Az emelkedett neutrofil-limfocita arányú érsebészeti betegeknél a neutrofil komplement RNS expressziója lecsökkent

Az elektív vaszkuláris műtéten (EVS) átesett betegek emelkedett neutrofil-limfocita aránya (NLR) megnövekedett mortalitást jelent, függetlenül a perioperatív műtéti eredményektől. Annak érdekében, hogy megértsük, miért kapcsolódik a magas NLR magasabb mortalitáshoz, megvizsgáltuk a neutrofil és limfocita transzkriptom expresszióját az EVS-en átesett betegekben. Vérmintákat vettünk az EVS-en átesett betegektől és egészséges donoroktól az NLR kiszámításához. Az RNS mintákat a betegek neutrofiljeiből és limfocitáiból izoláltuk, és NLR_Low (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Bevezetés

A szív- és érrendszeri betegségek (CVD) a vezető halálokok világszerte. Ez nagyrészt az atherogenezisnek és az érelmeszesedésnek köszönhető, amelyet az egyéni genetika és az étrend mellett gyulladásos és immunmechanizmusok is közvetítenek.1-3 Az utóbbi időben a differenciált leukocitaszám (neutrofilek és limfociták) került a fókuszba. a kardiovaszkuláris (CV) kimenetelek előrejelzésére. Az abszolút neutrofil-limfocitaszám (NLR) arányát a teljes mortalitás előrejelzőjeként ismerték fel több kisebb vizsgálatban, amelyek akut koszorúér-beavatkozásokkal,4-6 magas vérnyomással,7,8 és szívelégtelenséggel foglalkoztak.9

1. táblázat Az RNS-szekvenciával vizsgált elektív érsebészeti betegek klinikai jellemzői

Korábbi vizsgálatok azt is kimutatták, hogy az NLR a perifériás érbetegségben szenvedő betegek hosszú távú kimenetelének előrejelzője.{1}} Az érsebészeti betegek populációira vonatkozó retrospektív vizsgálataink alátámasztják ezt a következtetést. Egy 108, elektív endovaszkuláris hasi aorta aneurizma-javulásban szenvedő beteg bevonásával végzett vizsgálatban nem volt különbség a 30-napos posztoperatív mortalitásban az NLR között.<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 beteg, 42,6% a stroke kockázata), mint azok, akiknek NLR-je van<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] NLR-csoportok).16 Az alacsonyabb preoperatív NLR-értékkel rendelkező betegek szignifikánsan nagyobb amputációmentes túlélést értek el az 4-éves követés során (alacsony NLR 65,5%, közepes NLR, 37,5% és magas NLR, 17,6 % [P < .0001]).16

Ebben a vizsgálatban RNS-szekvenálást (RNS-seq) végeztünk a neutrofilek és limfociták olyan betegekből, akik alkalmasak voltak az elektív érsebészeti (EVS) javításra, hogy meghatározzuk az emelkedett NLR lehetséges mechanizmusait. A vizsgálatok azt vizsgálták, hogy van-e molekuláris alapja az emelkedett NLR-nek. Vizsgálataink azt mutatják, hogy az emelkedett NLR-értékkel rendelkező betegek, akiknél EVS-reparációt szenvedtek, a neutrofilekben az immunglobulin és a komplement gének igen jelentős downregulációjával különböztethetők meg.

A cistanche jótékony hatású – erősíti az immunrendszert

Mód

Betegek

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 mg/dl), dohányzási állapot, sztatinkezelés, krónikus obstruktív tüdőbetegség, rák, krónikus vesebetegség, koszorúér-betegség (CAD), perifériás artériás betegség, cerebrovaszkuláris betegség és krónikus szívelégtelenség. Minden betegnek teljes vérképe volt differenciált fehérvérsejtszámmal. A betegeket alacsony NLR-re osztották (NLR_Low [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

A vér szétválasztása

A teljes vért (20 ml betegenként) 10 ml-es, EDTA-val antikoagulált vacutainer csövekben gyűjtöttük, és a vért a gyűjtést követő egy órán belül elválasztottuk. A neutrofil és limfocita sejtpopulációkat 8 ml vérből izoláltuk EasySep közvetlen emberi sejtizolációs készlettel (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) és a Big Easy EasySep mágnessel (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada) a gyártó protokollja szerint. A mágnest korábban jégen hűtötték, és a vérsejteket és a reagenseket óvatosan összekeverték a cső megfordításával a pipettázás helyett. A reagens arányokat a következő módon is beállítottuk a visszanyerés optimalizálása érdekében: 400 ml antitest keveréket, 400 ml mágneses gyöngyöt és 4 ml foszfáttal pufferolt sóoldatot adtunk a vérhez az első elválasztás előtt, majd 200 ml antitestet. keveréket és 400 ml gyöngyöt a második elválasztás előtt és 200 ml gyöngyöt a harmadik és utolsó elválasztás előtt. A végső kinyert térfogatokból egy kis, 200 ml-es alikvot részt vettünk a sejtszámláláshoz és a tárgylemez elkészítéséhez. A visszanyert térfogat fennmaradó részét percenként 1000 fordulattal centrifugáltuk 7 percig, hogy a sejtek pelletizálódjanak.

