Cistanchefunkciója is vanelősegíti a kollagéntermelést, ami növelheti a bőr rugalmasságát és csillogását és segíthethelyreállítja a sérült bőrsejteket. CistancheFeniletanol-glikozidokA tirozináz aktivitást jelentősen leszabályzó hatással bírnak, a tirozinázra gyakorolt ​​hatás pedig kompetitív és reverzibilis gátlás, ami tudományos alapot adhat a Cistanche fehérítő összetevőinek fejlesztéséhez és hasznosításához. Ezért a cisztanche kulcsszerepet játszik a bőrbenfehérítés. Az tudgátolja a melanin termelésétaz elszíneződés és a fénytelenség csökkentése érdekében; és elősegíti a kollagéntermelést a bőr rugalmasságának és ragyogásának javítása érdekében. A cistanche ezen hatásainak széles körben elterjedt felismerése miatt számos bőrfehérítő termék elkezdett gyógynövényi összetevőket, például a Cistanche-t bejuttatni a fogyasztói igények kielégítésére, így növelve a Cistanche kereskedelmi értékét a bőrfehérítő termékekben. Összefoglalva, a cistanche szerepe a bőr fehérítésében döntő fontosságú. Azantioxidánshatás éskollagéntermelő hatáscsökkentheti az elszíneződést és a fakóságot, javíthatja a bőr rugalmasságát és fényét, ezáltal fehérítő hatást érhet el. Ezenkívül a Cistanche széles körű alkalmazása a bőrfehérítő termékekben azt mutatja, hogy kereskedelmi értékben betöltött szerepét nem lehet alábecsülni.

Kattintson a Organic Cistanche fehérítéshez

További információért:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

A tirozináz a melanintermelés sebességkorlátozó enzime, és ennek megfelelően a hiperpigmentáció gátlásának legszembetűnőbb célpontja. Számos tirozináz-inhibitort azonosítottak, de ezek többségének nincs klinikai hatékonysága, mivel a gomba tirozinázt használták célpontként. Ezért rekombináns humán tirozinázt használtunk egy 50 000 vegyületből álló könyvtár szűrésére, és összehasonlítottuk az aktív szűrési találatokat jól ismert fehérítő összetevőkkel. A hidrokinon és származéka, az arbutin csak gyengén gátolta a humán tirozinázt, fele-maximális gátló koncentrációval (IC50) a millimoláris tartományban, a kojinsav pedig gyenge hatékonyságot mutatott (IC50 > 500 mmol/L). A szűrés során azonosított humán tirozináz legerősebb inhibitorai a rezorcin-tiazol származékok voltak, különösen az újonnan azonosított Thiamidol (Beiersdorf AG, Hamburg, Németország) (izobutil-amido-tiazolil-rezorcin), amelynek IC50 értéke 1,1 mmol/l. Ezzel szemben a thiamidol csak gyengén gátolta a gomba tirozinázt (IC50 =108 mmol/L). Melanocita tenyészetekben a thiamidol erősen, de reverzibilisen gátolta a melanin termelést (IC50 =0,9 mmol/L), míg a hidrokinon irreverzibilisen gátolta a melanogenezist (IC 50 = 16,3 mmol/L). Klinikailag a thiamidol 4 héten belül láthatóan csökkentette az öregségi foltok megjelenését, és 12 hét után néhány öregségi folt már nem volt megkülönböztethető a normál szomszédos bőrtől. A jövőbeli vizsgálatok során fel kell tárni a thiamidol teljes potenciálját az emberi bőr hiperpigmentációjának csökkentésében.

BEVEZETÉS

A melasma, az aktinikus és szenilis lentigines, valamint a gyulladás utáni hiperpigmentáció olyan jelentős kozmetikai problémák, amelyek miatt sok beteg kér orvosi tanácsot. Általában ezek a rendellenességek nagyobb gyakorisággal és súlyossággal érintik a sötétebb bőrszínnel rendelkező populációkat (Stratigos és Katsambas, 2004). A hiperpigmentált rendellenességek kezelésére számos helyi készítmény áll rendelkezésre, amelyek sokféle hatóanyagot tartalmaznak a melanintermelés és/vagy eloszlás csökkentésére. Bár a bőr hiperpigmentációja különböző mechanizmusokkal csökkenthető (Briganti és mtsai, 2003), a tirozináz, a melanintermelés sebességkorlátozó enzimje a hiperpigmentációt gátló szerek nyilvánvaló célpontja (Kanteev és mtsai, 2015; Lee et al., 2014; Ramsden és Riley, 2014). Az irodalomban számos anyagot leírtak tirozináz inhibitorként, de többségüknek nincs klinikai hatékonysága, és jelenleg csak néhány vegyületet használnak helyi bőrgyógyászati ​​termékekben (Chang, 2009; Kim és Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002). ). Ezek közül a kojinsav, a hidrokinon és az arbutin a leggyakoribb (Solano et al., 2006).

