) expressziójáról a glomerulusokban zöld FL fluoreszcens fehérjéből (GFP) – LC3 és CSTTg (calpastatintranszgenikus) GFP-LC3 egerek 6 hetes AngII þ HSD után. Az ábra-alrészek alapjellel nagyobb nagyítást jeleznek. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Rudak=50 mm. (c,d) A P62þ terület számszerűsítése glomeruláris metszetenként. n=9 vad típusú (WT) egér és n=7 CSTTg egér (c), és n=16 GFP-LC3 egér és n=16 CSTTg GFP-LC3 egér a d) pontban. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Mann-Whitney teszt: **P=0,0033 in (c), **P=0,0011 in (d). (e, f) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a GFP (zöld) és P62 (piros) expressziójáról GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerek glomerulusaiban 6 hetes AngII þ HSD után. Az ábra-alrészek alapjellel nagyobb nagyítást jeleznek. A nyílhegyek GFPþ P62þ autofagoszómákat jeleznek. g) A podocitánkénti LC3þ P62þ pontok számának meghatározása. n=11 GFP-LC3 egér és n=16 CSTTg GFP-LC3 egér. Az értékek egyedi diagramokként és átlag±SEM-ként jelennek meg. Páratlan t-próba egyenlő SD-vel: P=0.1014. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.vese-international.org.
1. táblázat|Egyedi RT2 Profiler PCR tömb
A kalpain-1 és a calpain-2 mindenütt jelenlévő gyulladást elősegítő proteázok, amelyek aktivitását acalpastatinspecifikus inhibitoruk. Valójában a kalpasztatin szelektíven gátolja a kalpaint, és ez idáig egyetlen más proteázt sem. A Calpain aktiválását a közelmúltban kapcsolták összevese69,70 A kalciumcsatorna transzporter tranziens receptor potenciális C6 csatornáról azt találták, hogy Ca2þ/calcineurin aktiváción keresztül aktiválja a calpaint-1 podocitákban. A fokális és szegmentális glomerulosclerosisban szenvedő betegek veséjében megnövekedett a tranziens receptorpotenciál-csatorna C6 expressziója, megnövekedett a kalpain és a calcineurin aktivitása, valamint csökkent a kalpain céltalin-1 expressziója, ami kritikus a podocita citoszkeletális stabilitása szempontjából.71 Tranziens receptorpotenciál csatorna. A C6 közvetlenül kötődik a kalpainhoz-1 és a calpainhoz-2 is. Ez a kölcsönhatás döntő fontosságú a talin{11}} hasításának szabályozásában és a podociták mozgékonyságának szabályozásában.72
A transzgénikus egerek túlzottan expresszálódnakcalpastatinvédettek a vaszkuláris remodelling és az AngII-függő gyulladás ellen73; gyulladás ellen glomerulonephritis,43 szepszis,74 vagy allograft kilökődés75 modellekben; és az életkorral összefüggő gyulladások ellen.76 Ezekben az egerekben a podocita sérülést nem vizsgálták. Peltier et al. kimutatta, hogy túlzott kifejezésecalpastatinmegakadályozta az AngII-függő perivaszkuláris gyulladást a vesékben.43 Így a CSTTg egerekben a vesevédelmet, legalábbis részben, egy gyulladásgátló mechanizmus közvetítheti. Modellünkben értékeltük a makrofágok és limfociták beszűrődését, és nem találtunk szignifikáns különbségetvesegyulladás a CSTTg és a kontroll egerek között a globális elemzés soránveseleukocita infiltráció (S6 kiegészítő ábra).
A calpain a közelmúltban részt vett az autofágia szabályozásában (a közelmúltban Weber et al.53 áttekintette), a kalpain gátlás érdekes és bioprotektív tulajdonságaival diabéteszes kontextusban azáltal, hogy helyreállította a kalpaint.autofágia.77 Itt beszámoltunk arról, hogy a kalpain gátlása révéncalpastatinA túlzott expresszió (i) megakadályozta a podocita sérülését a magas vérnyomás alatt, és (ii) helyreállította az autofágiát a podocitákban, így rávilágított a kalpain aktiválásának új káros szerepére a magas vérnyomás során aautofágia.