1. ábra: A neutrofilekből és limfocitákból származó RNS teljes transzkriptuma, amelyet magas (NLR_High), alacsony (NLR_Low) vagy kontroll (NLR_kontroll) betegektől gyűjtöttek össze. . Az "N" vagy "L" betűkód a minta nevében azt jelenti, hogy vagy neutrofilek, vagy limfociták voltak az RNS forrása. Minden kategóriában 6 beteg volt. Kék=csökkentett kifejezési szint; piros=magas szintű kifejezés.

Sejtszámlálás és tárgylemez előkészítés

A foszfáttal pufferolt sóoldatban újraszuszpendált sejteket további aliquot részekre osztjuk, tripánkékkel keverjük, és manuálisan megszámoljuk hemocitométer segítségével. Jellemzően 9 × 106-15 × 106 neutrofilt és 3 × 106-10 × 106 limfocitát izoláltunk mintánként. Az izolált sejtek tárgylemezeit citocentrifugával készítettük el, percenként 600 fordulattal 3 percig centrifugáltuk, majd Wright-Giemsa festéssel festettük. Az egyes sejtpopulációk tisztaságát kézi számlálással határoztuk meg, amelyben tárgylemezenként legalább 1000 sejtet különítettünk el. A neutrofil és limfocita elválasztás átlagos tisztasága sejtszámlálás szerint 98,3%, illetve 96,2% volt. Az áramlási citometriát 1 neutrofil és limfociták mintapárján végezték el, és 90,6%-os, illetve 92,2%-os tisztaságot mutattak. A neutrofil készítményben lévő többi sejtet limfocitákra (4%), monocitákra (2%), eozinofilekre (2,3%) és bazofilekre (0,3%) bontották. A limfocita preparátumban a többi sejt neutrofil (1,2%), monocita (1,4%), eozinofil (1,2%) és bazofil (1,8%) volt. Az összes egyedi mintából származó tömeges RNS-seq adatokat is felhasználtuk a sejtpreparátumok monocita szennyezettségének mértékének meghatározására, annak meghatározásával, hogy az NLR_Magas vagy NLR_alacsony mintákból származó neutrofilek vagy limfociták szignifikánsan növelték-e a CD14-et. , CD68, CD83 vagy CD163. Ettől függetlenül az RNS-seq adatokat az immun- és rákos sejtek (EPIC) arányának becsléséhez vezették be, amely program az immun- és rákos sejtek arányának becslésére szolgál a tömeges génexpressziós adatokban.17 A használt referenciaprofilt az EPIC biztosította vérben keringő immunsejtek, és tartalmazza a B-sejtek, CD4 és CD8 T-sejtek, monociták, neutrofilek és természetes gyilkos sejtek profilját. A jelentett kimenetet mintánkénti sejtfrakcióként adjuk meg.

2. ábra: Szignifikánsan eltérően expresszálódó gének neutrofilekből és limfocitákból. (A) A szignifikánsan eltérően expresszált gének száma a neutrofilekben (kék) és a limfocitákban (narancs). (B) A neutrofilekben (zöld és lila) és limfocitákban (vörös és kék) lévő, jelentősen eltérően expresszálódó gének főkomponens-elemzési diagramja NLR_Magas (körök) és NLR_Alacsony (négyzetek) értékekben. (C) Az NLR_High vs NLR_Low neutrofil RNS szignifikánsan eltérően expresszálódó gének hőtérképe. (D) Az NLR_High vs NLR_Low limfocita RNS-ből szignifikánsan eltérően expresszált gének hőtérképe.

RNS-seq és statisztikai elemzés

Az RNS extrakcióra és szekvenálásra vonatkozó részletes módszereket a kiegészítő módszerek ismertetik. A szekvenálási leolvasások minőségét értékelték, és az adaptert a TrimGalore segítségével vágták le! (Babraham Institute), a FastQC és a CutAdapt csomagoló szkriptje. A minőségellenőrzésen átmenő leolvasásokat a GRCh38 humán referenciagenomhoz igazították a STAR igazító szoftver segítségével. Az összehangolt leolvasásokat a mandzsettagombok 2.2.1-es verziójával dolgoztuk fel differenciális expressziós analízishez, a GRCh38 GENCODE génannotációjával, és a génszintű expressziós adatokat kilobázis-átiratonkénti fragmensekben, millió leolvasott leolvasásban jelentették. felfedezési sebesség cutoff P értéke<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Eredmények