A jelenleg használt tirozináz inhibitorok nem kielégítő klinikai hatékonysága nagy, mivel ezeket a vegyületeket csak az Agaricus bisporus (mTyr) gombából izolált tirozinázzal tesztelték (Espin és mtsai, 2000; Garcia-Molina és mtsai, 2005), amely az egyetlen. aktív tirozináz a kereskedelemben könnyen beszerezhető. Az mTyr katalitikus aktivitása és szubsztrátspecifitása szignifikánsan eltér az emlős enzimétől (Hearing et al., 1980). A közelmúltban számos tirozináz háromdimenziós szerkezetét oldották meg, köztük az mTyr (Ismaya et al., 2011), valamint a Streptomyces castaneoglobisporus (Matoba és mtsai, 2006) és a Bacillus megaterium (Sendovski et al.) két bakteriális enzimének szerkezetét. , 2011). Ezzel szemben a humán tirozinázról (hTyr) nagyon kevés kinetikai vagy szerkezeti információ áll rendelkezésre, főként azért, mert jelentős nehézségekbe ütközik a megfelelő mennyiségű hTyr természetes forrásokból vagy heterológ expresszióval történő előállítása. A hTyr-t átmenetileg expresszálták különböző állati sejtvonalakban (Olivares és mtsai, 2002; Schweikardt és mtsai, 2007; Tripathi és mtsai, 1992; Wendt, 2006), de a hozamok mindig túl alacsonyak voltak a kapott eredmények részletes jellemzéséhez. hTyr készítmények. A közelmúltban több csoport hatékonyabb expressziós rendszert fejlesztett ki a hTyr számára (Cordes és mtsai, 2013; Fogal és mtsai, 2015; Lai et al., 2016), de a hTyr háromdimenziós szerkezetére vagy a hTyr kinetikai adataira vonatkozó adatok. A hTyr inhibitorok még mindig hiányoztak.

EREDMÉNYEK

A hTyr gátlása

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1200 mmol/L (2a. ábra).

A hTyr tiamidollal történő gátlásának részletes kinetikai elemzése szigorúan kompetitív típusú gátlást eredményezett, amelynek inhibitorállandója (Ki) 0,25 mmol/L volt (2b. ábra, 1. táblázat). Ez az érték összhangban van a dózis-válasz görbékből becsült IC50 értékkel (1,1 mmol/L) (vö. 2a. ábra), amely a kompetitív gátláshoz körülbelül háromszor nagyobb kell legyen, mint a Ki. A 4-butil-rezorcin (9 mmol/L), a 4-hexil-rezorcin (39 mmol/L) és a 4- fenil-etil-rezorcin (24 mmol/L) Ki-értékei szintén jelentősen magasabbak voltak, mint a A tiamidol Ki értéke (1. táblázat). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a thiamidol tiazolil-amid része sokkal jobban gátolja a hTyr-t, mint a rezorcin három másik származékában (4-butil-, 4-hexil- és {{) található szénhidrogén-oldalláncok. 21}}fenil-etil-rezorcin). Amint megjegyeztük, a hatékonyság jelentősen eltér az mTyr-ben, ahol a 4-butil-rezorcin, a 4-hexil-rezorcin és a 4-fenil-etil-rezorcin, sőt még a kojsav is jobb, mint a tiamidol az enzim gátlásában (táblázat). 1). Így a thiamidolt nem azonosították volna pozitívnak az mTyr-t használó szűrés során, és a 4-fenil-etil-rezorcin hatékonyságát erősen túlbecsülték volna.

Garcia-Jimenez és mtsai. (2016) a közelmúltban arról számoltak be, hogy az mTyr lassan oxidál bizonyos rezorcinolokat, feltéve, hogy az enzim uralkodó metódusát előzőleg oxi- vagy dezoxiformává alakítják olyan adalékok, mint a H2O2 és az aszkorbát, és a reakciót o-difenolok tartják fenn. . Ezért kvantitatív, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás analízist alkalmaztunk (Ito és Wakamatsu, 2015), hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a thiamidol is lehet-e a hTyr szubsztrátja. Normál vizsgálati körülményeink között (azaz a Garcia-Jimenez és munkatársai által említett adalékanyagok hiányában, 2016) a hTyr-rel való inkubálást követő néhány órán belül nem történt kimutatható thiamidol-oxidáció, míg a rododendron ezen időn belül könnyen oxidálódott. (lásd az S1 kiegészítő ábrát online). Így feltételezzük, hogy a Garcia-Jimenez és mtsai. fiziológiás körülmények között nem releváns a Thiamidol és a hTyr esetében.

A melanin termelés gátlása

Ezt követően háromdimenziós emberi bőrmodell segítségével teszteltük ezeknek a vegyületeknek a lehetséges gátló hatásait. Amint azt a tisztított hTyr esetében megfigyeltük, az arbutin csak elhanyagolható hatékonyságot mutatott a melanintermelés gátlásában a MelanoDerm (MatTek Corporation, Ashland, MA) bőrmodellekben (IC50 > 4,000 mmol/L) (2c. ábra) . A kojicsav gátolta a melanintermelést w400 mmol/l-es IC50 értékkel, meglepően meredek dózis-válasz görbét mutatva, a 200 mmol/l alatti koncentrációk pedig csak kismértékben (azaz 150 mmol/l-nél 5 százalékkal) gátolták a melanintermelést. A Rhododendron csak marginális hatást mutatott a melanogenezisre, a látszólagos IC50 gátlási értéke w1200 mmol/l volt. A hidrokinon 15 mmol/l IC50 értékkel gátolta a melanintermelést a MelanoDerm bőrmodellekben, ami arra utal, hogy a tirozináz gátlástól eltérő mechanizmussal rendelkezik. 4-A butilrezorcinol 13,5 mmol/l IC50 értékkel gátolta a melanin szintézist. Ismét a thiamidol volt messze a melanintermelés legerősebb inhibitora a MelanoDerm bőrmodellekben, IC50-értéke 0,9 mmol/l, és az egyrétegű tenyészetekben a thiamidol láthatóan csökkentette a melanin képződést (3a. ábra).