Kimutatták, hogy szinte az összes ATG fehérjét hasítják a kalpainok in vitro. 78 Itt azt feltételeztükautofágiahipertóniás CSTTg egerekben a fenntartást a calpain gátlása közvetítette. Hipotézisünk alátámasztására kimutattuk, hogy a CSTTg-ből származó podociták csökkent kalpainaktivitást mutatnak, ha in vitro AngII-vel fertőzték őket (3c. ábra). Megnövekedett ATG5 fehérjeszintet találtunk a CSTTg egerekből származó podocitákban, ami arra utal, hogy a calpasztatin túlzott expressziója megakadályozta a kalpain által közvetített ATG5 hasítást ebben az összefüggésben (5a ábra). Ezzel szemben bebizonyosodott, hogycalpastatin- a kalpain által közvetített gátlás független lehet a proteázaktivitás gátlásától79; így nem zárhattuk ki az autofágia kalpasztin általi szabályozását a kalpain enzimaktivitástól függetlenül.
Összefoglalva, ezek az eredmények feltárták a korábban fel nem ismert szerepétcalpastatina podocita szabályozásábanautofágiaés vezetést nyújtott a podocita túlélést fokozó új terápiás stratégiák vizsgálatához a hypertoniás nephropathiák során.
KÖZZÉTÉTEL
Egyik szerző sem nyilatkozott egymással versengő érdekekről.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Ezt a munkát az Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) és az Université de Paris támogatta. Az IB-t a Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie diplomás ösztöndíja támogatta. Az OL-t az Európai Diabetes Tanulmányozási Alapítvány (EFSD) díján keresztül finanszírozták, amelyet az EFSD/Novo Nordisk Program for DiabetesResearch in Europe támogat, valamint a Société Francophone duDiabète (SFD) támogatása. A BR-t és a CH-t az Európai Kutatási Tanács és az Európai Unió (P-LT) 107037 számú Starting Grant finanszírozta. Az YS-t a Fondation de France diplomás ösztöndíja támogatta.
Köszönjük Elizabeth Hucnak, Nicolas Pereznek, Corina Suldacnak és az ERIU970 csapatának (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Franciaország) az állatok gondozásában és kezelésében nyújtott segítséget, Nicolas Sorhaindonak pedig a biokémiai mérésekért (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat). , Párizs, Franciaország), valamint Alain Schmitt és Jean-Marc Massefor transzmissziós elektronmikroszkópia (Institut Cochin, Párizs, Franciaország). Köszönjük Morgane Le Gall-nak (Cochin proteomikus létesítmény 3P5, Párizs, Franciaország) az in silico elemzésben nyújtott segítségét. Elismerjük Véronique Oberweis, Bruno Pillard és Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Párizs, Franciaország) adminisztratív támogatását.
KIEGÉSZÍTŐ ANYAG
Kiegészítő fájl (PDF)
S1 ábra. Az elsődleges podocita kultúra podocita markereket fejez ki. Western blot analízis az NPHS1 és NPHS2 podocita markerek expressziójáról WT és CSTTg egerekből származó primer podocita tenyészetben. A tubulin (TUBA) terhelési kontrollként szolgál. Genotípusonként n=4 egér képviselője.
S2 ábra. A podocita magas bazális szintjeautofágia. (A, B) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a GFP (zöld) és NPHS1 (piros) expressziójáról GFP-LC3 egerek glomerulusaiban, amelyeket 4 órával a leölés előtt kezeltek CQ-val (80mg/kg). A nyílhegyek GFPþ autofagoszómákat mutatnak. (C,D) Reprezentatív immunfluoreszcenciás képek a GFP (zöld) és P62 (piros) expressziójáról GFP-LC3 egerek glomerulusaiban, amelyeket 4 órával a leölés előtt kezeltek CQ-val (80 mg/kg) vagy nem kezeltek. A nyílhegyek GFPþ P62þ autofagoszómákat mutatnak. (A–D) (0 ) nagyobb nagyítást jelent. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Bar=50 mm. N=4 egér állapotonként (E–H) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a GFP (zöld) és P62 (piros) expressziójáról a GFP-LC3 egerek primer podocitáiban, kezelt (F, H) vagy nem (E, G) ) Bafifilomycin A1-gyel (100 nM) 4 órán át. N=5 egér feltételenként.