A páciens jellemzői

Hat pár betegmintát választottunk ki a 7 NLR_magas és 9 NLR_alacsony NLR-ből, a pár RNS-ének legmagasabb minősége alapján, amelyet az RIN integritási szám (RIN) alapján határoztunk meg (1. táblázat). ). 8 egészséges donorból származó hat kontrollt is megvizsgáltak. A vizsgálatba bevont betegeknél az NLR_Magas NLR átlagos ± standard eltérése 4,37 ± 0,66 volt, szemben az NLR_alacsony, 1,87 ± 0 értékkel. 39 (P < .0001). A betegek életkorának átlagos ± standard deviációja 61,0 ± 17,0 év volt az NLR_Magas és 64,5 ± 7,5 év az NLR_Low (P= 0,68) esetén. 1 kivételével mindegyik beteg aorta aneurizma betegségben szenvedett, 9 beteg mellkasi/thoracoabdominalis, 2 pedig hasi betegségben szenvedett. Mindkét hasi aorta aneurizmában szenvedő beteg az NLR_alacsony csoportba tartozott. A 12 beteg közül 11-nek volt magas vérnyomása. Mindkét NLR_Magas vagy NLR_Alacsony NLR{36}}csoportban 6 betegből négynél szerepelt lipid-rendellenesség. Az NLR_Magas és 3 beteg az NLR_Low csoportból korábban dohányzott. Az NLR{40}}Low csoport egyik betege aktív dohányos volt. Az NLR_Magas és 4 az NLR_Low csoportból öt beteg kapott sztatinokat. Mindkét csoportban csak 3 beteg volt cukorbeteg. Mindegyik csoportból egy betegnek volt CAD-ja, az NLR{46}}Low csoportból pedig 2 betegnek perifériás artériás betegsége volt.

3. ábra: Az RNA-seq adatokat ebben a vizsgálatban független módszerként használtuk a neutrofil és limfocita preparátumok egyéb sejtszennyezésének meghatározására. Csak a neutrofilek adatai láthatók. EPIC analízist végeztünk az immun- és rákos sejtek arányának becslésére a tömeges génexpressziós adatokban. Ez az elemzés megadta a neutrofilek, monociták, B-sejtek, CD4 T-sejtek, CD8 T-sejtek, természetes gyilkos (NK) sejtek és más sejtek százalékos arányát a neutrofil készítményben.

Az egész átirat

Globális különbségeket figyeltünk meg a teljes transzkriptomban a neutrofilek és limfociták közötti génexpressziós profilok összehasonlításakor (1. ábra). Ez a megállapítás nem volt meglepő, mivel a sejttípus-specifikus génexpressziót korábban másként jellemezték.19 A neutrofil szekcióban az NLR_Magas, NLR_Alacsony és NLR{{ 4}}Kontrollcsoportok, sok olyan gén volt felszabályozott, amely egyértelműen nem volt szabályozva a limfocita szakaszban, és fordítva. A teljes transzkriptom szintjén a neutrofilek és a limfociták közötti sejtspecifikus különbségek egyértelműek és dominánsak voltak, függetlenül az NLR-től, illetve attól, hogy beteg vagy kontroll volt. Közelebbről megvizsgálva azonban különbségek kezdtek megjelenni. A főkomponens-elemzési diagram azt mutatta, hogy a neutrofilek és limfociták NLR_kontrollja mindkét sejtben átfedésben volt az NLR_magas és NLR_alacsony értékkel (1. kiegészítő ábra). A vizsgálatok ezt követően további különbségeket kerestek az NLR{10}}Magas és NLR_alacsony csoportok között a szignifikánsan eltérően expresszálódó génekben. Megfigyelték, hogy 900 (74,5%) szignifikánsan eltérő expressziójú gént figyeltek meg a neutrofilekben az NLR_Magas vs. NLR_alacsony csoportokban (2A. ábra). Összehasonlításképpen, a limfociták csak 190 (15,7%) szignifikánsan eltérően expresszálódó gént tartalmaztak. Az NLR_Magas gének és NLR_Alacsony gének a neutrofilekben és a limfociták főkomponens-elemzési diagramja feltárta, hogy az NLR_Magas vs NLR_Alacsony gének csoportja a neutrofilek 2 külön területre szegregálódtak, míg az NLR_High és NLR_Low limfocita gének átfedték egymást (2B. ábra). A teljes átírási adatokhoz hasonlóan az NLR_kontroll átfedésben volt az NRL_High és NLR_alacsony szignifikánsan eltérő expressziójú génekkel mind a neutrofilekben, mind a limfocitákban (2. kiegészítő ábra). A legtöbb szignifikánsan eltérően expresszálódó gén az NLR_High of neutrofilben az NLR_Low-tól lefelé szabályozott (2C. ábra). Hasonló, de sokkal kisebb számú gén volt leszabályozva az NLR{36}}nagy limfocitákban, mint a neutrofilekben (2D. ábra). Ezek az adatok azt sugallják, hogy az NLR szintek leginkább a neutrofilek megváltozott génexpressziójához kapcsolódnak. Ezenkívül össze kellett hasonlítani az NLR_Low betegségcsoportjába tartozó betegekkel, nem NLR-Control, mert az előbbi csoport egyértelműen elkülönült az NLR_Magas, de nem NLR_kontrolltól ( 2B ábra; kiegészítő 2. ábra).