Ezután a hidrokinont és a tiamidolt hosszú távú melanocita egyrétegű tenyészetekben tesztelték, hogy ellenőrizzék a gátlás lehetséges reverzibilitását. Bár 1 mmol/l tiamidol 2 hét után 60 százalék alá csökkentette a melanintermelést, 1 mmol/l hidrokinon csak körülbelül 85 százalékra csökkentette a melanintermelést (3b. ábra). A hatóanyagok nélküli további tenyésztéssel azonban a thiamidollal gátolt melanociták gyorsan újraindították melanintermelésüket, és 1 héten belül elérték a kezelés előtti szintet. Ezzel szemben a hidrokinonnal kezelt sejtek a 2-hetes tenyésztési perióduson belül nem állították vissza teljes melanintermelési kapacitásukat, és a melanintermelés a kezelés előtti szint 85 százalékán folytatódott.

Molekuláris modellezés

A thiamidol lehetséges kötődési módjait a hTyr-hez virtuális dokkolási vizsgálatokkal vizsgálták. A 4a. ábra a hTyr homológiamodelljének aktív helyét mutatja a met-formában, egy dokkolt thiamidol ligandummal a legalacsonyabb energiájú konformációban. A bal oldalon látható a di-réz központ az áthidaló oxigénnel. Csak a megkötött inhibitorral közvetlenül szomszédos aminosavak láthatók. (A maradékok számozása tartalmazza a szignálpeptidet is). A kötőzseb belső felülete a hidrofóbságnak megfelelően a kéktől a hidrofóbig barnáig terjedő skálán van színezve. Bár a di-réz centrum környezete kifejezetten hidrofil, egy erősen hidrofób alzseb főként az I368, V377 és F347 oldalláncaiból áll. Az ábrázolt térbeli orientációban a ligandum aromás gyűrűjének 1-hidroxicsoportja kiterjedt érintkezésbe lép a di-réz centrummal, és a 3-hidroxicsoport részt vesz a hidrogénkötésekben a ligandum oldalláncával. S380 és az M374 karbonilcsoportja. A tiazolilgyűrűt a nem poláris zsebbel való hidrofób kölcsönhatások tartják a helyén (4b. ábra), amelyet aminosavak oldalláncai alkotnak, amelyek többsége különbözik az mTyr és a hTyr között (4c. ábra).

Összehasonlítható eredményeket kaptunk, amikor a thiamidolt a szerkezetileg hasonló TRP1, egy Zn2þ-tartalmú melanogén enzim, amely emberben még ismeretlen funkciójú, nemrég publikált röntgenszerkezetéhez kötötték (Ghanem és Fabrice, 2011; Lai et al., 2017), ami arra utal, hogy hogy a TYRP1 enzimet a thiamidol is gátolja (lásd az S2 kiegészítő ábrát online).

Klinikai vizsgálatok

A thiamidol in vivo hatékonyságát ezt követően olyan klinikai vizsgálatokban vizsgálták, ahol idősek kezelték a bőrükön lévő öregségi foltokat naponta kétszer {{0}},2% tiamidolt tartalmazó formulával, vagy csak kontrollként a vivőanyaggal. A kezelt öregségi foltok már 4 hetes kezelés után szignifikánsan világosabbak voltak, mint a kezeletlen kontroll foltok (5a. ábra). A javulás a kezelés teljes időtartama alatt folytatódott, és 12 hét után néhány öregségi folt már nem volt megkülönböztethető a környező, normálisan pigmentált bőrtől (5b. ábra). Az EpiFlash (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) fényképek látható javulást mutattak az öregségi foltok megjelenésében, és a kezeletlen kontroll foltok változatlanok maradtak (nincs ábrázolva). Egy nyomon követési vizsgálat kimutatta, hogy a 0,1 százalékos thiamidol koncentráció hatékonyan csökkentette az öregségi foltok láthatóságát (lásd az S3 kiegészítő ábrát online).