S3 ábra. A hipertónia DOC-só modelljében a P62 a podocitákban halmozódik fel. (A-C) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a P62 (zöld) és PODXL (piros) expressziójáról WT egerek glomerulusaiban 2-6 hét DOC-só modell után. (0 ) nagyobb nagyítást jelent. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. Rúd ¼ 50 mm. (D) A P62 terület mennyiségi meghatározása podocita területenként (százalék). N=5–6 egér állapotonként. Egyirányú varianciaanalízis: idő P=0.0059, Sidak többszörös összehasonlító tesztje: D42 versus D14 **P=0.0055, D28 versus D14 P=0.8590.
S4 ábra. Podocytaautofágianélkülözhetetlen a podocita fejlődéséhez. (A) szisztolés vérnyomás, (B) vizelet albumin-kreatinin arány és (C) vér karbamid-nitrogénszintje Atg5lox/lox és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekben. N=5–6 egér genotípusonként. Az értékeket egyedi grafikonok és átlagok formájában mutatjuk be±SEM. Mann-Whitney teszt: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) és P=0.6623 (C). (D-E) Reprezentatív képek a Masson-féle trikrómmal festett glomerulusszelvényekről Atg5lox/lox és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekből. (F-G) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a PODXL (zöld) és WT1 (piros) expressziójáról Atg5lox/lox és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerekben. A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) festették. (D–G) Bar=50 mm. N ¼ 6 egér genotípusonként. (H-I) Reprezentatív mikrofényképek Atg5lox/lox és Nphs2.cre Atg5lox/lox egerek glomerulusainak transzmissziós elektronmikroszkópos metszetein. Bar=1 mm. N=3 egér genotípusonként.
S5 ábra.Calpastatina túlzott kifejezés nem befolyásoljavesefunkció alaphelyzetben. (A) vér karbamid-nitrogén és (B) plazma albumin szintjei 12-hetes GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerekben. N=5 GFP-LC3 és N=6 CSTTg GFP-LC3. Az értékeket egyedi grafikonok és átlagok formájában mutatjuk be±SEM. Mann-Whitney teszt: P=0.6623 (A) és P=0.9307 (B). (C, D) Reprezentatív képek a Masson-féle trikrómmal festett glomerulusszelvényekről GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerekből. (E-H) Reprezentatív immunfluoreszcens képek a PODXL (E, F) és NPHS1 (G, H) expressziójáról GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerekben. (C–H) Bar =50 mm. (I, J) A PODXL és NPHS1 terület társított mennyiségi meghatározása glomeruláris metszetenként. N=5 GFP-LC3 és N=6 CSTTg GFP-LC3. Az értékeket egyedi grafikonok és átlagok formájában mutatjuk be±SEM. Mann-Whitney teszt: P=0.1898 (A) és P=0.8413 (B).
Cisztanche-vesefunkció
S6 ábra.Calpastatina túlzott expresszió nem befolyásolja a globális vesegyulladást. Az F4/80 (A, B) és CD3 (D–E) expressziójának reprezentatív immunhisztokémiája GFP-LC3 és CSTTg GFP-LC3 egerekben 6 hetes angiotenzin II þHSD után. Bar=200 mm. (C, F) Az F4/80 és CD3 terület kapcsolódó számszerűsítése perveseszakasz. N=7 CSTTg GFP-LC3 és N=8 GFP-LC3 egerek. Az értékek egyedi görbékként jelennek meg, és SEM-et jelentenek. Mann-Whitney teszt: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
S7 ábra. Podocytaautofágiadeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
S1 táblázat. A kalpain hasítási helyek in silico prevision. A kalpain hasítási helyeket a podocitákkal kapcsolatos és autofágiával kapcsolatos fehérjékben GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP://calpain.org) és DeepCalpain Predict (http://deepcalpain) segítségével jósolták meg. rákbio. info/help.php). Kiegészítő fájl (Excel)
S2 kiegészítő táblázat. A calpain hasítási helyek in silico prevision teljes fájlja. Calpain hasítási helyeket jósoltak a podocitákkal kapcsolatos ésautofágia- kapcsolódó fehérjék a GPS-CCD-vel (http://ccd. biocuckoo.org), a CaMPDB-vel (http://calpain.org) és a DeepCalpain Predicttel (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). A GPS-CCD és a DeepCalpain Predict minden fehérjéhez újraindul a predikciós hasítási helyek.