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

A gének differenciális expressziójának és a génkészlet gazdagodásának vizsgálata előtt további vizsgálatok jellemezték a neutrofil készítmény monocita szennyezettségének mértékét. Az RNS-seq adatok felhasználásával megfigyeltük, hogy a CD14, CD68, CD83 és CD163 monocita markerek expressziója NLR_Magas vs NLR_alacsony neutrofil- vagy limfocitakészítményekben nem különbözik szignifikánsan. A neutrofil RNS-seq adatok EPIC analízise azt mutatta, hogy a nem immunsejtek ("egyéb sejtek") és a CD4 T-sejtek voltak a fő szennyezők a neutrofil készítményekben (3. ábra). Az NLR{{10}}alacsony CD4 T-sejtek és B-sejtek kivételével a többi szennyező sejt egyike sem különbözött szignifikánsan az NLR_alacsony neutrofil és az NLR_magas neutrofilek között . A neutrofil készítményben az EPIC analízis alapján a monocita szennyeződés csak 0,17% ± 0.05% az NLR-re_Alacsony vs 0,1% ± 0,033% az NLR_Nagy előkészületek (P=.12). Ez az érték azt jelzi, hogy a monocita szennyeződés egy nagyságrenddel alacsonyabb volt, ha RNS-seq adatelemzéssel határozták meg az áramlási citometriához képest.

4. ábra: A biológiai folyamatok szignifikánsan kifejezett GO génkészlet-kategóriáinak szórási buborékdiagramja NLR_Magas és NLR_Alacsony között. A k:K arány az abszcisszán azon gének száma, amelyek szignifikánsan eltérően expresszálódnak (k) a kategória összes gének számához képest (K). Az ordináta a dúsulás logaritmusban kifejezett jelentősége (P érték). (A) A GO génkészletek a neutrofil RNS-seq-ből származnak, összehasonlítva az NLR_Magas és az NLR_Low értékeket. (B) GO génkészletek, amelyek a limfocita RNS-seq. Mindkét tábla bal alsó sarkában található génkészletek a legkevésbé jelentősek. Mindkét tábla jobb felső sarkában található génkészletek a legjelentősebbek.

4. ábra (folytatás)

A differenciálisan expresszálódó gének természetének vizsgálata érdekében GSEA-t végeztünk a génontológia (GO) kategóriáival a biológiai folyamatokhoz, az NLR_Magas és NLR_Low közötti jelentősen eltérően expresszálódó génkészletek felhasználásával. Az eredményeket a szórási buborék diagramok mutatják (4. ábra). A génkészletek szegregációja az egyes parcellák jobb felső sarkában azt mutatja, hogy (1) a génkészletekben lévő gének nagy százaléka szignifikánsan megváltozott, és (2) nagy jelentőségűek a génkészlet gazdagodása szempontjából. Mintánkban a szórási buborék diagramok mind a komplement, mind a humorális válasz GO kategóriák feldúsulását mutatták függetlenül mind a neutrofilek, mind a limfociták esetében. A neutrofilekben a komplement aktiváció, a fehérjeaktivációs kaszkád szabályozása és a keringő immunglobulin által közvetített humorális immunválasz klasszikus útvonalának génkészletei voltak a legjelentősebbek, a génkészlet tagjainak legnagyobb százaléka szignifikánsan megváltozott (4A ábra). Ettől függetlenül a limfocitákban található azonos génkészletekben is megfigyelték, hogy a neutrofil vizsgálatokhoz hasonlóan jelentős mértékben megváltozott gének aránya és bizonyos fokú szignifikancia (4B. ábra).

2. táblázat Immunológiai génkészletek neutrofilekben és limfocitákban

A 2. táblázat felsorolja a legjelentősebben megváltozott immunológiai génkészleteket a neutrofilekben (2. táblázat, A panel) és a limfocitákban (2. táblázat, B panel). Ez a tanulmány összehasonlította a génexpressziót a neutrofilekben vagy limfocitákban az NLR_magas minták és az NLR_alacsony minták között. Az egészséges NLR_kontrollmintákat nem hasonlítottuk össze, mivel expressziós szintjük átfedésben volt az NLR_Magas és NLR_Alacsony betegmintákkal mind a teljes transzkriptomban, mind a szignifikánsan eltérően expresszált génkészletekben. Ezenkívül az egészséges NLR{8}}kontrollminták életkora, betegsége és műtéti állapota nem egyezik (1. és 2. kiegészítő ábra). Mind a neutrofilekben (2. táblázat), mind a limfocitákban (2. táblázat) az adatok azt mutatták, hogy az immunrendszerrel kapcsolatos génkészletek expressziója nagyon szignifikánsan különbözött, amikor az NLR_Magas és az NLR_Low értéket hasonlították össze. . Az RNS-seq-en minden sejttípus ugyanazokkal a megállapításokkal rendelkezik, mint a többi sejttípus. Mindkét panelen a főbb génkészletek szignifikanciaszintje P < 1E-24 értéknél maximalizálódott. Ezek az adatok rendkívül szignifikánsak voltak, függetlenül attól, hogy a neutrofilt vagy a limfocitát vizsgálták-e. Ennek az RNS-seq vizsgálatnak a rendkívül jelentős tartalmi területére összpontosítva a szignifikánsan eltérően expresszált immunglobulin génexpressziót vizsgáltuk. Először is, a neutrofil gének főkomponens-elemzési görbéje azt mutatta, hogy az NLR_High vs NLR_Low esetén a szignifikánsan eltérően expresszálódó immunglobulin gének 2 csoportra oszlanak (kiegészítő 3A ábra). Alternatív megoldásként az NLR_High vs NLR_Low limfocita génjei átlapolva (kiegészítő 3A. ábra). Ezt követően az immunrendszerrel kapcsolatos génexpresszió kombinált hőtérképét az NLR_High és az NLR_Low között összehasonlították neutrofilekben és limfocitákban (5. ábra). Összességében, ha a teljes hőtérképet megvizsgáljuk, nyilvánvaló, hogy a neutrofil NLR_Magas csoportban az immunglobulin gének teljes géncsaládja csökken az NLR_Low csoporthoz képest. A legtöbb gén (69/156, 44%) immunglobulin-rokon volt. A 156 gén közül csak 12 (7,7%) kapcsolódott komplementhez: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD és CD59. A limfociták csoportjában az NLR{50}}magas kategóriába tartozó, főként immunglobulin gének leszabályozása is megfigyelhető volt.