VITA

A bőr hiperpigmentációjának kezelésének legbiztonságosabb és leghatékonyabb módja a melanintermelés csökkentése a tirozináz aktivitás gátlásával. Az irodalomban leírt legtöbb tirozináz-inhibitor azonban nem rendelkezik klinikai hatékonysággal, ha helyi készítményekbe építik be. Szinte mindegyiket csak mTyr ellen tesztelték (Espin és mtsai, 2000; Garcia-Molina és mtsai, 2005), így bár hatásosak az mTyr ellen, a hTyr gyenge inhibitorainak bizonyult. A kereskedelemben kapható mTyr nem homogén készítmény, hanem több tirozináz izoenzim és kis mennyiségű további enzimaktivitás keveréke, amelyek előre nem látható módon befolyásolhatják a gátlási vizsgálatokat (Pretzler et al., 2017). Az AbPPO3 és AbPPO4 izoenzimek, a kereskedelemben kapható mTyr fő komponensei, olyan aminosavszekvenciákkal rendelkeznek az aktív hely régiójában, amelyek jelentősen eltérnek a hTyr-től (4c. ábra). Mindkét mTyr izoenzim extra hurkot tartalmaz az Asn371 (a hTyr egyik glikozilációs helye) és a Gly372 között. A hTyr-ben a tiamidollal kölcsönhatásba lépő aminosavak közül több (vö. 4b. ábra) nem konzervált az mTyr-ben, például az Ile368, Ser375 és Ser380. A Phe207 szerkezetileg konzervált az mTyr-ben, míg a Phe347 nem. Mivel az enzim-ligandum kölcsönhatások kis változásai is drámai hatással lehetnek a kötődési affinitásra, a hTyr és mTyr eltérő gátlási profilja (az 1. táblázatban összegezve) nem okozott meglepetést.

Ennek a vizsgálatnak a fő célja az arbutin, a hidrokinon és a kojinsav és a különböző rezorcin-származékok hatásának összehasonlítása volt a hTyr katalitikus funkciójára és a melanintermelésre in vivo. A thiamidol kivételével az összes vizsgált anyagot tirozináz-inhibitorként írták le (Kim et al., 2012); jelentett gátló aktivitásaik azonban rendkívül eltérőek. Az orvosi szakirodalomban a hidrokinont tekintik a bőr hiperpigmentációjának kezelési kritériumának, bár súlyos aggályok merülnek fel a biztonságosságával kapcsolatban. Az Európai Unióban tilos a hidrokinon kozmetikai felhasználása, de az Egyesült Államokban továbbra is vény nélkül kapható gyógyszerként, legfeljebb 2 százalék hidrokinont tartalmazó készítményekben árulják. Nemrég az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatósága (2006) aggodalmának adott hangot a hidrokinonnal kapcsolatban; jogerős ítélet azonban még várat magára. Az mTyr hidrokinon gátlására vonatkozó közzétett IC50 értékek 1,1 mmol/l (Kang és mtsai, 2003) és 680 mmol/L (Abu Ubeid és mtsai, 2009) közötti tartományt fednek le. Elemzésünkben a hidrokinon figyelemreméltóan hatástalan volt a hTyr ellen, csak kismértékben gátolta azt, mindössze 50 százalékos gátlást ért el körülbelül 4,000 mmol/l-nél. Bár a hidrokinont az 1990-es évek eleje óta tirozináz inhibitornak tekintették (Palumbo et al., 1991), eredményeink arra utalnak, hogy citotoxikus tulajdonságai fontosabbak, nemcsak a melanocitákra gyakorolt ​​káros hatásai miatt, hanem a melanogenezis gátló hatékonysága miatt is. (Jimbow és mtsai, 1974; Penney és mtsai, 1984; Smith és mtsai, 1988). Ezt a nézetet nem csak a hTyr-rel elért eredményeink és az a tény támasztja alá, hogy a hidrokinon szignifikánsan csökkentette a melanintermelést bőrmodellekben, hanem a melanocita tenyészetekkel végzett kísérleteink is. Itt a hidrokinon csökkentette a melanintermelést, de a kezelt sejtek a hatóanyag eltávolítása után nem nyerték vissza a teljes melanintermelési kapacitást.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmol/L) az arbutin esetében mind a tisztított hTyr, mind a MelanoDerm bőrmodell esetén. Mind az a-arbutin, mind a b-arbutin hatékonyságára vonatkozó adatokat publikáltak (Garcia-Jimenez et al., 2017). Mindazonáltal mindkét vegyület hidrokinon prodrug, biológiai aktivitásuk a hidrokinon molekulából való felszabadulásától függ (Briganti és mtsai, 2003). Az Európai Unió Fogyasztói Termékek Tudományos Bizottsága (2008) kritikus véleményt tett közzé az arbutinról. Mivel a hidrokinon felszabadul a molekulából, az arbutin kozmetikai termékekben való felhasználása nem biztonságos.

A kojsav tirozináz gátlására vonatkozó publikált IC50 értékek 6 mmol/l (Curto és mtsai, 1999) és több mint 100 mmol/L (Jeon és mtsai, 2005) között mozognak. A hTyr inhibitoraként a kojsav sokkal kevésbé hatékony, IC50-értéke körülbelül 500 mmol/l. A kojicsav vegyes típusú gátlást mutat, Ki-értéke 145 mmol/l, ami azt jelzi, hogy kötődik a tirozináz dezoxiformájához (Sun et al., 2014). A MelanoDerm modell kezelésére alkalmazva a kojsav kivételesen meredek dózis-válasz görbét mutat, a relatív gátlás 150 mmol/l melletti 5 százalékról több mint 75 százalékos gátlásra 900 mmol/l mellett (lásd a 2c. ábrát). Ez a tény lehet a fő oka a kojsav in vivo nagyon korlátozott hatékonyságának. A kojinsav biztonságosságát illetően az Európai Fogyasztói Biztonsági Tudományos Bizottság (2012) a kozmetikai összetevőket felülvizsgáló szakértői testület álláspontját osztotta a kozmetikai összetevők felülvizsgálatával foglalkozó szakértői testület (2012). Burnett et al., 2010).