IRODALOM
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA és mtsai. A krónikus prevalenciavesebetegség az Egyesült Államokban. JAMA. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C és mtsai. Kit célozzon meg a CKD-szűrés? A cukorbetegség, a magas vérnyomás és a szív- és érrendszeri betegségek hatása. Am J Kidney Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC és mtsai. Az ESRD kockázati tényezői megőrzött becsült GFR-ben albuminuriával és anélkül: a Vese Korai Értékelő Program (KEEP) eredményei. Am J Kidney Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J és munkatársai. Emelkedett vérnyomás és a végstádiumú vesebetegség kockázata azoknál az alanyoknál, akiknél nincs kiindulási vesebetegség. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S és mtsai. A podocita sérülés a Dahl-só-hipertóniás patkányok glomerulopathiájának hátterében, és az aldoszteron-blokkolóval megfordítja. Magas vérnyomás. 2006;47:1084–1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. A vizelet podocita kiválasztódása a preeclampsia markere. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR és mtsai. A podocyturia megelőzi a proteinuriát és a preeclampsia klinikai jellemzőit: longitudinális prospektív vizsgálat. Magas vérnyomás. 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, et al. Podocita veszteség humán hipertóniás nephrosclerosisban. Am J Hipertónia. 2009;22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM és társai. A miRNS-ek intrarenális expressziója hipertóniás nephrosclerosisban szenvedő betegeknél. Am J Hipertónia. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G és munkatársai. Krónikus proteinurikus nephropathiák: kimenetelek és a kezelésre adott válasz 352 különböző vesekárosodásban szenvedő betegből álló leendő kohorszban. Am J Kidney Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. A destabilizált glomerulusokból származó angiotenzin II-függő perzisztens podocitaveszteség a végstádium előrehaladását okozzavesebetegség. Kidney Int. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Az angiotenzin-II receptor blokkolók hatása podocita károsodásra és glomeruláris apoptózisra kísérletes streptozotocin által kiváltott diabéteszes nephropathia patkánymodelljében. Acta Histochem. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG és mások. Az angiotenzin II hozzájárul a podocita károsodáshoz azáltal, hogy növeli a TRPC6 expresszióját egy NFAT által közvetített pozitív visszacsatolási útvonalon keresztül. Am J Pathol. 2011;179:1719–1732.
14. Az EUCLID tanulmányi csoport. A lizinopril randomizált, placebo-kontrollos vizsgálata inzulinfüggő cukorbetegségben és normoalbuminuriában vagy mikroalbuminuriában szenvedő normotensszív betegeknél. Gerely. 1997;349:1787–1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH et al. Proteinuria, a 2-es típusú diabéteszes nephropathiában szenvedő betegek renoprotekciójának célja: a RENTAL tanulságai. Kidney Int. 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Az angiotenzin II által indukált glomeruláris perm szelektivitás változásai podocita diszfunkciót és résrekesz fehérje átrendeződést jelentenek. Semin Nephrol. 2004;24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Az angiotenzin II receptor altípusok jellemzése podocitákban. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ és társai. Proteinuria és a podocita rés rekeszizom fehérje, a nephrin expressziója diabéteszes nephropathiában: az angiotenzin-konvertáló enzim gátlásának hatásai. Diabetologia. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S és mtsai. Az angiotenzin-konvertáló enzim-gátló, az angiotenzin II-receptor antagonista és a kalcium-antagonista hatása a húgyúti podocitákra IgA nefropátiában szenvedő betegeknél. Am J Nephrol. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG és mtsai. Az angiotenzin II növeli a citoszol kalcium aktivitást patkány podocitákban a tenyészetben. Kidney Int. 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C és mtsai. Az angiotenzin-konvertáló enzim gátlásának hosszú távú jótékony hatásai nephrosis proteinuriában szenvedő betegeknél. Am J Kidney Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S és mtsai. Az angiotenzin II növeli az intracelluláris kalcium aktivitást az ép glomerulus podocitáiban.VeseInt. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG és mtsai. Az angiotenzin II modulálja a podociták sejtfunkcióit. Kidney Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E és mtsai. A Stretch az angiotenzin II-AT(1)-függő mechanizmuson keresztül csökkenti a nephrin expresszióját humán podocitákban: a roziglitazon hatása. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Nyújtás, feszültség és adhézió – az aktin citoszkeleton adaptív mechanizmusai podocitákban. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K et al. A lokális szöveti angiotenzin rendszer aktiválása podocitákban mechanikus törzzsel. Kidney Int. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, et al. A ciklikus nyújtóerő szelektíven felszabályozza a transzformáló növekedési faktor-béta izoformákat tenyésztett patkány mezangiális sejtekben. Am J Pathol. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. A podocita károsodás kritikus lépés a glomerulosclerosis kialakulásában az uni nephrectomized-desoxycorticosterone hypertoniás patkányokban. Virchows Archiv. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J és társai. Az autofágia elvesztése csökkenti a hasnyálmirigy béta-sejt tömegét és működését, ami hiperglikémiát eredményez. Cell Metab. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Autofágiafontos a szigetek homeosztázisában és a béta-sejttömeg kompenzáló növekedésében a magas zsírtartalmú étrend hatására. Cell Metab. 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C és mtsai. Az endoteliális sejt és a podocita autofágia szinergikusan véd a cukorbetegség által kiváltott glomerulosclerosis ellen. Autofágia. 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C és mtsai. Az autofágia befolyásolja a glomeruláris betegségek érzékenységét, és fenntartja a podocita homeosztázist az öregedő egerekben. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A et al. Kétféle autofágia a podocitákban vesebiopsziás mintákban: ultrastrukturális vizsgálat. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I és mtsai. A MAP-LC3, egy ígéretes autofagoszómális marker, a podociták PAN nephrosisból való differenciálódása és helyreállítása során kerül feldolgozásra. FASEB J. 2003;17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM és munkatársai.Autofágiaa sejtes önemésztés révén küzd a betegségekkel. Természet. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S et al. A hibás máj autofágia elhízás esetén elősegíti az ER stresszt és inzulinrezisztenciát okoz. Cell Metab. 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionsky DJ. Autofagoszóma képződés: maggépezet és adaptációk. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Tápanyag-érzékelés, autofágia és diabetikus nephropathia. Cukorbetegség. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Autofágia: új terápiás célpont avesebetegségek. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Feltörekvő szerepeautofágiaveseműködésben, betegségekben és öregedésben. Autofágia. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Az autofágia hatása a glomeruláris öregedésre és a betegségekre. Cell Tissue Res. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K et al. A podociták magas alapszintű autofágiát tartanak fenn az mtor jelátviteltől függetlenül. Autofágia. 2020; 16:1932–1948.
43. Peltier J, Bellocq A., Perez J et al. A kalpain aktiválása és szekréciója elősegíti a glomeruláris károsodást kísérleti glomerulonephritisben: bizonyítékokcalpastatin- transzgénikus egerek. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A et al. A Cre rekombináz podocita-specifikus expressziója transzgenikus egerekben. Genesis. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M és mtsai. A bazális autofágia elnyomása idegsejtekben neurodegeneratív betegséget okoz egerekben. Természet. 2006; 441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O és mtsai. A tetraspanin CD9 szabályozza a parietális hámsejtek migrációját és proliferációját, valamint a glomeruláris betegség progresszióját. Nat Commun. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S és mtsai. Az epidermális növekedési faktor receptor elősegíti a glomeruláris sérülést és a veseelégtelenséget gyorsan progresszív félholdas glomerulonephritisben. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A et al. Az endotelin-1 közvetlen hatása a podocitákra elősegíti a diabéteszes glomerulosclerosis kialakulását. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O és mtsai. A nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2. faktora a peroxiszóma proliferátor által aktivált g receptor podocita-specifikus expresszióját irányítja, ami elengedhetetlen a félhold GN-nel szembeni rezisztenciához. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R et al. A T-limfociták által kibocsátott kalpainok hasítják a TLR2-t, hogy szabályozzák az IL-17 expresszióját. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S et al. A kalpain/calpastatinrendszernek ellentétes szerepe van a melanoma növekedésében és metasztatikus terjesztésében. PLoS One. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. A calpainok hozzájárulnak a vaszkuláris helyreállításhoz a glomerulonephritis gyorsan progresszív formájában: externalizációjuk lehetséges szerepe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E és mtsai. Két mérges madár megölése egy csapásra:autofágiaaktiválása a kalpainok gátlásával neurodegeneratív betegségekben és azon túl. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X és mtsai. GPS-CCD: egy új számítási program a kalpain hasítási helyek előrejelzésére. PLoS One. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y et al. CaMPDB: a kalpain és a moduláló proteolízis forrása. Genome Inform. 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J és munkatársai. A kalpain hasítási helyek és a rák mutációi által okozott eltéréseinek pontos előrejelzése. Front Genet. 2019;10:715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I és mtsai. Az Atg5 kalpain által közvetített hasítása az autofágiát apoptózisra váltja. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G és munkatársai. A bazális autofágia szabályozása az ATG5 calpain1 által közvetített hasításával.Autofágia. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L., Adornetto A, et al. A Beclin-1 kalpain által közvetített hasítása és az autofágia deregulációja a retina ischaemiás sérülését követően in vivo. Cell Death Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S et al. Az ANG II elősegítiautofágiapodocitákban. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Az epidermális növekedési faktor receptor transzaktiválása angiotenzin II-vel glomeruláris podocitákban. Nephron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM, et al. Az ANG II AT1 receptor immunhisztokémiai lokalizációja felnőtt patkánybanvesemonoklonális antitest segítségével. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J et al. A renin angiotenzin rendszer funkcionális expressziója humán podocitákban. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F710–F719.
64. Pavenstadt H. Franz Volhard-díj 2000: angiotenzin II jelátvitel a podocitában. Kidney Blood Press Res. 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. A renin-angiotenzin aldoszteron rendszer podocitákban. Semin Nephrol. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J és mtsai. Az angiotenzin II infúzió nephrin expressziós változásokat és podocita apoptózist indukál. Am J Nephrol. 2008; 28:500–507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Az 1-es típusú glomeruláris angiotenzin receptorok fokozzák a vesekárosodást és a gyulladást egér autoimmun nephritisben. J Clin Invest. 2009; 119:943–953.
68. Song K, Stuart D, Abraham N és mások. A csatorna renin összegyűjtése nem közvetít DOCA-só magas vérnyomást vagy vesekárosodást. PLoS One. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D és mtsai. Az endoteliális kalpain kiütés védő szerepe lipopoliszacharidok által kiváltott akutbanvesesérülés a p38-iNOS útvonal gyengülése és a NO/ROS termelés miatt. Exp Mol Med. 2020;52:702–712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. A calpain-10 aktivitása az angiotenzin II által kiváltott aldoszterontermelés hátterében áll egy mellékvese glomás rulosa sejtmodellben. Endokrinológia. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R., Bakker-van Bebber M, et al. A kalcium-dependens proteáz calpain-1 a TRPC6 aktivitását a podocita károsodáshoz köti. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.
72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ és társai. A TRPC6 kötődik és aktiválja a kalpaint, függetlenül annak csatornaaktivitásától, és szabályozza a podocita citoszkeletont, a sejtadhéziót és a mozgékonyságot. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A et al. A calpain/calpastatin rendszer megcélzása új stratégiaként a kardiovaszkuláris remodelling megelőzésére angiotenzin II által kiváltott magas vérnyomásban. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Calpastatinszabályozza a polimikrobiális szepszist a prokoaguláns mikrorészecskék felszabadulásának korlátozásával. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M és mtsai. A calpain/calpastatin egyensúly kritikus szerepe az akut allograft kilökődésben. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S et al. A specifikus kalpain gátlás védi avesegyulladás ellen. Sci Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY, et al. A kalpain gátlás helyreállautofágiaés megakadályozza a mitokondriális fragmentációt a diabéteszes endo the liopathia humán iPSC modelljében. Stem Cell Rep. 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. A magas fehérjék in vitro hasítása sejthalál proteázok által. Autofágia. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M és mtsai. A kalpain-kalpasztatin komplex differenciális szabályozása az L-domén általcalpastatin. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.