A neutrofilekben és limfocitákban található komplement génkészleteket a 3. táblázat részletezi. Mind a neutrofilekben (3. táblázat), mind a limfocitákban (3. táblázat) a gének expressziója a komplementrendszerhez kapcsolódó 3 génkészletben nagyon szignifikánsan különbözött (P < 1E{{ 5}}), amikor az NLR_magas mintákat NLR_alacsony mintákkal hasonlították össze. Ez a megfigyelés ugyanaz volt, függetlenül attól, hogy a neutrofilekből vagy limfocitákból származó RNS-t hasonlították össze. A 3 génkészlet magában foglalja a komplement aktivációt, a klasszikus komplement aktiválási útvonalat és a komplement aktiváció szabályozását. A neutrofil gének főkomponens-elemzési görbéje ismét azt mutatta, hogy az NLR_High vs NLR_Low esetén a szignifikánsan eltérően expresszálódó komplement gének 2 csoportra különültek el (kiegészítő 3B ábra). Alternatív megoldásként az NLR_High vs NLR_Low limfocita génjei átfednek (kiegészítő 3B. ábra).

5. ábra: A neutrofilekben (balra) és a limfocitákban (jobbra) lévő immunglobulin génkészletben lévő szignifikánsan eltérően expresszált gének hőtérképe. Az egyes hőtérképek jobb oldalán felsorolt ​​gének az immunglobulin tagjai

A 6. ábrán látható egy komplementtel kapcsolatos génkészlet neutrofilek és limfocita expressziójának hőtérképe, amely összehasonlítja az NLR_High és az NLR_Low értékeket. A neutrofilekben hatalmas számú gén leszabályozott a NLR_Magas népesség. Ebben a génkészletben, hasonlóan az immunglobulin génkészletekhez, a legtöbb gén (69/ 86, 80%) immunglobulin-rokon volt. A 86 közül csak 12 (14%) volt komplementkomponens és szabályozó gén (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH és CFD). A limfocita-csoportban összességében kevesebb volt a komplement gének expressziója, az immunglobulin gének pedig valamivel alárendeltebbek voltak az NLR_High csoportban. Mivel a komplementrendszer génjeit jobban ismerik, mint az immunglobulinrendszerek génjeit, a figyelem a komplementrendszerre összpontosult, mint a magas és alacsony NLR-hez kapcsolódó célgének potenciális jelöltjeként. Összetett hőtérképet készítettünk az NLR_High és az NLR_Low összehasonlításáról, amely a komplementrendszer és a kapcsolódó gének expresszióját mutatja mind neutrofil, mind limfocita mintákban (7. ábra). A limfocita többnyire nem a komplementrendszer tárolósejtrendszere. A legtöbb komplement gén nincs szabályozva a limfocitákban. Csak a C1S, CR2, C5, C8G, C5 és CFB volt jelen, és az NLR_magas és NLR_alacsony limfociták expressziója különbözött (7. ábra). A limfocitákban lévő CD81 egy B-sejt-tetraspanin. Úgy tűnik, hogy a C1S és C8G expressziója szignifikánsan magasabb a limfocita NLR_magas, mint a limfocita NLR_alacsony, hasonlóan a KLKB1-hez, a plazma prekallikrein génjéhez.

Ezzel szemben a neutrofilekben az NLR{0}}High a C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 és C3AR1 komplementkomponens gének, valamint a CD59, CFB és CFI komplement szabályozó (gátló) génjeik leszabályozását mutatta. . Csak a C2- és a CFD-gének voltak felfelé szabályozva az NLR_Magas_N betegekben. A CD59 és C9 szintje viszonylag felfelé szabályozott a neutrofil NLR_Alacsony_N-ben az NLR_Magas_N-hez képest. Az FGFR4 egy növekedési faktor receptor. A CFH jelen volt, de úgy tűnt, hogy nem befolyásolta a neutrofil NLR_magas vagy NLR_alacsony. Nagyobb mértékben expresszálódik a limfocitákban.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Vita