A Rhododendron 2008-ban kapott kvázi gyógyszer státuszt Japánban, és kozmetikai termékek fehérítő összetevőjeként használták. Feltételezték, hogy a tirozináz kompetitív inhibitora. 2013-ban azonban 10 ázsiai országban vonták vissza a rododendron tartalmú termékeket, amikor közel 20,{6}} fogyasztónál alakult ki leukoderma a termékek használata után. Kimutatták, hogy a rododendron nemcsak inhibitora, hanem szubsztrátja is a hTyr-nek (Ito et al., 2014a) és az mTyr-nek (Ito et al., 2014b). Az endoplazmatikus retikulum stressz tirozináz-függő felhalmozódása és/vagy az apoptotikus útvonal aktivációja hozzájárulhat a rododendron melanocita citotoxicitásához (Sasaki et al., 2014).

A 4-szubsztituált rezorcinmotívum egy ideje ismert, hogy hatékony kémiai egység, amely gátolja a tirozinázt (Khatib et al., 2005). Számos fehérítőszerként azonosított természetes vegyület, főleg a flavonoidok, tartalmazzák ezt a motívumot (Shimizu et al., 2000, 2011). Mivel a flavonoidok biohasznosulása általában alacsony, célunk a jobb hatékonyságú és biológiailag hasznosítható rezorcin-származékok azonosítása volt. 4-A butilrezorcint már az egér és a humán tirozináz inhibitoraként azonosították (Kim és mtsai, 2005; Kolbe et al., 2013), valamint az egér TYRP1 dihidroxi-indol-karbonsav-oxidáz aktivitását (Katagiri et al. , 2001), és kereskedelmi forgalomban kapható a hiperpigmentáció orvosi és kozmetikai kezelésére (Bohnsack és mtsai, 2012; Jimenez és Garcia-Carmona, 1997; Kim és mtsai, 2005). Ennek ellenére a 4-butil-rezorcin részletes kinetikai adatai még mindig hiányoztak. A hTyr assay-ben a 4-butil-rezorcin szigorúan kompetitív gátlási típusát találtuk 9,1 mmol/L Ki értékkel, ami kiváló összhangban van a meghatározott IC50 értékkel (1. táblázat).

In vitro kísérleteinkben a thiamidol volt a leghatékonyabb az összes vizsgált anyag közül, 1,1 mmol/l-es IC50-értékével a hTyr enzimvizsgálatban és 0,9 mmol/l-es értékével a MelanoDerm bőrmodellben. További kísérletek megerősítették, hogy a thiamidol szigorúan kompetitív inhibitor (2b ábra), és nem szubsztrátja a tirozináznak (lásd az S1 kiegészítő ábrát), és így a thiamidol nem alakul át toxikus és potenciálisan leukodermát indukáló kinonná. Ezért a tiamidolt választották ki klinikai vizsgálatokhoz, hogy értékeljék hatékonyságát in vivo. A thiamidolról egy spot applikátorral végzett vizsgálat folyamatos javulást mutatott az öregségi foltok megjelenésében a teljes 12-hetes kezelési időszak alatt, statisztikailag szignifikánsan már 4 hét után. Ezek az eredmények a Thiamidol teszttermék erős pigmentcsökkentő hatását és egyértelmű klinikai előnyöket mutatnak a bőr hiperpigmentációjának kezelésében.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Humán tirozináz

A hTyr katalitikus doménjét tartalmazó hTyr csonkolt, His-címkézett formáját (hTyr-DHis) HEK 293 sejtekben expresszáltuk, és fémaffinitás kromatográfiával tisztítottuk Ni2þ-Sepharose-on (GE Healthcare, München, Németország), amint azt máshol leírtuk ( Cordes et al., 2013). A kapott készítmény ugyanazokkal a katalitikus tulajdonságokkal rendelkezik, mint a vad típusú hTyr.

Az inhibitorok forrásai

Az Evotec vegyületkönyvtárából (Evotec, Hamburg, Németország) 50,000 vegyületet választottunk ki, amelyek széles kémiai teret fednek le, hogy elvégezzék a hTyr-inhibitorok HTS-ét, amelyet a következő részben ismertetett Tyr-vizsgálattal értékeltek ki. Ezután az ígéretes ólomvegyületek származékait szintetizálták a további optimalizálás érdekében. A többi inhibitort különböző beszállítóktól vásárolták (a részletekért lásd a Kiegészítő anyagokat online).

Tirozin vizsgálat és HTS eljárás

Az L-dopa oxidáz aktivitásának és az alkalmazott HTS szűrési eljárásoknak teljes részletei a Kiegészítő anyagokban találhatók.

Molekuláris modellezés

Az in silico dokkolás a hTyr új homológiamodelljén alapult, amelyet máshol ismertettek (Mann et al., 2017). A szimulációkat Molegro Virtual Docker (Molegro, Aarhus, Dánia) segítségével végeztük. A Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA) a vizuális adatok elemzésére és bemutatására szolgált. A szekvenciákat az UniProt adatbázisból vettük (UniProt Consortium, 2017).

Bőrmodell vizsgálatok

A bőrmodellként használt MelanoDerm szövetek és melanintartalmuk n mennyisége a Kiegészítő anyagokban található.