A differenciális leukocitaszám NLR-je széles körben használt, egyszerű markerré vált a lehetséges káros kimenetelek felismerésére számos rendellenességben, beleértve a CVD-t, a szolid tumorokat és a gyulladásos rendellenességeket, például a szisztémás lupus erythematosust és a szisztémás szklerózist. Saját, atheroscleroticus CVD-ben szenvedő betegeken végzett retrospektív vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a magas NLR-ben szenvedő betegeknél magasabb a késői halálozási arány az elektív aorta aneurizma helyreállítása után, magasabb a késői stroke/halálozás aránya profilaktikus carotis endarterectomia után, és csökkent az amputációmentes túlélés. elektív femoralis-poplitealis revaszkularizáció, ha NLR-jük megemelkedett.{1}} Jelen vizsgálatainkat a magas NLR mechanikai alapjainak felkutatására indítottuk. limfóma, többszörös szolid daganatok és gyulladásos rendellenességek, mint például a szisztémás lupus erythematosus és a szisztémás szklerózis. Saját, atheroscleroticus CVD-ben szenvedő betegeken végzett retrospektív vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a magas NLR-ben szenvedő betegeknél magasabb a késői halálozási arány az elektív aorta aneurizma helyreállítása után, magasabb a késői stroke/halálozás aránya profilaktikus carotis endarterectomia után, és csökkent az amputációmentes túlélés. elektív femoralis-poplitealis revaszkularizáció, ha NLR-jük megemelkedett.{3}} Jelen vizsgálatainkat a magas NLR mechanikai alapjainak felkutatására indítottuk.

3. táblázat: Komplement génkészletek neutrofilekben és limfocitákban

Annak érdekében, hogy elfogulatlan megközelítést dolgozzunk ki az NLR CV kimenetelekre gyakorolt ​​eltérő hatásainak mechanizmusával kapcsolatban, RNS-seq-vizsgálatot végeztünk ugyanazon betegek neutrofiljein és limfocitáin. Ehhez a vizsgálathoz minden aortabetegségben szenvedő beteget prospektívan összegyűjtöttek és eredményeik alapján NLR kategóriákba csoportosítottak. Az utolsó 6 mintát mind a két sejttípusból a párosított neutrofil és limfocita minták elkészített RNS-ében a legmagasabb RIN-szint alapján választottuk ki, tekintet nélkül nemre, korra vagy korábbi egészségügyi állapotokra. Amint az 1. táblázatból látható, az NLR_Magas és NLR_Alacsony NLR-csoportba tartozó betegek meglehetősen hasonlóak voltak, és csak az NLR-ük alapján különböztek egymástól.

Az ebben a vizsgálatban használt RNS minőségét a RIN és a génexpresszió mintázatának teljes elkülönülése mutatja a neutrofilek és limfociták között minden begyűjtött betegcsoportban (magas NLR, alacsony NLR és kontrollok) (1. ábra). A főkomponens-elemzési diagram azt mutatja, hogy az NLR_kontrolladatok nem voltak relevánsak ebben a vizsgálatban, mivel a betegek NLR-értéke átfedésben volt az NLR_Magas és NLR_alacsony a betegek neutrofil- és limfocitapopulációjában . A GSEA analízis nagyszerű betekintést nyújtott arra vonatkozóan, hogy mely génkészletek gazdagodtak fel a biológiai folyamatok GO génkészleteiben, és a szórásbuborék diagram ezt egyértelműen demonstrálta a log szignifikancia és a megváltozott gének számának az összes gének számához viszonyított arányának ábrázolásával. a génkészletekben. Az áttekintés során a teljes listától elkülönülő génkészletek a humorális (immunglobulin) immunitásban és komplementrendszerben találhatók (2. és 3. táblázat), az arány és a statisztikai szignifikancia alapján, elfogulatlan felfedezési megközelítésben.

A humorális immunitás immunglobulin génjeinek nagy számával nehéz dolgozni, mivel ezek a gének közötti lényeges különbségek nem jól ismertek. Alternatív megoldásként sokkal többet tudunk a komplementrendszerről, és az immunglobulinok által aktivált klasszikus komplementrendszerre való összpontosítás az immunglobulinokkal kapcsolatos gyulladások és betegségek felismerhető célpontja. Adataink arra utalnak, hogy a klasszikus komplementkomponens gének C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9, valamint számos szabályozó gén (CD59, CFB CFI és CFH) a betegek neutrofiljeiben lefelé szabályozottak. magas NLR-rel (7. ábra). Ezek az eredmények 3 okból meglepőek. Először is, az érintett gének többnyire a klasszikus komplementútvonalhoz tartoznak. Másodszor, a magas NLR-betegeknél ezek a komplement gének többnyire alárendeltek az alacsony NLR-betegekéhez képest. Végül több F12 expresszálódik az NLR_magas neutrofilekben, mint az NLR_alacsony mintákból származó neutrofilekben. Az F12 fehérjetermékének enzimatikus formái (XII. faktor [FXII]) aktiválják a komplement és a neutrofilek klasszikus útvonalát.20 Ezzel szemben a PLG, a plazminogén génje és az FXII aktivátora leszabályozott az NLR-en belüli betegek limfocitáiban és neutrofiljeiben. {21}}Magas, ami arra utal, hogy maga az FXII-aktiváció a komplement aktiválásának szabályozója lehet.