Melanocita tenyészetek

A melanocita tenyészetekről és azok melanintartalmának mennyiségi meghatározásáról a Kiegészítő anyagokban olvashat részletesebben.

Klinikai vizsgálatok

Két randomizált in vivo vizsgálatot végeztek (vak a teszttermékekre, nyitottak a kezeletlen kontrollra). Egy vizsgálatba 18 női alanyt (56-71 évesek) vontak be, és 17 alany fejezte be a vizsgálatot. A második vizsgálatban 19 alany vett részt (18 nő, 1 férfi; 58e7{{10}} éves), és mind a 19 alany befejezte a vizsgálatot. Minden alany naponta kétszer két különböző készítményt alkalmazott voláris alkarjuk öregségi foltjaira egy folt applikátor segítségével. A készítmények csak a hatóanyag tekintetében különböztek: az első vizsgálatban 0,2% thiamidol és vivőanyag, a második vizsgálatban 0,1% thiamidol és vivőanyag. Alanyonként egy korfoltot kezeltünk a hatóanyagot tartalmazó tápszerrel, a kontrollfoltot pedig csak a vivőanyaggal. Az öregségi foltok pigmentációját a kiegészítő anyagokban leírtak szerint elemeztük. Az in vivo vizsgálatokat a Helsinki Nyilatkozat aktuális változatának ajánlásai és a Jó Klinikai Gyakorlat Harmonizációs Konferenciája irányelvei szerint végeztük. Ezekben a vizsgálatokban minden résztvevő írásos beleegyezését adta. Ezenkívül a tanulmányokat a Beiersdorf AG (Hamburg, Németország) intézményi felülvizsgálati bizottsága hagyta jóvá és engedélyezte.

ÉRDEKÜLÉKENYSÉG

KIEGÉSZÍTŐ ANYAG

A kiegészítő anyag a lap online változatához kapcsolódik.

IRODALOM

1. Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, Hantash BM. Rövid szekvenciájú oligopeptidek gomba és humán tirozináz elleni gátló hatással. J Invest Dermatol 2009;129:2242e9.

2. Bohnsack K, Koop U, Hiddemann S, Kolbe L, Rippke F. Hat új, 4-n-butil rezorcint tartalmazó arcápoló készítmény pigmentációt csökkentő hatékonysága és tolerálhatósága, poszter sz. P864. A poszter bemutatása az EADV 21. kongresszusán, 2012. szeptember 27-30.; Prága, Csehország.

3. Briganti S, Camera E, Picardo M. Kémiai és műszeres megközelítések a hiperpigmentáció kezelésére. Pigment Cell Res 2003;16:101e10.

4. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, Hill RA, Klaassen CD, Liebler DC, et al. A kozmetikumokban használt Kojic sav biztonsági értékelésének zárójelentése. Int J Toxicol 2010;29 (6. melléklet). 244Se73.

5. Chang TS. A tirozináz inhibitorok frissített áttekintése. Int. J. Mol. Sci. 2009; 10: 2440-75.

6. Chen QX, Ke LN, Song KK, Huang H, Liu XD. A hexilrezorcin és a dodecil-rezorcin gátló hatása a gomba (Agaricus bisporus) tirozinázra. Protein J 2004;23:135e41.

7. Cordes P, Sun W, Wolber R, Kolbe L, Klebe G, Ro¨m KH. Nem melanogén rendszerekben történő expresszió és a humán tirozináz oldható változatainak tisztítása. Biol. Chem. 2013; 394:685-93.

8. Curto EV, Kwong C, Hermersdo¨rfer H, Glatt H, Santis C, Virador V és társai. Az emlős melanocita tirozináz gátlói: gentizinsav alkil-észtereinek in vitro összehasonlítása más feltételezett inhibitorokkal. Biochem Pharmacol 1999;57:663e72.

9. Espin JC, Varon R, Fenoll LG, Gilabert MA, Garcia-Ruiz PA, Tudela J et al. A gomba tirozináz szubsztrátspecifitásának és mechanizmusának kinetikai jellemzése. Eur J Biochem 2000;267:1270e9.

10. Fogal S, Carotti M, Giaretta L, Lanciai F, Nogara L, Bubacco L, Bergantino E. Humán tirozináz termelődött rovarsejtekben: a mérföldkő az új gyógyszerek szűrésében, amelyek az aktivitását célozzák. Mol Biotechnol 2015;57:45e57.

11. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Action of tyrosinase on alfa and beta-arbutin: A kinetic study. PLoS One 2017;12:e0177330.

12. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F. A tirozináz rezorcinolokra gyakorolt ​​hatásának jellemzése. Bioorg Med Chem 2016;24:4434e43.

13. Garcia-Molina F, Hiner AN, Fenoll LG, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F és mások. Gomba tirozináz: kataláz aktivitás, gátlás és öngyilkosság inaktiválása. J Agric Food Chem. 2005;53:3702e9.

14. Ghanem G, Fabrice J. Tirozinázzal rokon protein 1 (tyrp1/gp75) humán bőr melanómában. Mol Oncol 2011;5:150e5.

15. Meghallgatás VJ Jr, Ekel TM, Montague PM, Nicholson JM. Emlős tirozináz. Sztöchiometria és reakciótermékek mérése. Biochim Biophys Acta 1980; 611:251e68.