Ezenkívül kimutatták, hogy a klasszikus komplementrendszer szerepet játszik a felgyorsult CVD-ben. Az 1q komplement komponens (C1q) a komplementpálya kezdeti faktora, amely fontos szerepet játszik mind a veleszületett, mind a szerzett immunrendszerben.21 A C1q kettős szerepe, pozitív és negatív hatása is kimutatható az atherosclerosisra.22 A klasszikus A komplement útvonala, a C1q védő szerepet játszik a korai stádiumú ateroszklerózisban azáltal, hogy a makrofágok molekuláris jeleit egy komplementtől független úton szabályozza, modulálja az aterogén lipoprotein felvételét, közvetíti az apoptotikus sejteket és a sejttörmelék eliminációját.23,24 Jia legújabb tanulmánya. és munkatársai23 azt jelzi, hogy a csökkent szérum-C1q összefüggésben áll a CAD-vel. Guo és munkatársai egy másik tanulmánya24 azt jelzi, hogy a megnövekedett C1q aktivitás összefüggésben áll a CAD-vel. Végül a legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a csökkent C1q-vel rendelkező cukorbetegek túlélése lerövidült.25 Ezek az adatok azt mutatják, hogy a komplementrendszer vizsgálata fontos lehet a CVD gyulladás által közvetített patogenezisének megértésében.

6. ábra: A neutrofilekben (balra) és a limfocitákban (jobbra) található komplement génkészlet szignifikánsan eltérően expresszált gének hőtérképe. Az egyes hőtérképek jobb oldalán felsorolt ​​gének a komplement génkészlet tagjai. Az RNS magas (NLR_High) vagy alacsony (NLR_Low) NLR-s betegektől gyűjtött neutrofilekből vagy limfocitákból származik. Az NLR_High-ből hat egyedi mintát hasonlítanak össze az NLR_Low 6 egyedi mintájával mind a neutrofilekből, mind a limfocitákból.

7. ábra: A komplement és a kapcsolódó gének összetett hőtérképe neutrofil vagy limfocita NLR_Magas vagy NLR_Alacsony. Minden kategóriában az összetett hőtérképet minden sejttípusból 6 egyedi RNS-seq mintából készítettük el.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Bár a lipidcsökkentő hatás nem volt hatással az NLR-re, a kanakinumabbal, az interleukin 1 inhibitorral végzett gyulladáscsökkentő terápia csökkentette az NLR-t (P < 0,0001).26 Ezek az adatok arra utalnak, hogy az NLR a CVD markere lehet, függetlenül a lipidektől és a a sztatinok hatása. Ez a több prospektív randomizált vizsgálat ad hoc elemzése arra utal, hogy az NLR független kockázati tényező lehet a szív- és érrendszeri betegségek mortalitásában.

Ebben a tanulmányban van néhány korlátozás. Neutrophil preparátumaink áramlási citometriával 4% limfocita és 2% monocita szennyeződést mutattak. Mivel a neutrofilekről nem ismert, hogy szintetizálják az immunglobulint, a neutrofil immunglobin génváltozásai a B-sejtek szennyeződéséből származhatnak. Az EPIC analízis alapján az NLR-Low minták B-sejtes szennyezettsége szignifikáns növekedést mutatott. Ez a megfigyelés arra utal, hogy az NLR_alacsony neutrofil mintákban az immunglobulin gének szintjének növekedése a B-sejt szennyeződésből eredhet. Így a csökkent immunglobulin gének az NLR_magas mintákban a megnövekedett B-sejteknek köszönhetőek az NLR_alacsony mintákban, és nem feltétlenül csökkent immunglobulin génszintek az NLR_magas mintákban. Hasonlóképpen, a neutrofilekről nem ismert, hogy komplementtermelő sejtek. A monocitákkal való két százalékos szennyeződés lehet a komplement gének forrása. Az RNS-seq adatok felhasználásával azonban azt tapasztaltuk, hogy nincs szignifikáns különbség a neutrofil preparátumok monocita szennyezettségében az NLR_Low és NLR_High között. Továbbá az RNS-seq adatok EPIC analízise azt mutatja, hogy monocita szennyeződés volt<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Összegezve, ennek a vizsgálatnak a kardinális megállapítása az, hogy magas NLR-állapotokban sok komplementkomponens gén és egyes szabályozóik leszabályozva vannak a neutrofilekben. Nem világos az azonosított, leszabályozott komplement gének általános jelentése és aktiválási állapota. Mivel a komplement génkészletek feltűnően lecsökkentek, feltételezzük, hogy a magas és rövidebb posztoperatív túlélési idővel rendelkező egyéneknél a komplementrendszerek által biztosított fő CV-védő mechanizmusok elvesznek. Ezt az értékelést a klinikai vizsgálatok során prospektívan meg kell vizsgálni az eredmény mögött meghúzódó mechanizmus(ok) tekintetében.

Hivatkozások

1. Ross R. Érelmeszesedés – gyulladásos betegség. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Getz GS. Tematikus áttekintéssorozat: az immunrendszer és az atherogenezis. Az immunrendszer működése az atherogenezisben. J Lipid Res. 2005;46(1):1-10.

3. Hansson GK, Hermansson A. Az immunrendszer atherosclerosisban. Nat Immunol. 2011;12(3):204-212.

4. Duffy BK, Gurm HS, Rajagopal V, Gupta R, Ellis SG, Bhatt DL. A megemelkedett neutrofil/limfocita arány hasznossága a perkután koszorúér beavatkozás utáni hosszú távú mortalitás előrejelzésében. J Cardiol vagyok. 2006;97(7):993-996.

5. Tamhane UU, Aneja S, Montgomery D, Rogers EK, Eagle KA, Gurm HS. Kapcsolat a felvételi neutrofil-limfociták aránya és az akut koszorúér-szindrómában szenvedő betegek kimenetele között. J Cardiol vagyok. 2008;102(6):653-657.

6. Gibson PH, Croal BL, Cuthbertson BH, et al. Preoperatív neutrofil-limfocita arány és a koszorúér bypass graft eredménye. Am Heart J. 2007;154(5):995-1002.

7. Fici F, Celik T, Balta S et al. A nebivolol és a metoprolol összehasonlító hatása a vörösvértest-eloszlás szélességére és a neutrofil/limfocita arányra újonnan diagnosztizált esszenciális hipertóniában szenvedő betegeknél. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(4):388-393.

8. Karaman M, Balta S, Ay SA és munkatársai. A valzartán és az amlodipin összehasonlító hatása a vWf-szintre és az N/L arányra újonnan diagnosztizált hipertóniában szenvedő betegeknél. Clin Exp hipertónia. 2013;35(7):516-522.

9. Uthamalingam S, Patvardhan EA, Subramanian S és mtsai. A neutrofil/limfocita arány hasznossága az akut dekompenzált szívelégtelenség hosszú távú kimenetelének előrejelzésében. J Cardiol vagyok. 2011;107(3):433-438.

10. Bhat TM, Afari ME, Garcia LA. A neutrofil limfociták aránya perifériás érbetegségben: áttekintés. Szakértő Rev Cardiovasc Ther. 2016;14(7):871-875.

11. Bhutta H, Agha R, Wong J, Tang TY, Wilson YG, Walsh SR. A neutrofil-limfocita arány előrejelzi a középtávú túlélést az elektív nagy érműtét után: keresztmetszeti vizsgálat. Vasc Endovasc Surg. 2011;45(3):227-231.

12. Appleton ND, Bailey DM, Morris-Stiff G, Lewis MH. A neutrofil/limfocita arány előrejelzi a perioperatív mortalitást a hasi aorta aneurizmák nyílt elektív helyreállítását követően. Vasc Endovasc Surg. 2014;48(4):311-316.

13. Bath J, Smith JB, Kruse RL, Vogel TR. A neutrofil-limfocita arány előrejelzi a betegség súlyosságát és kimenetelét az alsó végtagi eljárások után. J Vasc Surg. 2020;72(2):622-631.

14. King AH, Schmaier AH, Harth KC, et al. Az emelkedett neutrofil-limfocita arány előrejelzi a mortalitást az endovaszkuláris aneurizma elektív javítását követően. J Vasc Surg. 2020;72(1):129-137.

15. King AH, Kim AH, Kwan S és mások. A tünetmentes betegek carotis endarterectomiája után a megemelkedett neutrofil/limfocita arány rosszabb kimenetelekkel jár. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2021;30(12):106120.

16. King AH, Kwan S, Schmaier AH és társai. A megemelkedett neutrofil/limfocita arány a femoropoplitealis perkután revascularisatio utáni amputációmentes túlélés csökkenésével jár. Int Angiol. 2021;40(5):442-449.

17. Racle J, de Jonge K, Baumgaertner P, Speiser DE, Gfeller D. Rák- és immunsejttípusok szimultán felsorolása tömeges tumorgénexpressziós adatokból. Elife. 2017;6:e26476.

18. Trapnell C, Roberts A, Goff L és munkatársai. RNS-seq kísérletek differenciális gén- és transzkriptum expressziós elemzése TopHat és Cufflinks segítségével. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578.

19. Palmer C, Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. A leukociták sejttípus-specifikus génexpressziós profilja az emberi perifériás vérben. BMC Genomics. 2006;7:115.

20. Stavrou EX, Fang C, Bane KL és mtsai. A XII faktor és az uPAR fokozza a neutrofilek működését, hogy befolyásolja a sebgyógyulást. J Clin Invest. 2018; 128(3): 944-959.

21. Dunkelberger JR, Dal VB. A komplement és szerepe a veleszületett és adaptív immunválaszokban. Cell Res. 2010;20(1):34-50.

22. Speidl WS, Kastl SP, Huber K, Wojta J. Komplement az atherosclerosisban: barát vagy ellenség? J Thromb Haemost. 2011;9(3):428-440.

23. Jia Y, Wen W, Yang Y és társai. A kombinált szérum C1q és hsCRP klinikai szerepe a koszorúér-betegség előrejelzésében. Clin Biochem. 2021;93:50-58.

24. Guo S, Mao X, Li X, Ouyang H, Gao Y, Ming L. A szérum komplement C1q aktivitása az obstruktív koszorúér-betegséghez kapcsolódik. Front Cardiovasc Med. 2021;8:618173.

25. Cavusoglu E, Kassotis JT, Anwar A et al. A C1q komplement hasznossága a koszorúér angiográfiára utalt diabetes mellitusban szenvedő férfiak 10-évi halálozásának előrejelzésében. J Cardiol vagyok. 2018;122(1):33-38.

26. Adamstein NH, MacFadyen JG, Rose LM és munkatársai. A neutrofil-limfocita arány és az incidens ateroszklerotikus események: öt korabeli randomizált vizsgálat elemzése. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.