16. Ismaya WT, Rozeboom HJ, Weijn A, Mes JJ, Fusetti F, Wichers HJ, Dijkstra BW. Az Agaricus bisporus gomba tirozináz kristályszerkezete: a tetramer alegységek azonossága és kölcsönhatás a tropolonnal. Biochemistry 2011;50:5477e86.

17. Ito S, Gerwat W, Kolbe L, Yamashita T, Ojika M, Wakamatsu K. Human tyrosinase can oxidize mindkét enantiomer of rhododendron. Pigment Cell Melanoma Res 2014a;27:1149e53.

18. Ito S, Ojika M, Yamashita T, Wakamatsu K. A rododendron tirozináz által katalizált oxidációja 2-metilkrománt-6, 7-diont termel, a feltételezett végső mérgező metabolitot: a melanocita toxicitás következményei . Pigment Cell Melanoma Res 2014b;27:744e53.

19. Ito S, Wakamatsu K. Egy kényelmes szűrési módszer a fenolos bőrfehérítő tirozináz inhibitorok megkülönböztetésére a leukodermát kiváltó fenoloktól. J Dermatol Sci 2015;80:18e24.

20. Jeon SH, Kim KH, Koh JU, Kong KH. A tirozináz l-Dopa oxidációjának gátló hatásai bőrfehérítő szerek által. Bull Korean Chem Soc 2005;26:1135e7.

21. Jimbow K, Obata H, Pathak MA, Fitzpatrick TB. A hidrokinon általi depigmentáció mechanizmusa. J Invest Dermatol 1974;62:436e49.

22. Jimenez M, Garcia-Carmona F. 4-szubsztituált rezorcinok (szulfit-alternatívák), mint a tirozináz katekoláz aktivitásának lassú kötődésének gátlói. J Agric Food Chem. 1997;45:2061e5.

23. Kang HH, Rho HS, Hwang JS, Oh SG. Alkoxi-benzoátok vagy alkoxi-cinnamát depigmentáló aktivitása és alacsony citotoxicitása tenyésztett melanocitákban. Chem Pharm Bull (Tokió) 2003;51:1085e8.

24. Kanteev M, Goldfeder M, Fishman A. Struktúra-funkció korrelációk tirozinázokban. Prot Sci 2015;24:1360e9.

25. Katagiri T, Okubo T, Oyobikawa M, Futaki K, Shaku M, Kawai M és társai. Az 4-n-butil-rezorcin gátló hatása a melanogenezisre és bőrfehérítő hatása. J Soc Cosmet Chem Jpn 2001;35:42e9.

26. Khatib S, Nerya O, Musa R, Shmuel M, Tamir S, Vaya J. Chalcones as potent tyrosinase inhibitors: the fontos of a 2,4-substituted resorcinol moiety. Bioorg Med Chem 2005;13:433e41.

27. Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK és társai. Az 4-n-butil-rezorcin gátló hatásai a tirozináz aktivitásra és a melaninszintézisre. Biol Pharm Bull 2005;28:2216e9.

28. Kim H, Choi HR, Kim DS, Park KC. Helyileg alkalmazható hipopigmentált szerek pigmentzavarok kezelésére és hatásmechanizmusaik. Ann Dermatol 2012;24:1e6.

29. Kim YJ, Uyama H. ​​Tirozináz inhibitorok természetes és szintetikus forrásokból, szerkezet, gátlási mechanizmus és a jövő perspektívája. Cell Mol Life Sci 2005;62:1707e23.

30. Kolbe L, Mann T, Gerwat W, Batzer J, Ahlheit S, Scherner C és munkatársai. 4-n-butil-rezorcin, nagyon hatékony tirozináz-gátló a hiperpigmentáció helyi kezelésére. J Eur Acad Dermatol Venereol 2013;27: 19e23.

31. Lai X, Soler-Lopez M, Wichers HJ, Dijkstra BW. Szerkezeti vizsgálatokra alkalmas humán tirozináz nagyléptékű rekombináns expressziója és tisztítása. PLoS One 2016;11:e0161697. 32. Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez M, Dijkstra BW. A humán tirozinázzal rokon fehérje 1 szerkezete feltár egy binukleáris cink aktív helyet, amely fontos a melanogenezis szempontjából. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:9812e5.

33. Lee SY, Baek N, Nam TG. Természetes, félszintetikus és szintetikus tirozináz inhibitorok. J Enzyme Inhib Med Chem. 2014;31:1e13.

34. Mann T, Gerwat W, Wenck H, Ro¨hm KH, Kolbe L. Isobutilamido tiazolil rezorcin, a humán tirozináz új erős inhibitora. Pigment Cell Melanoma Res 2017:e85.

35. Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Kristályos bizonyítékok arra vonatkozóan, hogy a tirozináz kétmagvú rézcentruma FL rugalmas a katalízis során. J. Biol. Chem. 2006; 281:8981e90.

35. Nesterov A, Zhao J, Minter D, Hertel C, Ma W, Abeysinghe P és munkatársai. 1-(2,4- dihidroxi-fenil)-3-(2,4-dimetoxi-3-metil-fenil)propán, egy új tirozináz-inhibitor, erős depigmentáló hatással. Chem Pharm Bull (Tokió), 2008;56:1292e6.

36. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Az emlős tirozináz fémkofaktor-kötésében és sztereospecifikus szubsztrátfelismerésében részt vevő aktív hely maradékok azonosítása. A katalitikus ciklus következményei. Biochemistry 2002;41:679e86.

37. Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G. A melanogenezis hidrokinonos gátlásának mechanizmusa. Biochim Biophys Acta 1991; 1073:85-90.

38. Penney KB, Smith CJ, Allen JC. A hidrokinon depigmentáló hatása az alapvető sejtfolyamatok megzavarásától függ. J Invest Dermatol 1984;82:308e10.

39. Pretzler M, Bijelic A, Rompel A. A funkcionális gomba tirozináz (AbPPO4) heterológ expressziója és jellemzése. Sci Rep 2017;7:1810.

40. Ramsden CA, Riley PA. Tirozináz: az aktív hely négy oxidációs állapota és ezek jelentősége az enzimatikus aktiválás, oxidáció és inaktiváció szempontjából. Bioorg Med Chem 2014;22:2388e95.

41. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. Tirozináz gátlás, általános és alkalmazott szempontok. J Enzyme Inhib Med Chem. 2002;17:207e18.

42. Sasaki M, Kondo M, Sato K, Umeda M, Kawabata K, Takahashi Y és mások. A rododendron, egy depigmentációt indukáló fenolos vegyület, melanocita citotoxicitást fejt ki tirozináz-függő mechanizmuson keresztül. Pigment Cell Melanoma Res 2014;27:754e63.

43. Schweikardt T, Olivares C, Solano F, Jaenicke E, Garcia-Borron JC, Decker H. Az emlős tirozináz aktív helyének háromdimenziós modellje, amely a funkciómutációk elvesztését veszi figyelembe. Pigment Cell Res 2007;20:394e401.

44. Fogyasztói termékek tudományos bizottsága. Vélemény a b-arbutinról; 2008 (Hozzáférés: 2017. november 21.).

45. Fogyasztóvédelmi Tudományos Bizottság. Vélemény a kojsavról; 2012 (Hozzáférés: 2017. november 21.).

46. ​​Sendovski M, Kanteev M, Ben-Yosef VS, Adir N, Fishman A. Az aktív bakteriális tirozináz első struktúrái a réz plaszticitását mutatják. J Mol Biol 2011;405:227e37.

47. Shimizu K, Kondo R, Sakai K. A tirozináz gátlása flavonoidokkal, sztilbénekkel és kapcsolódó 4-szubsztituált rezorcinokkal: szerkezet-aktivitás vizsgálatok. Planta Med 2000;66:11e5.

48. Shimizu MM, Melo GA, Brombini Dos Santos A, Bottcher A, Cesarino I, Arau'jo P és társai. A polifenol-oxidáz enzimjellemzése, izolálása és cDNS-klónozása három kereskedelmi szempontból fontos faj pálma szívében. Plant Physiol Biochem 2011;49:970e7.

49. Smith CJ, O'Hare KB, Allen JC. A hidrokinon szelektív citotoxicitását melanocita eredetű sejtekre a tirozináz aktivitás közvetíti, de független a melanintartalomtól. Pigment Cell Res 1988;1:386e9.

50. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hipopigmentáló szerek: frissített áttekintés a biológiai, kémiai és klinikai szempontokról. Pigment Cell Res 2006;19:550e71.

51. Stratigos AJ, Katsambas AD. A hiperpigmentáció ellenszegülő rendellenességeinek optimális kezelése sötét bőrű betegeknél. Am J Clin Derm 2004; 5: 161e8.

52. Sugimoto K, Nomura K, Nishimura T, Kiso T, Sugimoto K, Kuriki T. Syntheses of a-arbutin-a-glycosides and their inhibity effects on human tyrosinase. J Biosci Bioeng 2005;99:272e6.

53. Sun W, Wendt M, Klebe G, Ro¨m KH. A tirozináz gátlási kinetika értelmezéséről. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;29:92e9.

54. Tripathi RK, Hallás VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. A humán tirozináz katalitikus aktivitásának mutációs feltérképezése. J. Biol. Chem. 1992;267:23707e12.

55.UniProt Konzorcium. UniProt: az univerzális fehérje tudásbázis. Nucleic Acids Res 2017;45:D158e69.

56. Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság, Egészségügyi és Humánszolgáltatási Minisztérium. Bőrfehérítő gyógyszerkészítmények vény nélkül kapható emberi használatra; javasolt szabály. 71 Federal Register 51146-5115521 (kodifikálva: 21 CFR Part 310); 2006.

57. Vielhaber G, Schmaus G, Jacobs K, Franke H, Lange S, Herrmann M és társai. 4-(1-fenilmetil)1,3-benzoldiol: új, rendkívül hatékony halványítószer. Int J. Cosmet Sci 2007;29:65e6. 58. Wendt M. Rationales design neuer tirozinase-inhibitoren. Ph.D. tézis. Marburg, Németország: University of Marburg Medical School; 2006.

59. Ying YH, Lee SJ, Chung MH, Ying HJ, Suk JL, Myung HC stb. Az aloezin és az arbutin szinergikusan gátolja a tirozináz aktivitást egy eltérő hatásmechanizmuson keresztül. Arch Pharm Res 1999;22:232e6.

További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501